發(fā)酵工業(yè)菌種

發(fā)酵工業(yè)菌種第1頁/共133頁工業(yè)微生物的要求能在廉價原料制成的培養(yǎng)基上迅速生長，且生成的目的產(chǎn)物產(chǎn)量高、易于回收；

生長速度和反應(yīng)速度較快，發(fā)酵周期較短；培養(yǎng)條件易于控制；抗噬菌體及雜菌污染的能力強；第2頁/共133頁菌種選擇的要求（續(xù)）菌種不易變異退化；對放大設(shè)備的適應(yīng)性強；菌種不是病原菌，不產(chǎn)生任何有害的生物活性物質(zhì)和毒素；第3頁/共133頁２.１菌種的分離篩選一、菌種的來源根據(jù)資料直接向有關(guān)科研單位、高等院校、工廠或菌種保藏部門索取或購買；經(jīng)濟性指導(dǎo)性第4頁/共133頁從已知菌種和大自然中分離新菌株尋找新的發(fā)酵產(chǎn)品的產(chǎn)生菌；尋找老產(chǎn)品的新的優(yōu)良菌株。

第5頁/共133頁二、分離思路菌種的分離是從混雜的各類微生物中依照生產(chǎn)的要求、菌種的特性，采用各種篩選方法，快速、準確地把所需要的菌種挑選出來。第6頁/共133頁

1.菌種選擇的總趨勢野生菌→變異菌自然選育→代謝控制育種誘發(fā)基因突變→基因重組的定向育種

第7頁/共133頁2.篩選的兩種指導(dǎo)思想

先分離純化，再結(jié)合工藝要求進行篩選。分離純化同時富于篩選條件，一步得出所需菌株。結(jié)果有兩種可能：獲得適于工業(yè)發(fā)酵菌株只獲得選育所需的出發(fā)菌株

第8頁/共133頁2.分離篩選工作在實際中應(yīng)用的幾個方面從被污染的生產(chǎn)及科研用菌中分離目的菌；

生產(chǎn)中長期使用的菌種的定期分離篩選；從各種育種方法處理的微生物材料中分離篩選適于工業(yè)目的的優(yōu)良菌株；第9頁/共133頁設(shè)計篩選方案時必須考慮兩個要點

選擇性靈敏度

第10頁/共133頁新種分離與篩選的步驟定方案：首先要查閱資料，了解所需菌種的生長培養(yǎng)特性。采樣：有針對性地采集樣品。增殖：人為地通過控制養(yǎng)分或培養(yǎng)條件，使所需菌種增殖培養(yǎng)后，在數(shù)量上占優(yōu)勢。分離：利用分離技術(shù)得到純種。發(fā)酵性能測定：進行生產(chǎn)性能測定。形態(tài)、營養(yǎng)要求、生理生化特性、發(fā)酵周期、耐受最高溫度、生長和發(fā)酵最適溫度、最適pH值等。第11頁/共133頁3.新種分離與篩選的步驟

調(diào)查研究（包括資料查閱）

試驗方案設(shè)計

含微生物樣品的采集（如何使樣品中含所需微生物的可能性大？）

樣品預(yù)處理（如何在后續(xù)的操作中使這種可能性實現(xiàn)）

菌種分離

第12頁/共133頁

根據(jù)目的菌株及其產(chǎn)物特點分

選擇性分離方法 隨機分離方法

(定向篩選←選擇壓力)

(用篩選方案-檢測系統(tǒng)進行間接分離）

富集液體培養(yǎng)固體培養(yǎng)基條件培養(yǎng)

(初篩)

菌種純化

復(fù)篩

第13頁/共133頁

菌種純化初步工藝條件摸索再復(fù)篩生產(chǎn)性能測試較優(yōu)菌株1-3株保藏及進一步做生產(chǎn)試驗?zāi)承┍匾囼灪突蜃鳛橛N的出發(fā)菌株毒性試驗等

第14頁/共133頁2.1.1樣品的采集采樣時應(yīng)注意的問題:土壤微生物的分布采土深度土壤植被情況采樣季節(jié)土壤的酸堿度對于分離篩選新菌種，還存在另兩個選擇標準：土壤來源廣泛在已適應(yīng)相當苛刻環(huán)境壓力的微生物類群中尋找新菌種第15頁/共133頁（二）采樣方法用取樣鏟，將表層5cm左右的浮土除去，取5~25cm處的土樣10~25g裝入事先準備好的塑料袋內(nèi)扎好。給塑料袋編號并記錄地點、土壤質(zhì)地、植被名稱、時間及其他環(huán)境條件。一般樣品取回后應(yīng)馬上分離，以免微生物死亡。第16頁/共133頁樣品的預(yù)處理目的：提高分離效率方法：物理方法：熱處理；膜過濾法；離心法化學(xué)方法誘餌法第17頁/共133頁分離方法的選擇

根據(jù)目的菌有無選擇性特征來選擇分離方法菌種的營養(yǎng)特征獨特

生長特征獨特

無選擇性特征根據(jù)產(chǎn)物的特征進行

隨機分離選擇性分離的關(guān)鍵：生長培養(yǎng)條件的選擇與控制，從而實現(xiàn)定向富集篩選。選擇性分離

第18頁/共133頁2.1.3樣品的富集培養(yǎng)富集培養(yǎng)是根據(jù)目的微生物的生理特點，設(shè)計一種選擇性培養(yǎng)基，創(chuàng)造有利于目的微生物生長的條件，使目的微生物迅速地生長繁殖，數(shù)量增加，由原來的劣勢種變?yōu)閮?yōu)勢種，以利分離到所需要的菌株。富集培養(yǎng)要根據(jù)微生物的碳、氮源、PH、溫度、需氧等生理因素加以控制。第19頁/共133頁

