第二章基因工程操作常規(guī)技術(shù)方演示文稿

第二章基因工程操作常規(guī)技術(shù)方演示文稿當(dāng)前1頁，總共54頁。優(yōu)選第二章基因工程操作常規(guī)技術(shù)方當(dāng)前2頁，總共54頁。5引物酶PCR技術(shù)簡史?DNA的復(fù)制??核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’3’5’DNA解旋解鏈合成引物子鏈延長AUCGCGTAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCGGGAUCG

引物酶

5‘

RNA引物RNA引物當(dāng)前3頁，總共54頁。TAGCGCTATCGCATCGACGCT

GGAUCGAUCGCGPCR技術(shù)簡史?DNA的復(fù)制??核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明

DNA解旋解鏈合成引物子鏈延長3’5‘

5‘3’5’3’

3’5’ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC

TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG

ATAGCGTAGCTGCGACCTAGCDNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶當(dāng)前4頁，總共54頁。PCR技術(shù)簡史

?

DNA的復(fù)制?

核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想?

聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明?

1971年，Khorana提出：經(jīng)過DNA

變性，與合適引物雜交，用DNA聚

合酶延伸引物，并不斷重復(fù)該過程

便可克隆基因。?

但由于測序和引物合成的困難，以

及70年代基因工程技術(shù)的發(fā)明使克

隆基因成為可能，所以，Khorana

的設(shè)想被人們遺忘了……當(dāng)前5頁，總共54頁。PCR技術(shù)簡史?

DNA的復(fù)制

?

核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想

?

聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明?

1985年，美國PE-Cetus公司的Mullis等人發(fā)明

了聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）?

基本原理是在試管中模擬細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制?

最初采用E-coli

DNA聚合酶進(jìn)行PCR，由于該

酶不耐熱，使這一過程耗時(shí)，費(fèi)力，且易出錯(cuò)?

耐熱DNA聚合酶的應(yīng)用使得PCR能高效率的進(jìn)

行，隨后PE-Cetus公司推出了第一臺(tái)PCR自動(dòng)

化熱循環(huán)儀?

1993年，Mullis等因此項(xiàng)技術(shù)獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)當(dāng)前6頁，總共54頁。Kary

B.

Mullis<<The

Unusual

Origin

ofthe

Polymerase

Chain

Reaction>>1989年美國《Science》雜志列PCR

為十余項(xiàng)重大科學(xué)發(fā)明之首,比喻1989年為PCR爆炸年,Mullis榮獲1993年度諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。當(dāng)前7頁，總共54頁。Mullis開車的時(shí)候,瞬間感覺兩排路燈就是DNA的兩條鏈，自己的車和對面開來的車象是DNA聚合酶，面對面地合成著DNA……當(dāng)前8頁，總共54頁。PCR不只是一個(gè)方法改進(jìn)Mullis的上司有句“名言”，“我們要擴(kuò)增這么多DNA樣品有什么用”；到了1991，Cetus公司以3億美元的轉(zhuǎn)讓費(fèi)將PCR相關(guān)專利轉(zhuǎn)讓給瑞士HoffmanLaRoche公司，并在此后的經(jīng)營中又獲得了數(shù)億美元的分紅；Mullis于1993年獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)，PCR和DNA重組技術(shù)一樣意義深遠(yuǎn)。當(dāng)前9頁，總共54頁。PCR儀器的變遷三個(gè)水浴鍋，用手移動(dòng)（Mullis等人當(dāng)時(shí)用的）電加熱塊＋自來水冷卻（PE，1988）電加熱塊＋內(nèi)置循環(huán)液冷卻（PE，1989）三個(gè)加熱塊＋機(jī)械手（Stratagene，1994）半導(dǎo)體制冷和加熱（MJ,PE,BioMetra,Eppendrof）溫度梯度,熒光檢測(如Roche的Lightcycler)風(fēng)加熱Lab-on-chip式的PCR儀(所謂的芯片PCR)中國的狀況1991年出現(xiàn)三個(gè)水浴鍋+機(jī)械手的原始PCR儀（華美，復(fù)日等）現(xiàn)在以半導(dǎo)體（Peltier板）制冷式為主（杭州博日,上海天呈,廈門安普利等）當(dāng)前10頁，總共54頁。PCR儀當(dāng)前11頁，總共54頁。721234522時(shí)間（min）

94

溫

度（℃）

55

1

2

3

高溫變性

低溫退火

適溫延伸重復(fù)1-3步25-30輪

目的DNA片段擴(kuò)增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性形成單鏈

DNA變性子鏈延伸

DNA加倍PCR的基本原理當(dāng)前12頁，總共54頁。94℃模板DNA當(dāng)前13頁，總共54頁。50℃

引物1

DNA引物引物2當(dāng)前14頁，總共54頁。72℃引物1引物2DNA引物Taq酶Taq酶當(dāng)前15頁，總共54頁。94℃

第1輪結(jié)束

第2輪開始當(dāng)前16頁，總共54頁。50℃

?Taq

?

