生化反應工程

生化反應工程Contents第一節(jié)酶催化反應動力學第二節(jié)細胞生長和產物生成的動力學第三節(jié)生物反應器第四節(jié)連續(xù)培養(yǎng)幾個問題？你們在平常生活中見過那些生化反應？生化反應是怎樣進行的？第一節(jié)酶催化反應動力學酶是有催化功能的蛋白質，催化劑能影響化學反應的反應速率，但是不能影響反應的平衡狀態(tài)第一節(jié)酶催化反應動力學什么是催化劑：催化劑是一種物質，它能夠加速反應的速率而不改變該反應的標準Gibbs自由焓變化。

酶同化學催化劑在催化過程中的作用是相似的，但是化學催化劑常是非專一性的，酶催化劑雖然也有些不是非常專一，但大多數(shù)是專一性很強的，它們催化某種底物進行一種反應。例如：將水解蛋白成為小的多肽或氨基酸的水解蛋白酶，并不希望它有太強的專一性，或者稱為廣譜酶；而催化一種特殊物質異構化的酶確往往要求很強的專一性。而決定催化能力的活性點與酶分子的三維結構密切相關。

酶的另一個特性是經常需要輔因子的共同作用，輔因子是非蛋白質化合物，它與非活性蛋白結合形成具有催化活性的復合物，這種復合物常稱為酶。輔因子分為三類:第一節(jié)酶催化反應動力學1、金屬離子：最簡單的輔因子。酶與輔因子結合緊密時，金屬離子已成為酶的一部分。有時，酶與金屬離子的可逆結合比較弱，這類金屬離子成為激活劑。第一節(jié)酶催化反應動力學2、輔酶。很多酶是由蛋白質部分和與其相結合的輔基所組成，其蛋白質部分叫作酶蛋白，輔基部分叫作輔酶。3、輔底物。包括NAD、NADP、輔酶Q、谷胱甘肽、ATP、輔酶A和四氫葉酸等，這類物質是作為第二底物（同底物相比較）起作用的，它們以化學計量關系與真正的底物進行反應，反應后輔底物發(fā)生變化，不能靠這個酶反應本身把它還原成原來的狀態(tài)（即），如1-1簡單酶反應動力學如果酶催化反應為：

，則反應速率可以定義為：式中Cs和Cp分別為底物和產物的濃度。為測定酶反應動力學，常作如下實驗：在時間為零時，把底物和酶溶液在充分攪拌下與pH緩沖溶液混和，保持恒溫，然后跟蹤底物或產物濃度隨時間的變化，由所得的數(shù)據(jù)求取底物或產物對時間曲線的初始斜率，即其中酶濃度CE＝CE0，CS＝CS0和Cp＝0

1-1簡單酶反應動力學一、米氏方程米氏方程取不同的CS0和CE0可得到不同的，如圖10-1，從圖中可以看出：對底物濃度來說，在低濃度下，反應速率呈一級反應的特征；底物濃度不斷增加時，對底物的反應級數(shù)從一級逐漸變成零級；反應速率與總酶量成正比。

圖1-1酶反應動力學的特點

1-1簡單酶反應動力學這種現(xiàn)象最簡單的解釋是酶催化反應至少必須經過兩步。首先，酶E和底物S結合形成酶－底物中間體ES，在中間體形式下，底物轉化為產物并釋放出來：