選擇性分離原理和技術(shù)生長條件的選擇與控制原理控制營養(yǎng)成分

控制培養(yǎng)基酸堿度

添加抑制劑

控制培養(yǎng)溫度

控制通氣條件

選擇性分離技術(shù)富集液體培養(yǎng)技術(shù)固體培養(yǎng)技術(shù)施加選擇壓力，進行定向篩選

第20頁/共133頁A.富集液體培養(yǎng)增加混合菌群中所需菌株數(shù)量的一種技術(shù)技術(shù)特點：給混合菌群提供一些有利于目的菌株生長或不利于目的菌以外的其他菌型生長的條件培養(yǎng)方式分批培養(yǎng)方式：以最大比生長速率（μmax）篩選，存在選擇壓力的控制、移種時間和次數(shù)等問題連續(xù)培養(yǎng)方式：以比生長速率（μ）篩選第21頁/共133頁

μ

ABS0基質(zhì)濃度對A、B兩種菌的比生長速率（μ）的影響

當S<S0時，富集什么菌株？當S>S0時，富集什么菌株？第22頁/共133頁連續(xù)富集培養(yǎng)技術(shù)分離菌株的優(yōu)點

分離的菌株特別適合連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)過程有利于分離具有某種工業(yè)生產(chǎn)特性的菌株可以篩選出能共生的穩(wěn)定混合培養(yǎng)物

第23頁/共133頁B.固體培養(yǎng)技術(shù)常用于分離某些酶產(chǎn)生菌

選擇壓力：在選擇培養(yǎng)基中加入所需酶的基質(zhì)

第24頁/共133頁2.1.4、菌種的分離

(一)

稀釋涂布法把土壤樣品以十倍的級差，用無菌水進行稀釋，取一定量的某一稀釋度的懸浮液，涂抹于分離培養(yǎng)基的平板上，經(jīng)過培養(yǎng)，長出單個菌落，挑取需要的菌落移到斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)。第25頁/共133頁1.稀釋平皿分離法1.稀釋平皿分離法100ml1g9ml9ml9ml9ml9ml9ml1/1001/100010-810-710-610-510-41ml1ml1ml1ml1ml(1)稀釋第26頁/共133頁1.稀釋平皿分離法b.涂布平皿分離法a.傾注平皿分離法第27頁/共133頁(二)劃線分離法

用接種環(huán)取部分樣品或菌體，在某平板上劃線，當單個菌落長出后，將菌落移入斜面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)后備用。第28頁/共133頁2.平皿劃線分離法

a.連續(xù)劃線分離法b.分區(qū)劃線分離法第29頁/共133頁（三）利用平皿的生化反應(yīng)進行分離

1透明圈法平板培養(yǎng)基中加入溶解性較差的底物，使培養(yǎng)基混濁。能分解底物的微生物在菌落周圍產(chǎn)生透明圈，圈的大小一般與該菌株利用底物的能力有關(guān)。分離脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶、核酸水解酶產(chǎn)生菌時采用，產(chǎn)生菌都會在含有底物的選擇性培養(yǎng)基平板上形成肉眼可見的透明圈。第30頁/共133頁在分離某種產(chǎn)生有機酸的菌株時，在培養(yǎng)基中加入碳酸鈣，使平板成混濁狀，將樣品懸浮液涂抹到平板上進行培養(yǎng)，由于產(chǎn)酸菌能夠把菌落周圍的碳酸鈣水解，形成清晰的透明圈，可以鑒別出來。第31頁/共133頁2．變色圈法

在底物平板中加入指示劑或顯色劑，使所需微生物能被快速鑒別出來。篩選果膠酶的產(chǎn)生菌時，用含0.2％果膠為惟一碳源的培養(yǎng)基平板，對含微生物樣品進行分離，待菌落長成后，加入0.2％剛果紅溶液染色4h，具有分解果膠能力的菌落周圍便會出現(xiàn)絳紅色水解圈。第32頁/共133頁

篩選谷氨酸產(chǎn)生菌時，可在培養(yǎng)基中加入溴百里酚藍，變色范圍在pH6.2—7.6，當pH在6.2以下時為黃色，PH7.6以上為藍色。若平板上出現(xiàn)產(chǎn)酸菌，其菌落周圍會變成黃色，可篩選谷氨酸產(chǎn)生菌。第33頁/共133頁3．生長圈法生長圈法通常用于分離篩選氨基酸、核苷酸和維生素的產(chǎn)生菌。將待檢菌涂布于含高濃度的工具菌并缺少所需營養(yǎng)物的平板上進行培養(yǎng)，若某菌株能合成平板所需的營養(yǎng)物，在該菌株的菌落周圍便會形成一個混濁的生長圈。第34頁/共133頁只要是篩選微生物營養(yǎng)缺陷型產(chǎn)生菌,都可以采用生長圈法.工具菌采用相應(yīng)的營養(yǎng)缺陷型菌株,由于得到所需的營養(yǎng),凡是目的微生物都出出現(xiàn)渾濁的生長圈.第35頁/共133頁氨基酸產(chǎn)生菌的篩選