?

Taq

TaqTaq72℃當(dāng)前17頁，總共54頁。72℃

第2輪結(jié)束當(dāng)前18頁，總共54頁。當(dāng)前19頁，總共54頁。當(dāng)前20頁，總共54頁。PCR體系的主要組分和反應(yīng)條件

標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系4種dNTP混合物

各200umol/L引物

各10～100pmol模板DNA

0.1～2ugTaq

DNA聚合酶

2.5uMg2+

1.5mmol/L當(dāng)前21頁，總共54頁。1）PCR反應(yīng)成分（1）模板單、雙鏈DNA均可。不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制劑、DNA結(jié)合蛋白類。一般100ng

DNA模板/100L。模板濃度過高會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)的非特異性增加。當(dāng)前22頁，總共54頁。(2)引物設(shè)計(jì)：a.序列應(yīng)位于高度保守區(qū)，與非擴(kuò)增區(qū)無同源序列。b.引物長度以15-40

bp為宜。c.堿基盡可能隨機(jī)分布，G+C占50-60%。d.引物內(nèi)部避免形成二級(jí)結(jié)構(gòu)。e.兩引物間避免有互補(bǔ)序列。f.引物3’端為關(guān)鍵堿基；5’端無嚴(yán)格限制。當(dāng)前23頁，總共54頁。

引物濃度

mol/L濃度過高易導(dǎo)致模板與引物錯(cuò)配,反應(yīng)特異性下降。（3）Taq

DNA聚合酶（thermus

aquaticus)

U/50

l酶量增加使反應(yīng)特異性下降;酶量過少影響反應(yīng)產(chǎn)量。當(dāng)前24頁，總共54頁。（4）dNTPdNTP濃度取決于擴(kuò)增片段的長度四種dNTP濃度應(yīng)相等濃度過高易產(chǎn)生錯(cuò)誤堿基的摻入，濃度過低則降低反應(yīng)產(chǎn)量dNTP可與Mg2+結(jié)合，使游離的Mg2+濃度下降，影響DNA聚合酶的活性。當(dāng)前25頁，總共54頁。（5）

Mg2+Mg2+是DNA聚合酶的激活劑。0.5mmol/L-2.5mmol/L反應(yīng)體系。Mg2+濃度過低會(huì)使Taq酶活性喪失、PCR產(chǎn)量下降；

Mg2+過高影響反應(yīng)特異性。Mg2+可與負(fù)離子結(jié)合，所以反應(yīng)體系中dNTP、EDTA等的濃度影響反應(yīng)中游離的Mg2+濃度。當(dāng)前26頁，總共54頁。2）PCR的條件(1)

變性使雙鏈DNA解鏈為單鏈94℃

20-30s(2)

退火溫度由引物長度和GC含量決定。增加溫度能減少引物與模板的非特異性結(jié)合;降低溫度可增加反應(yīng)的靈敏性。當(dāng)前27頁，總共54頁。（3）延伸70-75℃，延伸時(shí)間由擴(kuò)增片段長度決定（4）循環(huán)次數(shù)主要取決于模版DNA的濃度一般為25-35次次數(shù)過多：擴(kuò)增效率降低錯(cuò)誤摻入率增加當(dāng)前28頁，總共54頁。ParameterConcentrationTemplatepHdNTPsGelatinPrimersMg2+oncentrationEnzymeTotalvolume10

attomoles(~1×106molecules)8.4（10mMTris-Hcl）200μM(eachone)100g/ml(optional)0.5μM(eachone);(0.1—1.0μM)>0.5mM;<10mM1unit25—100μlReaction

Condition

for

a

Typical

PCR

Assay當(dāng)前29頁，總共54頁。Program94℃(firststep)37—60℃(secondstep)72℃(thirdstep)RepsCycle1Cycle2—30Cycle31*1min1min1min1min1min1min1min1min10min1×29×1×Typical

PCR

Thermal

Profile*This

cycleis

normallyincludedinaPCRassay

in

order

toallow

any

“unfinished”product

frompreviousamplificationtoachieveitsfulllength當(dāng)前30頁，總共54頁。

PCR動(dòng)畫1stcycle2ndcycle3rdcycle過程變性引物退火DNA復(fù)制當(dāng)前31頁，總共54頁。?靈敏度高1.皮克(pg=10-12)量級(jí)擴(kuò)增到微克(ug=10-6)水平2.