如果10-3a反應進行的很快，處于平衡態(tài)，有

其中CS，CE，，CES表示底物S酶E，中間體ES的濃度。，中間體變成產物和游離酶是不可逆的，

10-1簡單酶反應動力學將1-5、1-6式代入到1-4式中，得

因，且當所有酶都參加了第二步反應，反應速率達到最大值，即，則（1-7式）可變型為其中稱作最大反應速率，稱為米氏常數(shù)。而這個方程我們成為米氏方程

1-1簡單酶反應動力學米氏方程是最簡單最經典的酶反應動力學表達式，更為一般的情況，常用定態(tài)法處理，即

反應速率（的反應速率等于中間產物ES的生成減去分解）酶中間體生成速率因為酶的中間體在反應開始升高后，基本不在改變保持定態(tài)，所以

這個假設稱為擬定態(tài)假設，成立條件為初始底物濃度遠遠大于總酶濃度。我們將1-5、1-9、1-10和1-11式聯(lián)立，得到

其中

，不在有解離常數(shù)的物理意義我們把米氏方程1-8式積分，得

從式（1-4）或式（1-10）和1-11）都可以得到

1-1簡單酶反應動力學1-4式推到過程：

1-10推導過程：

1-1簡單酶反應動力學1-1簡單酶反應動力學因此，當?shù)扔跁r，總的酶分子中，有一半處于游離態(tài)，另一半處于結合態(tài)，反應速率為最大可能反應速率的一半。當遠大于時大多數(shù)的都與底物結合成，反應速率呈零級反應特征；當遠小于時，大多數(shù)酶以游離狀態(tài)存在，反應速率呈一級反應特征。

圖1-2米氏方程的速率－濃度關系

二、可逆反應、雙底物反應、底物抑制和平行反應1、可逆反應在酶催化反應中，如生物大分子的水解其平衡點極有利于產物，多數(shù)情況下可看成不可逆的。但是，對于有些酶反應，如葡萄糖異構化酶轉化葡萄糖為果糖，在平衡狀態(tài)下時，底物和產物都有相當?shù)牧?，必須考慮逆反應。對于最簡單的可逆反應動力學模型。

1-1簡單酶反應動力學1-1簡單酶反應動力學若適用于定態(tài)近似，則正反應速率方程為其中和與米氏方程中的和一致，并且

設平衡狀態(tài)下底物濃度為，產物濃度為，平衡常數(shù)為，式1-18的分子項等于零（平衡時反應速率為零），即

1-1簡單酶反應動力學又因反應為單分子反應，反應物與生成物的分子個數(shù)相等，故將式1-20代入到1-21中，得引入新的底物濃度（因底物濃度很大，所以可以近似看成）

1-1簡單酶反應動力學把式（1-20），式（1-22），式（1-23）代入式（1-18），得

其中，式（1-24）與米氏方程形式相同。實際上，當趨于零時和分別表示和（當，由1-19式和1-20式可，，則，同理＝）1-1簡單酶反應動力學2、雙底物反應有兩個底物同時與酶作用的酶催化反應，稱為雙底物反應。由乙酰輔酶A和草酰乙酸生成檸檬酸的反應，以及氧化磷酸化過程中還原輔酶（NADH＋H＋）與氧分子結合成水的酶催化反應等都是雙底物反應的例子速率方程式推導如下：1-1簡單酶反應動力學式中為平衡常數(shù)，為反應速率常數(shù)，根據(jù)酶總濃度不變的原則，假定，可推得：在雙底物反應中，若其中一種底物處于過量狀態(tài)，這時,式1-29回復到米氏方程的形式

1-1簡單酶反應動力學3、底物抑制在高底物濃度下，酶催化反應往往會減慢，這種現(xiàn)象稱為底物抑制，如圖1-3所示隨著底物濃度的增加，反應速率r經過一個最大值。當?shù)孜餄舛葧r，底物濃度的增加反而引起反應速率的減小。

圖1-3底物抑制時的反應速率和底物濃度關系圖1-1簡單酶反應動力學這種動力學行為對生化反應器的性能有重要意義。在最簡單的情況下可用類似米氏方程的方法得出，酶－底物中間物ES能夠與第二個底物分子S結合生成第二個ESS，且它不能進行下一步反應。平衡下的反應步驟如下：

1-1簡單酶反應動力學利用上述關系可推出（應用定態(tài)法）在低底物濃度下，若遠小于1，上式簡化成米氏方程的形式。于是，這個方程的參數(shù)和常在低底物濃度下求取。在高底物濃度下，r值比米氏方程計算值小，且在時，r達到最大值，然后縮小。（或求方程最小值）