樣品

預(yù)處理

初篩（除真菌）

在分離平板上生長獲得多個單菌落復(fù)印平板（copy法）

平板培養(yǎng)，其中有產(chǎn)生氨基酸的菌落分泌氨基酸對應(yīng)到copy前相應(yīng)

u.v線殺死長好的菌落

位置，找到目的菌落

再鋪上一層含營養(yǎng)缺陷型試驗菌的瓊脂

培養(yǎng)后

產(chǎn)氨基酸菌落周圍有生長圈

目的菌落進行液體培養(yǎng)，對產(chǎn)物進行定量測定篩選產(chǎn)物含量高的菌株第36頁/共133頁4．抑菌圈法抑菌圈法是抗生素篩選常用的初篩方法.工具菌是抗生素的敏感菌。第37頁/共133頁若被檢菌能分泌某些抑制菌生長的物質(zhì)，如抗生素等，便會在該菌落周圍形成工具菌不能生長的抑菌圈，被鑒別出來。第38頁/共133頁抗生素產(chǎn)生菌的篩選篩選模型：試驗菌篩選方法：鋪菌法

復(fù)印平板法液體培養(yǎng)篩選

抗藥性篩選篩選模型：氨芐青霉素和β-內(nèi)酰胺酶產(chǎn)生菌（克雷白氏菌）協(xié)同

I II無試樣時（不含棒酸時），I對II菌作用不大有試樣時（含棒酸時），I對II菌恢復(fù)藥效，棒酸抑制水解酶活性

固體培養(yǎng)篩選第39頁/共133頁2.1.5菌種的初篩和復(fù)篩

采用與生產(chǎn)相近的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，通過三角瓶的容量進行小型發(fā)酵試驗，以求得適合于工業(yè)生產(chǎn)用菌種。第40頁/共133頁初篩是從大量分離到的微生物中將具有合成目的產(chǎn)物的微生物篩選出來的過程。由于菌株多，工作量大，為了提高初篩的效率，通常需要設(shè)計一種快速、簡便又較為準確的篩選方法。一、初篩第41頁/共133頁1.平板篩選通過該法可淘汰85％一90％不符合要求的微生物，剩下較好的菌株則需進行搖瓶復(fù)篩。在純化分離階段隨機挑選的菌株，由于數(shù)量大，不能確定是否具有目的產(chǎn)物生產(chǎn)能力，只能首先采取較粗放的檢測方法。第42頁/共133頁優(yōu)點：瓊脂平板定性測定法．簡便、快速，在篩選上作量大時具有相當優(yōu)越性。缺點：產(chǎn)物活性只能相對比較，難以得到確切的產(chǎn)量水平，只適用于初篩。在初篩時盡量使用這種平皿快速檢測法，將復(fù)雜而費時的化學(xué)測定改為肉眼可見的顯色或生化反應(yīng)，能較大提高篩選效率，減少工作量。第43頁/共133頁二、復(fù)篩復(fù)篩：一個菌株通常重復(fù)3—5瓶，培養(yǎng)后的發(fā)酵液采用精確分析方法測定。優(yōu)點：可信度大；缺點：操作繁瑣，測定時間長，影響篩選工作量。第44頁/共133頁菌種選育改良的具體目標提高目標產(chǎn)物的產(chǎn)量提高目標產(chǎn)物的純度，減少副產(chǎn)物改良菌種性狀，改善發(fā)酵過程改變生物合成途徑，以獲得高產(chǎn)的新產(chǎn)品第45頁/共133頁目的

提高目標產(chǎn)物的能力

提高產(chǎn)品質(zhì)量

開發(fā)新產(chǎn)品

解決生產(chǎn)實際問題

防止菌種退化2.2工業(yè)微生物育種第46頁/共133頁基因突變：自然選育、誘變育種基因重組：雜交、原生質(zhì)體融合、基因工程基因的直接進化：點突變、易錯PCR、同序法DNAShuffling等方法第47頁/共133頁自然選育在工業(yè)生產(chǎn)上的意義自然選育雖然突變率很低，但卻是工廠保證穩(wěn)產(chǎn)高產(chǎn)的重要措施?；貜?fù)突變：高產(chǎn)菌株在傳代的過程中，由于自然突變導(dǎo)致高產(chǎn)性狀的丟失，生產(chǎn)性能下降，稱為回復(fù)突變問題：高產(chǎn)菌株是正突變高，還是負突變高？第48頁/共133頁自然選育操作步驟：一般習(xí)慣上將自然選育稱為菌種的分離純化。單細胞(孢子)懸液的制備平板分離挑選單菌落(注意形態(tài)的觀察)發(fā)酵試驗第49頁/共133頁二、誘變育種用各種物理、化學(xué)的因素人工誘發(fā)基因突變進行的篩選，稱為誘變育種。誘變劑：能夠提高生物體突變頻率的物質(zhì)稱為誘變劑誘變劑物理：紫外，快中子化學(xué)：硫酸二乙酯，亞硝基胍{第50頁/共133頁二、誘變育種步驟出發(fā)菌株的選擇處理菌懸液的制備誘變處理中間培養(yǎng)分離和篩選第51頁/共133頁(一)出發(fā)菌株的選擇1．野生型菌株，誘變處理較敏感；2．在生產(chǎn)中選種得到的菌株與野生型較相像的菌種；3．每次誘變處理都有一定提高的菌株；4．出發(fā)菌株開始時可以同時選2～3株；5．選擇單倍體細胞、單核或核少的多細胞體來作出發(fā)誘變細胞；第52頁/共133頁

(二)處理菌懸液的制備制備單細胞和單孢子狀態(tài)的、活力類似的菌懸液，為此要進行合適培養(yǎng)基的培養(yǎng)，并要離心，洗滌，過濾。帶玻璃珠的三角瓶內(nèi),加無菌水第53頁/共133頁(三)誘變處理

