發(fā)酵工程制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)

發(fā)酵工程制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)第1頁/共25頁2023/3/82概述微生物菌種的選育與保藏微生物的培養(yǎng)發(fā)酵過程的控制第六章微生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)L-異亮氨酸生產(chǎn)工藝維生素C生產(chǎn)工藝思考題第2頁/共25頁2023/3/83微生物發(fā)酵制藥概述發(fā)酵工程制藥的基本過程第3頁/共25頁2023/3/84

抗生素的發(fā)現(xiàn)1928年，英國細(xì)菌學(xué)家FlemingB發(fā)現(xiàn)抗菌物質(zhì)青霉素。在20世紀(jì)40年代，一共發(fā)現(xiàn)了14種抗生素，50年代發(fā)現(xiàn)了20余種，年代開始了化學(xué)結(jié)構(gòu)改造的合成和半合成抗生素階段。目前發(fā)現(xiàn)并分離到約9000種抗生素，半合成抗生素約1000種，共萬種以上。但實際生產(chǎn)和應(yīng)用的只有100余種。微生物發(fā)酵制藥第4頁/共25頁2023/3/85發(fā)酵制藥種類

微生物菌體發(fā)酵、微生物酶發(fā)酵、微生物代謝產(chǎn)物、發(fā)酵微生物轉(zhuǎn)化發(fā)酵。微生物發(fā)酵制藥第5頁/共25頁2023/3/86制藥微生物的種類

生產(chǎn)藥物的天然微生物主要包括細(xì)菌、放線菌和絲狀真菌三大類。細(xì)菌主要生產(chǎn)環(huán)狀或鏈狀多肽類抗生素，如芽孢桿菌(Bacillus)產(chǎn)生桿菌肽（bacitracin），細(xì)菌還可以產(chǎn)生氨基酸和維生素，如黃色短桿菌（Brevibacteriumflarum）產(chǎn)生谷氨酸，大小菌生產(chǎn)維生素C。

放線菌主要產(chǎn)生各類抗生素，以鏈霉菌屬最多。生產(chǎn)的抗生素主要有氨基糖苷類、四環(huán)類、放線菌素類、大環(huán)內(nèi)酯類和多烯大環(huán)內(nèi)酯類。

真菌的曲菌屬產(chǎn)生桔霉素，青霉素菌屬產(chǎn)生青霉素和灰黃霉素等，頭孢菌屬產(chǎn)生頭孢霉素等。微生物發(fā)酵制藥第6頁/共25頁2023/3/87發(fā)酵制藥的基本過程

發(fā)酵制藥就是利用制藥微生物，通過發(fā)酵培養(yǎng)，在一定條件下，生長繁殖，同時在代謝過程中產(chǎn)生藥物，然后，從發(fā)酵液中提取分離、純化精制，獲得藥品。菌株選育（mutationandselectionbreeding）、發(fā)酵(fermentation)和提煉(isolationandpurification)是發(fā)酵制藥的三個主要工段。工藝過程包括發(fā)酵和分離純化兩個階段。

發(fā)酵階段包括生產(chǎn)菌、孢子制備、種子制備、發(fā)酵培養(yǎng)，是生物加工工程過程。

分離純化階段包括發(fā)酵液處理與過濾、分離提取、精制、成品檢驗、包裝、出廠檢驗，是化學(xué)分離工程過程。

成品檢驗：包括性狀及鑒別試驗、安全試驗、降壓試驗、熱源試驗、無菌試驗、酸堿度試驗、效價測定、水分測定等。

成品包裝：合格成品進(jìn)行包裝，為原料藥。制劑由制劑車間或廠再分裝。微生物發(fā)酵制藥第7頁/共25頁2023/3/88新藥生產(chǎn)菌的選育自然分離

:樣品的采集與處理分離方法有稀釋法和濾膜法活性測定非致病菌為對象，采用瓊脂擴(kuò)散法測定活性，篩選生物活性物質(zhì)?？梢允褂媚退幒统艟N。用HPLC、LC－MS等，分析鑒定活性物質(zhì)。其他現(xiàn)代的篩選技術(shù)如靶向篩選、高通量篩選、高內(nèi)涵篩選等可以結(jié)合使用。微生物菌種的選育與保藏第8頁/共25頁2023/3/89新藥生產(chǎn)菌的選育

自然選育

:在生產(chǎn)過程中，不經(jīng)過人工誘變處理，根據(jù)菌種的自發(fā)突變而進(jìn)行菌種篩選的過程，叫自然選育或自然分離。

基本過程如下：

菌種→單孢子或單細(xì)胞懸液→適當(dāng)稀釋→瓊脂平板分離→挑單個菌落進(jìn)行生產(chǎn)能力測定→選出優(yōu)良菌株。

自然選育簡單易行，可達(dá)到純化菌種、防止退化、穩(wěn)定生產(chǎn)水平和提高產(chǎn)量的目的。但效率低，增產(chǎn)幅度不會很大。微生物菌種的選育與保藏第9頁/共25頁2023/3/810新藥生產(chǎn)菌的選育