1-1簡單酶反應動力學4、平行反應許多酶不止能利用一種底物，各種反應物共用酶的活性點，并產生相互之間的競爭，這種反應方式稱為平行反應。例子：生物大分子的水解酶類，如淀粉、多糖等分子鏈很長并大小不一，實際上并不是由一種物質構成，因此其動力學行為也會有相應的差別，在這里，我們先假設一種酶同時催化兩種不同的底物進行反應。1-1簡單酶反應動力學慢反應由此可推出1-1簡單酶反應動力學定義總的底物濃度為將1-33和1-34式代入到1-35，得到總反應速率從1-36式可以看出，在保持總量不變的情況下，總反應速率還取決于底物濃度之比。當時

1-36式變?yōu)椋敃r，1-36是變成為和米氏方程一致。同樣，在酶反應中，即使反應物總濃度保持常數(shù)，但相對量不同，反應器性能也會發(fā)生改變。

1-2競爭性和非競爭性抑制首先要了解什么是抑制劑，某種物質的存在而使酶催化反應速率減慢，這種物質稱為抑制劑。抑制劑可通過兩種方式產生抑制作用：1、抑制作用可由抑制劑和酶之間的作用引起；2、抑制作用可由抑制劑和底物之間的作用引起。因為抑制劑和底物的作用機理相對復雜，這里只討論抑制劑和酶之間的相互作用引起的抑制現(xiàn)象。通過稀釋和去除抑制劑，有的抑制現(xiàn)象可逆，有的抑制現(xiàn)象不可逆，在眾多抑制作用中，最簡單的模型是競爭性抑制和非競爭性抑制。

1-2競爭性和非競爭性抑制酶是靠它的活性部位來完成催化作用的。當?shù)孜锖鸵种苿┒寄軐Ｒ坏淖饔糜诿傅耐换钚圆课?，抑制劑與酶的結合阻止了底物與這個酶分子的結合，這種現(xiàn)象稱為競爭性抑制。當抑制劑和酶分子的結合點不在酶催化反應的活性部位，底物和酶的結合并不影響抑制劑與酶的結合，而抑制劑與酶的結合卻阻止了底物與酶的結合，這種現(xiàn)象稱為非競爭性抑制。

圖1-4競爭性抑制和非競爭性抑制

1-2競爭性和非競爭性抑制一、競爭性抑制其中I為抑制劑，其反應速率為我們繼續(xù)用定態(tài)假設進行計算，設、在達到平衡后維持不變，則1-2競爭性和非競爭性抑制因抑制劑都是過量的，所以可近似認為抑制劑總濃度等于，可得

(可與米式方程對應)式中

競爭性抑制可用于化學治療藥物，也可用于殺蟲劑或除草劑。在青霉素之類抗生素發(fā)現(xiàn)之前，磺胺藥物（如磺胺吡啶）用作主要的的抗細菌藥物，它在輔酶四氫葉酸的合成中能與對氨基苯甲酸競爭，細菌需要合成這種酶，而人直接從維生素葉酸獲得，這樣用磺胺吡啶處理細菌感染，對人影響很小。

1-2競爭性和非競爭性抑制二、非競爭性抑制同樣根據(jù)定態(tài)假設，可得

1-2競爭性和非競爭性抑制在下，得式中三、根據(jù)實驗數(shù)據(jù)判別競爭性抑制和非競爭性抑制通過E-H作圖法，將米氏方程轉換為；對于競爭性抑制和非競爭性抑制可將方程轉換為和1-2競爭性和非競爭性抑制圖1-5競爭性抑制和非競爭性抑制的eadie作圖

1-3pH值和溫度的作用

影響酶催化活性的因素很多，如pH值、溫度、流體力、化學試劑和輻射等，其中，最常遇到、影響最大的是pH值和溫度對催化活性的作用。一、pH值的作用我們都知道，酶的基本組成是蛋白質，構成蛋白質的氨基酸含有堿性、中性和酸性集團。在一定pH值下，酶既帶有正電荷基團也帶有負電荷基團，而這些基團常是構成活性點的部分。一種酶往往只是在一種特定的電荷狀態(tài)下才具有催化活性。因為具有這種特定電荷狀態(tài)的酶只占總酶的一部分，隨著pH值的變化，酶的相對活力有一個最大值，即相對活性pH值曲線常呈鐘罩型或倒拋物線型。