根據(jù)前面有關(guān)誘變劑及誘變處理的介紹，結(jié)合誘變對象的實際，設(shè)計誘變處理方案。第54頁/共133頁

(四)中間培養(yǎng)由于在發(fā)生了突變尚未表現(xiàn)出來之前，有一個表現(xiàn)延遲的過程，即細胞內(nèi)原有酶量的稀釋過程(生理延遲)，需3代以上的繁殖才能將突變性狀表現(xiàn)出來,此過程稱為中間培養(yǎng).中間培養(yǎng)對篩選和獲得穩(wěn)定菌株都是極為重要的。第55頁/共133頁

方法：

讓變異處理后細胞在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)幾小時，以讓細胞的遺傳物質(zhì)復(fù)制，讓細胞繁殖幾代，以得到純的變異細胞。

第56頁/共133頁(五)分離和篩選篩選分初篩和復(fù)篩。初篩以迅速篩出大量的達到初步要求的分離菌落為目的，以量為主。復(fù)篩則是精選，以質(zhì)為主，以精確度為主。因此在具體方法上就有差異.

第57頁/共133頁①營養(yǎng)缺陷型的選育營養(yǎng)缺陷型是指通過誘變而產(chǎn)生的缺乏合成某些營養(yǎng)物質(zhì)如氨基酸、維生素和堿基等的能力，必須在其基本培養(yǎng)基中加入相應(yīng)的營養(yǎng)成分才能正常生長的變異株。第58頁/共133頁

①基本培養(yǎng)基（MM，minimalmedium）——僅能滿足野生型菌株生長營養(yǎng)要求的培養(yǎng)基。②補充培養(yǎng)基（SM，supplementalmedium）——在基本培養(yǎng)基中有針對性地補加某一種或幾種營養(yǎng)成分，以滿足相應(yīng)的營養(yǎng)缺陷型菌株生長需要（其他營養(yǎng)缺陷型仍不能生長）的培養(yǎng)基。③完全培養(yǎng)基（CM，completemedium）——凡可滿足一切營養(yǎng)缺陷型菌株需要的天然或半組合培養(yǎng)基。與篩選營養(yǎng)缺陷型有關(guān)的三類培養(yǎng)基第59頁/共133頁篩選營養(yǎng)缺陷型的步驟誘變淘汰野生型檢出缺陷型確定生長譜第60頁/共133頁淘汰野生型抗生素法：由于細菌或酵母對一些抗生素敏感，在MM中一定量的抗生素，殺死活化狀態(tài)的野生型，保存了休眠狀態(tài)的缺陷型細菌－青霉素，酵母－制霉菌素菌絲過濾法：對于霉菌，因孢子生長后會長出菌絲體，就可用濾紙過濾法將菌絲濾去，而缺陷型孢子卻因未發(fā)芽而不能濾過第61頁/共133頁檢出缺陷型原理：在固體基本培養(yǎng)基和完全培養(yǎng)基上，生長情況完全不同，缺陷型在CM上生長良好，而在MM上則不生長，野生型都能生長。

具體方法：影印法、點種法、夾層法第62頁/共133頁生長譜測定的方法將缺陷型菌株培養(yǎng)后，收集菌體，制備成細胞懸液，與MM培養(yǎng)基(融化并涼至50℃)混合并傾注平皿。待凝固后，分別在平皿的5-6個區(qū)間放上不同的營養(yǎng)組合的混合物或吸飽此組合營養(yǎng)物的濾紙圓片。培養(yǎng)后會在某組合區(qū)長出，就可測得所需營養(yǎng)。一個平皿測一個菌。第63頁/共133頁天冬氨酸黃色短桿菌的代謝過程甲硫氨酸蘇氨酸賴氨酸天冬氨酸磷酸天冬氨酸激酶天冬氨酸β－半醛抑制高絲氨酸高絲氨酸脫氫酶(hom)第64頁/共133頁天冬氨酸激酶（AK），是一個變構(gòu)酶，并有兩個活性中心，分別受Lys、Thr的協(xié)同反饋抑制

協(xié)同反饋抑制：該酶有多個活性中心，抑制物可以分別和某一個特定的活性中心結(jié)合，但是并不影響該酶的活性，只有當該酶的所有的活性中心都被抑制物結(jié)合后，其活性才受到抑制。

黃色短桿菌的代謝特點第65頁/共133頁天冬氨酰磷酸天冬氨酸-β-半醛高絲氨酸高絲氨酸磷酸O-琥珀酸高絲氨酸二氫吡啶-2,6-二羧酸賴氨酸蘇氨酸異亮氨酸蛋氨酸天冬氨酸12345第66頁/共133頁兩個分支點的優(yōu)先合成機制：優(yōu)先合成Hos，然后再優(yōu)先合成Met

當Met過量時阻遏琥珀酰高絲氨酸合成酶，使代謝流向合成Thr的方向進行當Thr過量時反饋抑制高絲氨酸脫氫酶，使代謝流向Lys的合成上。（Met＞Thr＞Lys）第67頁/共133頁

切斷或減弱代謝支路

切斷或減弱合成Met、Thr的分支途徑——選育營養(yǎng)缺陷型或滲漏突變株育種途徑第68頁/共133頁

優(yōu)先合成的轉(zhuǎn)換：可引起一種終產(chǎn)物的過量生成。高比活性的HD使Thr優(yōu)先合成。若往培養(yǎng)基里添加過量的Met，將HD的活性控制在原來活性的1/3，在野生株中也能積累5g/LLys，進一步通過突變將HD比活性降低到原來活性的1/3，可積累20g/LLys。A、需要選用Hom-,其意義在于：第69頁/共133頁

