DB23T 3169-2022大豆根瘤菌競(jìng)爭(zhēng)結(jié)瘤能力與固氮效果評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)程

黑DB23龍江省地方標(biāo)準(zhǔn)DBT022黑龍江省市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)布前言T請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。起草單位：黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料與環(huán)境資源研究所。大豆根瘤菌競(jìng)爭(zhēng)結(jié)瘤能力與固氮效果評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)程用于外源接種大豆根瘤菌的效果評(píng)價(jià)。范性引用文件，GBT19495.2轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)要求GBT19495.3-2004轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)核酸提取純化方法NY/T2066-2011微生物肥料生產(chǎn)菌株的鑒別聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)法定義特定根瘤菌株接種豆科植物與土著根瘤菌競(jìng)爭(zhēng)結(jié)瘤,在競(jìng)爭(zhēng)中特定根瘤菌結(jié)瘤數(shù)占總瘤數(shù)的百力活性和植株全氮含量來(lái)評(píng)價(jià)。結(jié)瘤能力評(píng)價(jià)4.1一般要求全GBT。4.2原理利用BOX-PCR指紋圖譜比較，檢測(cè)接種根瘤菌菌株的占瘤率，以此評(píng)價(jià)供試菌株相對(duì)于土著根瘤菌.3主要材料與用具鐵鍬、小鏟、鑷子、記號(hào)筆、塑料袋、剪刀、冰盒、小型離心機(jī)、微量可調(diào)移液器及對(duì)應(yīng)的無(wú)菌4.4占瘤率測(cè)定方法4.4.1蛭石盆栽實(shí)驗(yàn)中根瘤菌占瘤率的測(cè)定a子的處理n水洗3次后置于1%水瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)，待其萌芽后種植于滅菌的蛭石中，進(jìn)行蛭石盆栽培養(yǎng)，每盆3粒~4粒大豆種子。b根瘤菌接種菌生理鹽水的大豆為陰性對(duì)照。c菌體蛭石盆栽培養(yǎng)45d后收獲根瘤，每個(gè)盆中隨機(jī)挑取3個(gè)~5個(gè)根瘤，分別用75%乙醇消毒1min、15%DNA在上述收獲的類菌體中加入10μL無(wú)菌水充分懸浮類菌體，混勻后于沸水中煮沸5min，然后迅速ARA4中的規(guī)定執(zhí)行，BOX-PCR擴(kuò)增體系及擴(kuò)增反應(yīng)程序見附錄B。FPCRNYT11中5.6和6.2規(guī)定的方法進(jìn)行檢測(cè)與判定。4.4.2土壤盆栽試驗(yàn)中根瘤菌占瘤率的測(cè)定消毒，無(wú)菌水清洗后，按照上述方法進(jìn)行BOX-PCR擴(kuò)增及圖譜分析。4.4.3結(jié)果分析對(duì)比分離根瘤菌與接種菌種的BOX-PCR指紋圖譜，達(dá)到100%相似水平時(shí)即可定位同一類BOX圖譜類效果評(píng)價(jià).1材料與工具.2固氮酶活性測(cè)定立即用異丁基膠塞密封，然后按瓶子中氣相體積用注射器從瓶中抽空5%~10%的空氣，再用注射器注入酶活性。計(jì)算公式如下： U=Unmolmg/h；m——根瘤鮮重mg；5.3全氮含量測(cè)定m(V3V)1000Wg/kg；c液的濃度0.01moL/L；V滴定消耗標(biāo)準(zhǔn)液量mL；V滴定消耗標(biāo)準(zhǔn)液量mL；V試液量10mL；m——樣品質(zhì)量g；V0mL；——氮的毫摩爾質(zhì)量g/mmoL。(規(guī)范性)方NaCl0.1g；0.25%溴麝香草酚藍(lán)(僅在從根瘤中分離根瘤菌時(shí)選擇性的加入)，1mL；瓊脂，15g~18g；蒸餾水，1000mL；pH值，6.8~7.0。(規(guī)范性)TACGGCAAGGCGACGCTGACGB.2擴(kuò)增體系為25.0μLdNTPmmolLLDMSO2.5μL；BOX