1-3pH值和溫度的作用其模型如下：其中E代表酶的活性形式，、都是酶的非活性形式。解離常數(shù)K1,K2分別由下式表示：1-3pH值和溫度的作用其中分別對應的和氫離子的濃度形式，而上述三種狀態(tài)的酶的總濃度是不變的，即

用分別表示與值之比，通過1-50和1-51式的轉換，則有

1-51轉換得：

1-3pH值和溫度的作用1-50轉換得：兩式代入得同理可得到：

1-3pH值和溫度的作用上述三式稱為米氏pH值函數(shù)，y達到最大值時的氫離子濃度為即1-3pH值和溫度的作用因為參加酶反應的是處于活化狀態(tài)的酶，那可用代替總酶濃度，則得到新的最大反應速率為

（米式方程中最大反應速率表達式為）

1-3pH值和溫度的作用二、溫度作用溫度對化學反應的作用可用阿倫尼烏斯方程表示

其中k為反應速率常數(shù)，A為數(shù)前因子，Ea為活化能，Rg為氣體常數(shù)8.31，T是絕對溫度。最佳溫度產生原因：溫度升高，反應速率加快，同時，溫度過高，酶受到破壞，失去活性，但兩者達到平衡取得最佳值時就是最佳溫度。第二節(jié)細胞生長和產物生成的動力學第一節(jié)我們講了幾種簡單的酶催化反應的動力學方程和影響酶催化反應的因素，這一節(jié)我們主要從細胞的角度來分析動力學方程。細胞和酶有明顯的區(qū)別，酶是有活性的物質，而細胞則是有生命的物質，他利用底物主要有三個作用：（1）合成新的細胞物質（自身代謝）（2）合成細胞外產物（作為整個細胞組織其它細胞的需要）（3）提供必須能量。a、進行合成反應需要；b、維持細胞內物質的濃度與環(huán)境的差別；c、進行細胞內的轉化反應。

第二節(jié)細胞生長和產物生成的動力學

進行細胞過程所需要的能量是ATP或類似物質的化學能，它由兩個過程產生：一、底物氧化成CO2和水（氧化磷酸化）；二、底物降解為簡單產物（如乙醇、乙酸、檸檬酸、底物水平磷酸化等）、CO2和水等。底物水平磷酸化為第一類產物。

第二節(jié)細胞生長和產物生成的動力學細胞外產物是指：（1）胞外酶（分解不能通過細胞壁的底物）；（2）多糖（用于細胞聚集）；（3）特殊代謝產物（能抑制競爭微生物，如抗生素），這類物質統(tǒng)稱為第二類產物。有時當含碳底物過量，含氮鎂等底物限制下，產生第三類底物，它們主要是蓄能化合物，如糖原、脂肪和多糖等。維持細胞內物質的濃度與環(huán)境的差別和進行細胞內的轉化反應所需要的總能量稱為維持能，其只能維持細胞處于活性狀態(tài)，不生成細胞物質和第二、三類產物。

第二節(jié)細胞生長和產物生成的動力學圖1-6是細胞、底物、能量和產物的關系圖，各個r表示下標物質的生成或消耗速率，S、N、O、X、P和C分別表示底物、氮源、氧、細胞、產物和二氧化碳。實線表示物質流，虛線表示以ATP形式的能量流。含碳底物（以CHO表示）形成第三類產物，與含氮底物一起形成細胞物質和第二類產物。因反應過程需要能量，含氮底物又被用來產生能量用以合成和維持。產能途徑有兩條:一是無氧代謝產生第一類產物，二是有氧代謝產生CO2和水。

第二節(jié)細胞生長和產物生成的動力學圖1-6細胞、底物、能量和產物的關系圖第二節(jié)細胞生長和產物生成的動力學進入的物料有三種（CHO、N、O），可以寫出三個獨立的物料平衡關系，也能寫出總的ATP平衡關系，這樣就有四個平衡方程。圖1-6中有八個物料流和一個能量流，總共9個速率式。因此可以有5個獨立的速率方程式。（5個反應速率方程）