結(jié)果：由于HD活性下降但不完全喪失，使代謝流發(fā)生變化，使原來優(yōu)先合成Hos方向轉(zhuǎn)向合成Lys方向。而Thr和Met少量合成，生成的Thr的量不足以與lys共同對AK酶起協(xié)同反饋抑制，就使Lys得以積累。第70頁/共133頁

解除了Hom的優(yōu)先合成機制，阻斷了代謝向Met、Thr的方向進行，節(jié)省了原料，可以使Asp-β-半醛這個中間代謝產(chǎn)物全部轉(zhuǎn)入Lys的生物合成上。B、需要選用Hom-，其意義在于：第71頁/共133頁

在培養(yǎng)基中限量的供給Met、Thr（或者Hom），對于AK酶活性的調(diào)節(jié)有著重要意義。因為AK酶是一個協(xié)同反饋抑制的變構(gòu)酶，限制了其中某一個抑制物（Thr），則Lys的濃度再高，也不會影響到AK酶的活性，那么，代謝一直向著賴氨酸合成的方向進行，使得產(chǎn)物的合成暢通無阻。第72頁/共133頁

雙重營養(yǎng)缺陷型突變株（Met-+Thr-）,其本質(zhì)和Hom-相同。優(yōu)點：遺傳性質(zhì)穩(wěn)定，回復(fù)突變的幾率少。

第73頁/共133頁天冬氨酸人工控制黃色短桿菌的代謝過程生產(chǎn)賴氨酸中間產(chǎn)物Ⅰ天冬氨酸激酶中間產(chǎn)物Ⅱ甲硫氨酸蘇氨酸高絲氨酸高絲氨酸脫氫酶不能合成可以大量積累賴氨酸人工誘變的菌種不能產(chǎn)生第74頁/共133頁從理論上講，選育Hom-進行賴氨酸發(fā)酵，如果在其培養(yǎng)基中限量供給Thr，則AK酶的活性不會受到Lys的反饋抑制，實際上Lys對AK酶的活性存在一定的抑制作用。因此，對于黃色短桿菌的Lys發(fā)酵，僅僅選育Hom-是不夠的。為了高效率的轉(zhuǎn)化Lys，需要解決這一問題：是該酶（AK）脫敏（就是該酶具有抗反饋抑制或阻遏的能力），如何使其脫敏呢？解除反饋調(diào)節(jié)（—反饋阻抑）第75頁/共133頁結(jié)構(gòu)類似物：結(jié)構(gòu)與代謝產(chǎn)物類似的化合物特點：有反饋調(diào)節(jié)作用無正常生理功能篩選方法：濃度梯度法（補充）篩選結(jié)構(gòu)類似物抗性突變株第76頁/共133頁選育結(jié)構(gòu)類似物抗性突變株？（Xr）

S-L-半胱氨酸抗性突變株AECr（效果最佳，應(yīng)用最廣）γ-甲基賴氨酸抗性突變株MLrL-賴氨酸氧肟酸鹽抗性突變株LysHxr

蘇氨酸氧肟酸鹽抗性突變株ThrHxr第77頁/共133頁L-Lys:CH2(NH2)-CH2-CH2-CH2-CH(NH2)COOHAEC:CH2(NH2)-CH2-S-CH2-CH(NH2)COOH結(jié)構(gòu)類似物AEC物的作用機制：起假反饋抑制作用

AEC與L-Lys結(jié)構(gòu)相似，被天冬氨酸激酶所誤認，與Thr一起在天冬氨酸激酶的變構(gòu)部位上結(jié)合，協(xié)同抑制酶活。抗結(jié)構(gòu)類似物突變株的實質(zhì)：天冬氨酸激酶編碼的結(jié)構(gòu)基因發(fā)生突變。第78頁/共133頁調(diào)節(jié)基因或操縱基因發(fā)生突變，產(chǎn)生的阻遏蛋白不再能和終產(chǎn)物結(jié)合或結(jié)合后不能作用于已突變的操縱基因上，因此不能再起反饋阻遏作用；或是由于編碼酶的結(jié)構(gòu)基因發(fā)生突變，使變構(gòu)酶不再具有結(jié)合終產(chǎn)物的能力但具有催化活性，從而解除了反饋抑制。第79頁/共133頁結(jié)構(gòu)類似物與末端產(chǎn)物有相似的結(jié)構(gòu)，能與阻遏蛋白或變構(gòu)酶結(jié)合，阻止產(chǎn)物的合成，引起反饋調(diào)節(jié)作用，但它們不能代替末端產(chǎn)物參與生物合成，它們在細胞內(nèi)濃度不會降低，因此他們與阻遏蛋白或變構(gòu)酶結(jié)合也是不可逆的。未突變的細胞因代謝受阻，不能合成某種產(chǎn)物而死亡。抗反饋調(diào)節(jié)突變株則即使在結(jié)構(gòu)類似物存在下，仍可合成末端產(chǎn)物形成菌落。第80頁/共133頁③組成型突變株的篩選結(jié)構(gòu)基因或操縱基因發(fā)生突變，均可獲得組成型突變株。組成型突變株的篩選設(shè)計某種有利于組成型菌株生長，并限制誘導(dǎo)型菌株生長的條件，造成組成型菌株生長優(yōu)勢，選出組成型突變菌株。β-半乳糖苷酶鄰硝基-β-D-巖藻糖苷乳糖第81頁/共133頁賴氨酸生產(chǎn)菌種的選育改良思路出發(fā)菌株：黃色短桿菌、谷氨酸棒桿菌、乳糖發(fā)酵短桿菌育種思路