誘變育種

:誘變育種是人為創(chuàng)造條件，使菌種發(fā)生變異，從中篩選優(yōu)良個體，淘汰劣質(zhì)個體，是當(dāng)前菌種選育的一種主要方法。其特點是速度快、收效大、方法相對簡單。但缺乏定向性，要配合大規(guī)模的篩選工作。

誘發(fā)突變的因素有物理、化學(xué)和生物三類。

誘變育種方案的設(shè)計

誘變育種整個過程涉及誘變和篩選兩個階段，甚至是不斷多輪重復(fù)。微生物菌種的選育與保藏第10頁/共25頁2023/3/811新藥生產(chǎn)菌的選育

雜交育種:是兩個不同基因型的菌株通過接合或原生質(zhì)體融合使遺傳物質(zhì)重新組合，再從中分離和篩選具有新性狀的菌株。帶有定向育種的性質(zhì)。接合、原生質(zhì)體融合兩種方法?；蚬こ碳夹g(shù)育種：采用基因工程技術(shù)即基因克隆與表達(dá)技術(shù)，過量表達(dá)或抑制表達(dá)某一個或一組基因，調(diào)控代謝過程，實現(xiàn)目標(biāo)產(chǎn)物的高效表達(dá)。微生物菌種的選育與保藏第11頁/共25頁2023/3/812新藥生產(chǎn)菌的保藏

目的：保持長期存活、不退化、不喪失生產(chǎn)能力。

保存原理：使其代謝處于不活躍狀態(tài)，即生長繁殖受抑制的休眠狀態(tài)，可保持原有特性，延長生命時限。保存方法：斜面低溫保存、液體石蠟密封保藏、砂土管保藏、冷凍干燥保藏、液氮低溫保藏。微生物菌種的選育與保藏第12頁/共25頁2023/3/813新藥生產(chǎn)菌的保藏保存機(jī)構(gòu)：中國典型培養(yǎng)物保藏中心（武漢大學(xué)）中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會：中國普通微生物菌種保藏管理中心、中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(CICC,北京)、抗生素菌種保藏管理中心、中國醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏中心。美國典型菌種保藏中心（AmericanTypeCultureCollection）

日本技術(shù)評價研究所生物資源中心(NITEBiologicalResourceCenter)英國國家菌種保藏中心(TheUnitedKingdomNationalCultureCollection)微生物菌種的選育與保藏第13頁/共25頁2023/3/814微生物生長的六大營養(yǎng)要素碳源凡是構(gòu)成微生物細(xì)胞和代謝產(chǎn)物中碳素的營養(yǎng)物質(zhì)均稱為碳源。包括糖類、醇類、脂肪、有機(jī)酸等。微生物的培養(yǎng)氮源凡是構(gòu)成微生物細(xì)胞和代謝產(chǎn)物中氮素的營養(yǎng)物質(zhì)均稱為氮源。可分為有機(jī)氮源和無機(jī)氮源兩類。生長因子指微生物生長不可缺少的微量有機(jī)物，包括氨基酸、維生素、核苷酸、脂肪酸等。無機(jī)鹽和微量元素生理活性物質(zhì)的組成成分或具有生理調(diào)節(jié)作用，磷、硫、鐵、鎂、鈣、錳、銅、鋅、鈷、鉀、鈉、氯。一般低濃度起促進(jìn)作用，高濃度起抑制作用。水和能源第14頁/共25頁2023/3/815微生物培養(yǎng)基培養(yǎng)基（medium）是人工配制的供微生物生長繁殖和產(chǎn)生各種代謝產(chǎn)物所需要的多種營養(yǎng)基質(zhì)。微生物的培養(yǎng)種類：按其組成的來源分為合成培養(yǎng)基和天然培養(yǎng)基；按其狀態(tài)可分為固體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基；按其用途可分為孢子培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基。

影響培養(yǎng)基質(zhì)量的因素：原料質(zhì)量、水質(zhì)、滅菌的影響以及培養(yǎng)基的黏度。第15頁/共25頁2023/3/816微生物培養(yǎng)基——發(fā)酵培養(yǎng)基

配制一般原則

（1）生物學(xué)原則：根據(jù)不同微生物的營養(yǎng)和反應(yīng)需求，設(shè)計培養(yǎng)基。各種成分之間比例恰當(dāng)，特別是有機(jī)氮和無機(jī)氮源，C/N比。一定條件下，各種原材料之間不能產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)。具有適宜的pH和滲透壓。

（2）工藝原則：不影響通氣和攪拌，又不影響產(chǎn)物的分離精制和廢物處理，過程容易控制。

（3）低成本原則：原材料要因地制宜，來源方便，豐富，質(zhì)量穩(wěn)定，質(zhì)優(yōu)價廉，成本低。

（4）高效經(jīng)濟(jì)原則：生產(chǎn)安全，環(huán)境保護(hù)，高質(zhì)量，最高得率，最小副產(chǎn)物。微生物的培養(yǎng)第16頁/共25頁2023/3/817微生物培養(yǎng)基——發(fā)酵培養(yǎng)基設(shè)計基本思路