第二節(jié)細胞生長和產物生成的動力學最常選擇的兩個動力學表達式rm（維持能）和rx（生長速率），其它的表達式可選擇ro（氧攝入速率）、rp2和rp3（第二、三類產物生成）。因為在實際中不可能把氧化磷酸化產生的CO2和水與作為第一類產物的CO2區(qū)分開來。因此可忽略這支流和對應的氧平衡，剩下兩個物料平衡和一個ATP平衡式

第二節(jié)細胞生長和產物生成的動力學式中Y為得率系數(shù)。為生成每kg細胞所需的ATP的千摩爾數(shù)，為生成每kg第一類產物所需的ATP的千摩爾數(shù)，和類推。這樣有了三個平衡關系和七個速率關系，其中只有四個速率方程是獨立的。它們的基本形式是

1-4細胞的生長和維持一、細胞的生長和抑制細胞的生長和抑制的動力學模型大多以酶動力學模型為基礎。把細胞看做是一個微小的化學反應器，通過復雜的酶催化反應網絡把底物轉化為活細胞物質和分泌物質。假設所有底物中有一種是限制性底物，在這種底物轉化為細胞物質所經過的各種途徑中，有一條途徑是最慢的，限制了總反應速率。這樣我們通過測定這條途徑的速率就可以測定總反應速率，這步反應稱為限制性反應。如果我們對模型進行簡化，假定速率控制反應中，酶濃度正比于細胞濃度，底物濃度正比于限制性底物濃度，那么對于細胞生長，可以寫出與酶催化反應的米氏方程類似的形式

1-4細胞的生長和維持此式稱為細胞生長的（Monod）方程，其中是細胞生長速率，是最大比生長速率，是限制性底物濃度，是飽和常數(shù)，是活細胞濃度。

稱為比生長速率。

1-4細胞的生長和維持如果限制性底物濃度遠大于，那么比生長速率為定制。這表明菌體處于對數(shù)生長期，即生長速率與已有的細胞量呈正比。比生長速率與細胞倍增時間的關系為（倍增時間是細胞總量增加一倍所用的時間）

1-4細胞的生長和維持同理，對應酶反應方程，可得出雙底物限制、底物限制和生長抑制的細胞生長方程為（受底物抑制，當?shù)孜餄舛仍黾拥揭欢ㄖ岛?，再提高底物濃度生長速率會下降）

（受雙底物限制時）

有許多物質包括底物、產物或其他物質會抑制細胞生長，這些抑制劑的作用就好象酶催化反應中的抑制劑，可按酶催化抑制動力學模擬細胞生長抑制，為抑制劑濃度

1-4細胞的生長和維持二、細胞維持維持能是細胞消耗能量的一部分，用于維持細胞處于活性狀態(tài)（例如新合成被不斷降解的細胞物質）以及保持細胞內外的濃度梯度，產生維持能而消耗底物的速率寫為：也可根據(jù)ATP寫出維持方程

1-4細胞的生長和維持其中是ATP需要量，是速率常數(shù)。M值的范圍（0.02-4），單位是kg底物、（kg細胞h）。值的范圍為0.5-200。m值的大小與環(huán)境條件和細胞生長速率有關。大部分維持能用于保持滲透壓的恒定，增加培養(yǎng)基鹽濃度會大大增加m值。pH值對m值也有較大影響，改變了環(huán)境條件，細胞調節(jié)酶譜適應環(huán)境，細胞蛋白的重新合成加快，m值提高。生長條件不改變時，用于細胞物質重新合成的維持能比較低，但當細胞停止生長或適應新的底物時，m值就比較高。