1.優(yōu)先合成的轉(zhuǎn)換——滲漏缺陷型的選育

2.切斷支路代謝——營養(yǎng)缺陷型的選育：高絲氨酸缺陷型

3.抗結(jié)構(gòu)類似物突變株的選育：AEC4.解除代謝互鎖：Leu-、

抗Leu結(jié)構(gòu)類似物、喹啉s

、苯醌s5.增加前體物的合成和阻塞副產(chǎn)物的生成：

Ala-、抗Asp結(jié)構(gòu)類似物

選育適宜的CO2固定酶/TCA循環(huán)酶活性比突變株

6.改善細胞膜的透過機能

7.選育溫度敏感突變株

8.應(yīng)用細胞工程和基因工程育種第82頁/共133頁第83頁/共133頁四原生質(zhì)體融合技術(shù)把兩個親本的細胞壁分別通過酶解作用加以瓦解，使菌體細胞在高滲環(huán)境中釋放出只有原生質(zhì)膜包裹的球狀物（稱原生質(zhì)體）.兩親本的原生質(zhì)體在高滲條件互相混合，由聚乙二醇作為助溶劑，使它們互相凝集發(fā)生融合，兩親本基因組由接觸到交換，實現(xiàn)遺傳重組。第84頁/共133頁(一)雜交頻率較高(二)受接合型或致育型的限制?。憾H株中任何一株都可能起受體或供體的作用，有利于不同種屬間微生物的雜交。(三)遺傳物質(zhì)傳遞更為完整：原生質(zhì)體融合是二親株的細胞質(zhì)和細胞核進行類似的合二為一的過程。一、原生質(zhì)體融合育種的特點第85頁/共133頁第86頁/共133頁基因重組

甲

生長快、產(chǎn)量低乙生長慢、產(chǎn)量高生長快、產(chǎn)量高第87頁/共133頁

(四)存在著兩株以上親株同時參與融合形成融合子的可能性。（五）有可能采用產(chǎn)量性狀較高的菌株作融合親株。

(六)提高菌株產(chǎn)量的潛力較大。

(七)有助于建立工業(yè)微生物轉(zhuǎn)化體系。第88頁/共133頁三、原生質(zhì)體融合育種步驟1．標記菌株的篩選和穩(wěn)定性驗證2．原生質(zhì)體制備3．等量原生質(zhì)體加聚乙二醇促進融合4．涂布于再生培養(yǎng)基，再生出菌落5．選擇性培養(yǎng)基上劃線生長，分離驗證，挑取融合子進一步試驗、保藏。6．生產(chǎn)性能篩選第89頁/共133頁影響原生質(zhì)體制備的因素1．菌體的前處理2．菌體的培養(yǎng)時間3.酶濃度

第90頁/共133頁4．酶處理溫度5．破壁pH值6．滲透壓穩(wěn)定劑等滲透壓在原生質(zhì)體制備中，不僅起到保護原生質(zhì)體免于膨裂，而且還有助于酶和底物的結(jié)合，滲透壓穩(wěn)定劑多采用甘露醇，山梨醇，蔗糖等有機物和KCl和NaCl等無機物。第91頁/共133頁四、基因工程育種基因重組育種：是運用體外DNA各種操作獲得目的基因，再借助于病毒、細菌質(zhì)粒等載體，將目的基因轉(zhuǎn)移至新的宿主細胞并使其在新的宿主細胞系統(tǒng)內(nèi)進行復(fù)制和表達。第92頁/共133頁一個完整的基因克隆過程包括以下步驟１、獲得待克隆的DNA片段（基因）；２、目的基因與載體在體外連接；３、重組DNA分子導(dǎo)入宿主細胞；４、篩選、鑒定陽性重組子；５、重組子的擴增與／或表達。第93頁/共133頁第94頁/共133頁質(zhì)粒載體第95頁/共133頁載體－宿主系統(tǒng)載體(vector)是攜帶外源DNA進入宿主細胞進行擴增和表達的DNA；一般是通過改造質(zhì)粒、噬菌體或病毒等構(gòu)建的。第96頁/共133頁載體應(yīng)具備以下條件：１、能在適當?shù)乃拗骷毎袕?fù)制；２、具有多種限制酶的單一切點（即所謂多克隆位點）以便外源DNA插入；３、具有篩選標志以區(qū)別陽性與陰性重組分子；４、載體分子較小，以便體外基因操作，同時載體DNA與宿主DNA便于分離；５、對于表達型載體還應(yīng)具有與宿主細胞相適應(yīng)的啟動子、增強子、加尾信號等基因表達元件。第97頁/共133頁宿主細胞必須符合以下條件１、對載體的復(fù)制和擴增沒有嚴格的限制；２、不存在特異的內(nèi)切酶體系降解外源DNA；３、在重組DNA增殖過程中，不會對它進行修飾；４、重組缺陷型，不會產(chǎn)生體內(nèi)重組；５、容易導(dǎo)入重組DNA分子；６、符合重組DNA操作的安全標準。第98頁/共133頁目的基因的獲取一、通過建立基因文庫分離靶基因基因文庫包括兩類：基因組文庫：利用限制性內(nèi)切酶。cDNA：用mRNA反轉(zhuǎn)錄成單鏈DNA，再經(jīng)DNA聚合酶的作用產(chǎn)生雙鏈DNA,可去除真核生物基因中不表達的內(nèi)含子。第99頁/共133頁二、化學(xué)合成法制備DNA片段從蛋白質(zhì)肽鏈的氨基酸順序可以知道它的遺傳密碼，再依照密碼合成基因。三、聚合酶鏈反應(yīng)法擴增基因片段對于已知全部或部分核苷酸序列的基因，可以通過聚合酶鏈反應(yīng)（ＰＣＲ），以基因組DNA或cDNA模板擴增得到目的基因片段。第100頁/共133頁DNA擴增PCR反應(yīng)第101頁/共133頁DNA片段的體外連接是重組DNA技術(shù)的關(guān)鍵。DNA連接是由DNA連接酶催化完成的。DNA分子的體外連接第102頁/共133頁一、DNA連接酶DNA連接酶催化兩條雙鏈DNA片段相鄰的5’-磷酸和3’-羥基間形成磷酸二酯鍵。在分子克隆中最有用的的DNA連接酶是來自T4噬菌體的DNA連接酶。T4DNA連接酶在分子克隆中主要用于：１、連接具有同源互補粘性末端的ＤＮＡ片段；２、連接雙鏈DNA分子間的平端；３、在雙鏈平端的DNA分子上添加合成的人工接頭或適配子。第103頁/共133頁重組DNA導(dǎo)入宿主菌體外連接的重組DNA分子必須導(dǎo)入適當?shù)氖荏w細胞中才能大量的復(fù)制、增殖和表達。根據(jù)所采用的載體的性質(zhì)，將重組DNA分子導(dǎo)入受體可有不同的方法。第104頁/共133頁一、轉(zhuǎn)化指以細菌質(zhì)粒為載體，將外源基因?qū)胧荏w細胞的過程。轉(zhuǎn)化時，細菌必須經(jīng)過適當?shù)奶幚硖幱诟惺軕B(tài)－即容易接受外源DNA的狀態(tài)，然后利用短暫熱休克使DNA導(dǎo)入細菌宿主中。此外還可用電穿孔法轉(zhuǎn)化細菌，它的優(yōu)點是操作簡便、轉(zhuǎn)化效率高、適用于任何菌株。第105頁/共133頁二、轉(zhuǎn)染和感染