能從100萬個(gè)細(xì)胞中檢出一個(gè)靶細(xì)胞??簡便、快速

1.一次性加好反應(yīng)液，2～4

小時(shí)完成擴(kuò)增

2.擴(kuò)增產(chǎn)物一般用電泳分析對標(biāo)本的純度要求低

血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細(xì)胞、活組織等組織的粗提DNAPCR的特點(diǎn)當(dāng)前32頁，總共54頁。PCR的應(yīng)用?

研究–

基因克隆，DNA測序，分析突變?

診斷–

細(xì)菌、病毒、寄生蟲檢測，診斷?

人類基因組工程–

遺傳圖譜的構(gòu)建，DNA測序，表達(dá)圖譜?

法醫(yī)–

犯罪現(xiàn)場標(biāo)本分析?

腫瘤–

各種腫瘤檢測?

其他……當(dāng)前33頁，總共54頁。

1)

基因克隆重組DNA質(zhì)粒DNA基因片段當(dāng)前34頁，總共54頁。

2)

基因檢測內(nèi)源性病變基因A

A’正常人

病人

人病原微生物基因

正常人

(-)

病

人

(+)當(dāng)前35頁，總共54頁。遺傳病的診斷地中海貧血珠蛋白鏈合成不平衡HBA1、HBA2第11號(hào)染色體上的HBB基因當(dāng)前36頁，總共54頁。惡性腫瘤（癌基因或抑癌基因）PCR-RFLP（限制性核酸片段多態(tài)性）法：限制性內(nèi)切酶Ras基因當(dāng)前37頁，總共54頁。突變限制性內(nèi)切酶正常突變電泳當(dāng)前38頁，總共54頁。父

'父子母

親子鑒定當(dāng)前39頁，總共54頁?，F(xiàn)

嫌1嫌2

嫌3

犯罪現(xiàn)場調(diào)查當(dāng)前40頁，總共54頁。1）不對稱PCR目的：擴(kuò)增產(chǎn)生特異長度的單鏈DNA。方法：采用兩種不同濃度的引物。分別稱為限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.01∶0.5μM,關(guān)鍵是限制性引物的絕對量。用途：制備核酸序列測定的模板制備雜交探針基因組DNA結(jié)構(gòu)功能的研究PCR的類型限制性引物(低濃度引物)當(dāng)前41頁，總共54頁。高濃度引物低濃度引物當(dāng)前42頁，總共54頁。

2)反向PCR

(reverse

PCR)

是用反向的互補(bǔ)引物來擴(kuò)增兩引物以外的DNA片段對某個(gè)已知DNA片段兩側(cè)的未知序列進(jìn)行擴(kuò)增。

可對未知序列擴(kuò)增后進(jìn)行分析,如探索鄰接已知DNA片段的序列；用于僅知部分序列的全長cDNA的克隆,擴(kuò)增基因文庫的插入DNA；建立基因組步移文庫。已知序列未知序列未知序列當(dāng)前43頁，總共54頁。已知序列未知序列

限制酶

未知序列限制酶連接酶當(dāng)前44頁，總共54頁。3）多重PCR用于檢測特定基因序列的存在或缺失。電泳引物當(dāng)前45頁，總共54頁。4）LP-PCR（Labelled

primers)利用同位素、熒光素等對PCR引物進(jìn)行標(biāo)記，用以直觀地檢測目的基因。特別適合大量臨床標(biāo)本的基因診斷可同時(shí)檢測多種基因成分病毒1病毒2病毒

3病毒4當(dāng)前46頁，總共54頁。標(biāo)記引物PCR觀察PCR產(chǎn)物當(dāng)前47頁，總共54頁。用于擴(kuò)增已知一端序列的目的DNA。在未知序列一端加上一段多聚dG的尾巴，然后分別用多聚dC