1-4細胞的生長和維持三、細胞死亡細胞在生長的同時，也有部分活細胞變成非活性的。所謂非活性細胞，一部分是真正死亡，唯一的命運是水解；另一部分處于假死狀態(tài)，短期內不能轉化為活細胞，假定轉化為非活性細胞的速率正比于活細胞量1-4細胞的生長和維持環(huán)境條件對的影響知之甚少，底物濃度對的影響可假定為在底物濃度為零時,有最大值；在底物濃度高時，即，有最小值。

1-5產物形成對各類產物的生成，有許多模型，有三種模型代表了三種系統(tǒng)生長偶聯(lián)產物：(與細胞生長速率有關)非生長偶聯(lián)產物：（與細胞濃度有關）混和動力學：

對乳酸發(fā)酵：這個式子是經驗式，但也可從細胞過程推出。1-5產物形成在無氧條件（）下，對第一類產物作ATP平衡（）

（第一類產物產生的ATP等于生成細胞物質和細胞維持所需能量）

式中

，所以

為生成每kg細胞所需的ATP的千摩爾數(shù)，為生成每kg第一類產物所需的ATP的千摩爾數(shù)。

1-5產物形成此式與式（1-37）一致，但有了理論依據(jù)。要使第一類產物生成速率高，就需要微生物有高的維持能要求，生產單位量的第一類產物時生產的ATP要少（即要少）。上述方程也可解釋乙醇發(fā)酵中運動短桿菌比酵母效率高的原因。運動短桿菌的mATP值是酵母的14-25倍，而運動短桿菌的值是0.5kmolATP/（kg乙醇），酵母的對應值卻是1。1-5產物形成對其他產物的生成也可采用類似的方法討論。對第二類產物，有為使產物生產速率最大，應抑制細胞生長，氧攝取率應最大，用于維持和產物生成的底物為：

1-5產物形成在培養(yǎng)基中產物達到足夠高的濃度，會抑制甚至停止產物生成，這在乙醇發(fā)酵中是很典型。產物抑制的動力學表達式可借用細胞生長抑制的表達式（1-68），把其中的抑制物濃度換成濃度。乙醇發(fā)酵中常用的產物表達式為：其中為最大可能的乙醇濃度。

1-6底物利用

隨著底物消耗，形成細胞物質和代謝物質。那底物利用速率和這些物質的生成速率又是怎樣一個關系呢，我們可以通過一個化學方程式來表示，如葡萄糖生成乙醇的方程

即消耗1kg葡萄糖（分子量180），生成0.51kg乙醇（分子量46）。如果表示產物生成速率，表示用于產物生成的底物消耗速率，即1-6底物利用式中，是產物對底物的產率系數(shù)。在以細胞無氧生長的關系為例式中(分子量30)代表糖類化合物，（分子量18）是氮源，（分子量24.6）是許多細胞的近似分子式。由此可見，每消耗1kg糖類底物可產生0.81kg細胞，而每1kg氮源則可產生8.8kg細胞

1-6底物利用或或以乙醇發(fā)酵為例，酵母無氧生長時，細胞合成所需要的能量從糖生成乙醇的反應中得到。為生成1kg細胞所需的ATP的千摩爾數(shù)，為生成每kg乙醇所產生的ATP千摩爾數(shù)。這樣，每生成1kg細胞，會產生kg乙醇，即每生成1kg細胞，要消耗1/0.81kg生成細胞的葡萄糖，kg葡萄糖生成乙醇。

1-6底物利用細胞對葡萄糖產率為，對于＝0.095，＝1/46，值為0.102。同樣乙醇對糖的產率為0.446。這里沒有考慮維持能，它會進一步減少細胞和乙醇的產率。產率是一種產物對一種反應物的比率，其中的反應物進入反應后，可以形成各種產物。

1-6底物利用總的底物利用速率是利用底物形成各種產物（包括細胞）的速率之和。當細胞生長、產物合成和維持用的能量來自氧化磷酸化時，CO2和水也包括在產物中，但它們也是合成反應的產物。很難搞清楚它們具體來自哪個途徑?？墒牵粢阎跸乃俾?，則氧化磷酸化所利用的底物可通過氧化反應計量學求得。用氧把葡萄糖氧化成CO2和水，每30kg葡萄糖要消耗32kg氧，所以氧所需要的底物的比率系數(shù)是1.067，對應的底物消耗速率為

1-6底物利用如果氧化磷酸化的氧消耗速率未知，生產合成需的能量的那部分底物包括在按化學方程式合成所需的底物中。這時的產率系數(shù)稱為產率因子，用表示。對于提供維持能所需的底物，常采用一級關系.