利用噬菌體DNA作為載體時可經(jīng)兩種方式導(dǎo)入受體菌。一種是感染，即在體外將噬菌體DNA包裝成病毒顆粒，然后使其感染受體菌;一種方式是轉(zhuǎn)染，即在DNA連接酶作用下使噬菌體DNA環(huán)化，再象重組質(zhì)粒一樣地轉(zhuǎn)化進受體菌。但習(xí)慣上常把以噬菌體DNA為載體構(gòu)建成的重組子導(dǎo)入細胞的過程統(tǒng)稱為轉(zhuǎn)染。第106頁/共133頁重組克隆的篩選與鑒定

基因克隆的最后一步是從轉(zhuǎn)化細菌菌落中篩選出含有陽性重組子的菌落，并鑒定重組子的正確性。通過細菌培養(yǎng)以及重組子的擴增，獲得所需的基因片段的大量拷貝。進一步研究該基因的結(jié)構(gòu)、功能，或表達該基因的產(chǎn)物。第107頁/共133頁一、抗藥性標志的篩選

如果克隆載體帶有某種抗藥性標志基因如ampr或tetrr，轉(zhuǎn)化后只有含這種抗藥基因的轉(zhuǎn)化子細菌才能在含該抗菌素的平板上幸存并形成菌落，這樣就可將轉(zhuǎn)化菌與非轉(zhuǎn)化菌區(qū)別開來。如果重組DNA時將外源基因插入標志基因內(nèi)，該標志基因失活，通過有無抗菌素培養(yǎng)基對比培養(yǎng)，還可區(qū)分單純載體或重組載體（含外源基因）的轉(zhuǎn)化菌落。第108頁/共133頁二、β－半乳糖苷酶系統(tǒng)篩選很多載體都攜帶一段細菌的lacZ基因，它編碼β－半乳糖苷酶N-端的146個氨基酸，稱為α－肽，而某些宿主細胞表達β－半乳糖苷酶的C-端肽鏈。當載體與宿主細胞同時表達兩個片段時，宿主細胞才有β－半乳糖苷酶活性，使特異的底物X-gal變?yōu)樘m色化合物，這就是所謂的α－互補。而重組子由于基因插入使α－肽基因失活，不能形成α－互補，在含X-gal的平板上，含陽性重組子的細菌為無色菌落或噬菌斑。第109頁/共133頁經(jīng)初篩鑒定有重組子的菌落，小量培養(yǎng)后，再分離出重組質(zhì)?；蛑亟M噬菌體DNA，用相應(yīng)的內(nèi)切酶切割，釋放出插入片斷；對于可能存在雙向插入的重組子，還要用內(nèi)切酶消化鑒定插入的方向。從平板上直接挑選菌落裂解后，直接電泳檢測載體質(zhì)粒大小，判斷有無插入片段存在，該法適于插入片段較大的重組子初篩。三、菌落快速裂解鑒定法四、內(nèi)切酶圖譜鑒定第110頁/共133頁重組DNA的鑒定第111頁/共133頁2.3、工業(yè)微生物菌種保藏保藏原理：根據(jù)菌株生理生化特性，人工創(chuàng)造條件（低溫、干燥、真空）使菌體的代謝活動休眠期狀態(tài)。目的要求：經(jīng)長期保藏后菌種存活健在，保證菌種不改變表型和基因型，特別是不改變菌種代謝產(chǎn)物生產(chǎn)能力注意事項：要保藏休眠體；培養(yǎng)基異貧乏，碳源少；盡量減少對細胞的損傷第112頁/共133頁⑴