（1）根據(jù)他人的經(jīng)驗和成分，初步確定培養(yǎng)基的成分，作為研究的起始培養(yǎng)基。

（2）單因素實驗，確定最適宜的培養(yǎng)基成分。

（3）多因素實驗，進(jìn)行各成分之間濃度優(yōu)化和最佳配比。如均勻設(shè)計、正交實驗和響應(yīng)面分析等統(tǒng)計學(xué)方法。

（4）從搖瓶、小型發(fā)酵罐，到中試，最后放大到生產(chǎn)罐。

（5）綜合考慮各種因素，產(chǎn)量、純度、成本等后，確定一個適宜的生產(chǎn)配方。微生物的培養(yǎng)第17頁/共25頁2023/3/818基本概念雜菌（contaminatedmicrobe）：對于發(fā)酵生產(chǎn)過程，除生產(chǎn)菌以外的任何生物微生物。滅菌工藝污染（contamination）：感染雜菌的發(fā)酵體系。消毒(disinfection)：指用物理或化學(xué)方法殺滅或清除病原微生物（pathogen），達(dá)到無害化程度的過程，只能殺死營養(yǎng)體，而不能殺滅芽孢體，殺滅率99.9%以上。殺菌：殺滅或清除病所有微生物的過程，殺滅率99.9999%以上。滅菌（sterilization）：是指用物理或化學(xué)方法殺滅或清除物料或設(shè)備中所有生命物質(zhì)的技術(shù)或工藝過程，達(dá)到無活微生物存在的過程，微生物殺滅率99.999999%以上。第18頁/共25頁2023/3/819常用滅菌方法與原理

化學(xué)滅菌是指用化學(xué)物質(zhì)殺滅生物細(xì)胞的滅菌操作。其原理是使蛋白質(zhì)變性，酶失活，破壞細(xì)胞膜透性，細(xì)胞死亡。常用化學(xué)滅菌劑如高錳酸鉀、漂白粉、氯氣，有機(jī)化合物如70％～75％乙醇、甲醛、戊二醛、環(huán)氧乙烷、2％新潔爾滅、3%～5％石炭酸等。主要適合用于皮膚表面、器具、實驗室和工廠的無菌區(qū)域的臺面、地面、墻壁及局部空間或某些器械的消毒。滅菌工藝

輻射滅菌是指利用紫外線、高能量電磁波或粒子輻射滅菌，其中以紫外線最常用。其原理在于核酸和蛋白質(zhì)在紫外區(qū)有強(qiáng)烈的吸收，DNA吸收紫外線后，會形成嘧啶二聚體，如胸腺嘧啶二聚體，分子之間的交聯(lián)改變了DNA的功能，從而導(dǎo)致生物細(xì)胞死亡。只適宜于表面滅菌，常用于一定空間的空氣滅菌，如無菌室、超凈工作臺等的滅菌。第19頁/共25頁2023/3/820常用滅菌方法與原理

加熱滅菌分為蒸汽濕熱法和干熱法。對于干熱滅菌，是實驗室常用的器皿的方法。工業(yè)采用160℃、2h，或170℃、1h干熱空氣，用于需保持干燥的器械、容器的滅菌。溫度越高，時間相應(yīng)縮短。濕熱滅菌效果優(yōu)于干熱滅菌，常用條件為115℃～121℃，壓力1×105Pa，維持15～30分鐘。芽孢是一種休眠體，外面有厚膜包裹，耐熱性很強(qiáng)，不易殺滅。因此在設(shè)計滅菌操作時，經(jīng)常以殺死芽孢的溫度和時間為指標(biāo)。為了確保徹底滅菌，實際操作中往往增加50％的保險系數(shù)。滅菌工藝第20頁/共25頁2023/3/821發(fā)酵過程的主要控制參數(shù)與檢測

物理參數(shù)：溫度、壓力、攪拌轉(zhuǎn)速、攪拌功率、通氣量、黏度、料液流量等。發(fā)酵過程的控制溫度：保證酶活性的重要條件，不同的微生物菌種的最適生長溫度和產(chǎn)物形成的最適溫度都是不同的。第21頁/共25頁2023/3/822發(fā)酵過程的主要控制參數(shù)與檢測發(fā)酵過程的控制

化學(xué)參數(shù)：酸堿度、基質(zhì)濃度、溶解氧濃度、氧化還原電位、產(chǎn)物濃度等。pH值：對微生物生長的影響很明顯；發(fā)酵液的pH變化是菌體產(chǎn)酸和產(chǎn)堿的代謝反應(yīng)的綜合結(jié)果；控制方法：改變培養(yǎng)基配方、酸堿調(diào)節(jié)、補(bǔ)料流加控制、控制通氣量。溶解氧（dissolved