這樣底物利用的更普遍的表達式為：1-7溫度和pH值的影響在細胞反應過程中，除了滿足細胞生長的營養(yǎng)需要外，還需要維持細胞生長的適宜操作條件，其中溫度和pH值是兩個重要的因素

1、溫度溫度對細胞內所進行的各種生化反應和其生長速率都有很大的影響。一般動物細胞的培養(yǎng)溫度為31-39℃，植物細胞為25-30℃，微生物則根據(jù)其最適培養(yǎng)溫度可分為低溫菌中溫菌和高溫菌等幾種。絕對反應速率理論既適用于細胞生長，也適用于細胞死亡，即1-7溫度和pH值的影響其中，k為比生長速率常數(shù)或死亡速率常數(shù)，是過程的活化能，R是氣體定律常數(shù)。一般來說，生長活化能的數(shù)量級為35-50000，死亡活化能的能量級為200-400000。這樣，對于某種細胞，就有一個最佳生長溫度，如圖1-7所示。

1-7溫度和pH值的影響圖10-7溫度對生長速率的影響1-7溫度和pH值的影響pH值對生長速率影響的模型是在酶特性基礎上建立起來的。由于酶是由氨基酸組成的，因而有酸、堿和中性三種形式，細胞也分為活性（即中性）（即酸性或堿性）形式

其中和是其平衡常數(shù)。如果把活性細胞分率定義為y：

1-7溫度和pH值的影響其中，那么與酶性質相似，有

其中為氫離子濃度

1-7溫度和pH值的影響圖1-8表示pH值對活性細胞分率的影響。對多數(shù)細胞系統(tǒng)，

1-8重組微生物的穩(wěn)定性在重組微生物培養(yǎng)過程中，微生物生長到一定代數(shù)后，產物的產率會逐漸減少。其主要原因有兩個：1、細胞分裂時，質粒的缺失性分配；2、質粒DNA突變導致結構不穩(wěn)定性。對于穩(wěn)定得質粒分配，細胞每分裂一代，每個細胞的平均質?？截悢?shù)倍增，同時，在細胞分裂時，質?？截惼骄胤峙涞絻蓚€子代細胞中。據(jù)報道，質粒不穩(wěn)定的問題在大腸桿菌、枯草桿菌和酵母作為宿主的系統(tǒng)中都廣泛存在。1-8重組微生物的穩(wěn)定性提高穩(wěn)定性的方法1、通過改變培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基，使有利于攜帶質粒的細胞生長2、施加選擇性壓力，控制丟失質粒細胞的生長3、使用溫度敏感性突變質?；蛲蛔冎?、使用溫度敏感的基因表達控制。當基因表達受控制時，質粒常保持穩(wěn)定5、使用不含可轉移原件的質粒。可轉移元件實質可插入基因圖譜中幾個位點的DNA片斷6、使用重組缺陷型細胞株

第三節(jié)生物反應器生物反應器是生化產品生產中的主流設備，用于進行酶反應，動植物細胞培養(yǎng)，常規(guī)微生物和基因工程菌的發(fā)酵。生物反應器的幾何參數(shù)、機構特征、操作類型、流動和混合狀態(tài)、能量引入的方式會影響生物反應速率，甚至產物的選擇性和產率。因此生物反應器的選型和設計是生物反應過程的重要方面。第三節(jié)生物反應器生物反應器是利用生物催化劑進行生化反應的設備。按照生物催化劑的不同可分為酶催化反應器和細胞催化反應器。按照反應器的操作方式可分為間歇操作、連續(xù)操作和半間歇操作等。