冷凍保藏

冷凍保藏（-20℃以下）：將菌種加入菌種保護劑（甘油或二甲基亞砜）通過冷凍，使微生物代謝活動停止。冷凍溫度愈低，效果愈好。同時要掌握好冷凍速度和解凍速變。冷凍保藏的缺點運輸較困難。主要冷凍保藏方法普通冷凍保藏技術(shù)(-20℃)超低溫冷凍保藏技術(shù)(-60－-80℃)液氮冷凍保藏技術(shù)（-130－-150℃）第113頁/共133頁保藏方法：將菌懸液或斜面培養(yǎng)物細胞將菌種加入菌種保護劑，密封于試管或EP管內(nèi)，貯藏于冰箱的冷藏室或普通冰箱(-20℃)中。保藏期限：1—2年注意事項：經(jīng)次解凍的菌株不宜二次保藏；保藏過程中應(yīng)注意控制保藏溫度，培養(yǎng)瓶或試管應(yīng)嚴格密封；不適宜多數(shù)微生物的長期保藏。①普通冷凍保藏技術(shù)(-20℃)第114頁/共133頁保藏方法：取對數(shù)生長中期至后期的微生物細胞，用新鮮培養(yǎng)基重新懸浮所收獲的細胞，加入等體積的20％甘油或10％二甲亞砜，混勻后分裝入冷凍指管或安瓿中，于-60℃超低溫冰箱中保藏。保藏期限：5年注意事項：冷凍速度控制在1-2℃／min②

超低溫冷凍保藏技術(shù)(-60－-80℃)第115頁/共133頁

③液氮冷凍保藏技術(shù)保藏方法：斜面用10％甘油制備懸液或培養(yǎng)液體物用20%甘油制備懸液，混勻，取0.5～lmL分裝玻璃安瓿或液氮冷藏專用塑料瓶，酒精噴燈封口；先于5℃冰箱中3min，后置于金屬容器，以1-2℃/min控速冷凍至細胞凍結(jié)點(通常為-30℃)，再以1℃/min控速冷凍至-50℃；迅速移入液氮罐中于液相(-196℃)或氣相(-156℃)中保存。第116頁/共133頁復(fù)蘇方法：從液氮罐中取出所需的安瓿，立即冰浴10min；再迅速將安瓿置于37-40℃水浴中，輕搖融解；取0.1-0.2ml轉(zhuǎn)接入瓊脂斜面上。保藏期限：10年以上注意事項：保護劑最終濃度為10％無菌甘油或5％無菌二甲亞砜。甘油為高壓蒸汽滅菌，二甲亞砜最好為過濾滅菌。第117頁/共133頁⑵

凍干保藏

保藏方法：將混有保護劑冰凍至-60℃菌種迅速轉(zhuǎn)移至-40℃時啟動真空泵，使真空度減壓到2.67～4.00Pa條件下使凍結(jié)的細胞懸液中的水分升華，使菌種干燥成粉，分裝密封安瓿，低于5℃下保藏。是微生物菌種長期保藏的最為有效的方法之一。保藏期限：10年以上注意事項：冷凍干燥過程中必須使用冷凍保護劑，如脫脂乳和蔗糖，凍干后的菌株無需進行冷凍保藏，便于運輸。第118頁/共133頁⑶

其他保藏方法①傳代保藏②礦物油中浸沒保藏

第119頁/共133頁①傳代保藏保藏方法：將菌種定期在新鮮瓊脂斜面基本培養(yǎng)基上傳代，5℃以下保藏保藏期限：

1-3月注意事項：此法簡單和經(jīng)濟，可用于實驗室中若干菌種的保藏；但易發(fā)生培養(yǎng)基干枯、菌體自溶、基因突變，應(yīng)加以防治。不適宜作工業(yè)生產(chǎn)菌種的長期保藏方法。第120頁/共133頁保藏方法：將瓊脂斜面或液體培養(yǎng)菌種物浸入無菌礦物油中于室溫下保藏，此方法簡便有效，可用于絲狀真菌、酵母、細菌和放線菌的保藏。保藏期限：

1-3年注意事項：以液體石蠟保藏時，應(yīng)對菌株預(yù)先作石蠟培養(yǎng)試驗，保藏株2～3年也應(yīng)做一次存活試驗。②礦物油中浸沒保藏第121頁/共133頁⑷

基因工程菌的保藏由載體質(zhì)粒等攜帶的外源DNA片段通常是遺傳不穩(wěn)定的、且很易丟失其外源質(zhì)粒復(fù)制子。質(zhì)?；蛲ǔ樗拗骷毎L非必需。當細胞丟失這些質(zhì)粒時，生長速度會加快。當培養(yǎng)基中加入抗生素時，有利于攜帶質(zhì)粒的細胞群體生長選擇壓力，有利于維持質(zhì)粒復(fù)制與染色體復(fù)制的協(xié)調(diào)，基因工程菌應(yīng)保藏在含低濃度選擇劑的培養(yǎng)基中。第122頁/共133頁⑸

微生物活力和穩(wěn)定性測定目的要求：保藏菌種的方法都必須是長期可靠地保持菌種的優(yōu)良性狀