1-9機械攪拌式反應器生物反應器是生化產品生產中的主流設備，用于進行酶反應、動植物細胞培養(yǎng)、常規(guī)微生物和基因工程菌的發(fā)酵。生物反應器的幾何參數(shù)、機構特征、操作類型、流動和混合狀態(tài)、能量引入的方式會影響生物反應速率，甚至產物的選擇性和產率。因此生物反應器的選型和設計是生物反應過程的重要方面。1-9機械攪拌式反應器圖1-11機械攪拌式發(fā)酵罐示意圖機械攪拌式發(fā)酵罐的結構如圖1-11所示，發(fā)酵罐外形為圓柱形，為承受消毒時的蒸汽壓力，蓋和底封頭為橢圓形，中心軸向位置上裝有攪拌器。1-9機械攪拌式反應器其中H是筒身高度，D是罐內直徑，W是擋板高度，d是攪拌器直徑，S是兩攪拌器間距，B是下攪拌器距底間距。反應器的基本結構包括：筒體，攪拌器，換熱器，擋板，消泡器，電動機和變速器，空氣分布器。在筒體的適當部位裝有溶氧電極，pH電極，CO2電極，熱電偶，壓力表等檢測元件。反應器還有排氣、取樣、放料和接種口，酸、堿管道接口和人孔視鏡等部位。

1-9機械攪拌式反應器反應器中的換熱器有不同形式，小的反應器采用加套冷卻加熱來達到控溫的目的，大的反應器則需要在內部另加盤管。用于耗氧過程的反應器裝有通氣裝置、氣體通過氣體分布器通過，分布器置于反應器的最低層攪拌槳葉的下面。氣體分布器有的是帶孔的平板，有的則是一根單管。為防止堵塞，一般孔口朝下。

1-9機械攪拌式反應器物料的混合和氣體在反應器內的分布靠攪拌器和擋板實現(xiàn)。攪拌器的葉輪可分為兩大類型：軸向流式和徑向流式。軸向流葉輪產生的流體流動基本軌跡是平行于攪拌軸的；徑向流葉輪則使流體沿葉輪半徑方向排出。軸向流葉輪的混合效果好，但是破碎氣泡的效果較差；

1-10氣升式反應器氣升式反應器是在鼓泡塔反應器的基礎上發(fā)展起來的。它以通入的氣體為動力，靠導流裝置的引導，形成氣－液混合物的總體有序循環(huán)。反應器內分為上升管和下降管，通入氣體的部分，氣含率高，相對密度輕，隨氣泡上升，氣－液混合物向上升，至液面處大部分氣泡破裂，氣體由排氣口排出；剩下的氣－液混合物相對密度較上升管內的氣－液混合物大，由下降管下沉，形成循環(huán)。

1-10氣升式反應器根據(jù)上升管和下降管的布置，可將氣升式反應器分為兩類：一類稱為內循環(huán)式，上升管和下降管在反應器內，另一類為外循環(huán)式，通常將下降管置于反應器外部，以便加強傳熱。氣升式反應器結構簡單，不需攪拌，因此造價較低，易于清洗和維修，不易染菌，能耗較低。但是，要求的通氣量和通氣壓頭較高，增加空氣凈化工作段的負荷，而且對于黏度較大的發(fā)酵液，氧傳遞系數(shù)較低。

1-10氣升式反應器圖1-12氣升式生物反應器的結構示意圖1-11其它模型的生物反應器一、固定床反應器固定床反應器的基本原理是反應液連續(xù)流動通過靜止不動的固定化生物催化劑。固定床反應器內影響反應速率的因素不但有生物催化劑活性位點上的反應，還有反應物從流體主體向固體化顆粒表面的傳遞，固體固定化顆粒內微孔中的擴散，以及顆粒內表面活性位點上生成的產物經微孔和液固界面滯留膜向流體傳遞的過程。

1-11其它模型的生物反應器二、流化床生物反應器通過流體的上升運動使固體顆粒維持在懸浮狀態(tài)進行反應的裝置稱為流化床反應器。流化床中固體顆粒與流體的混合較充分，傳熱傳質性能好，床層壓力降小，但是固體顆粒的磨損較大。

圖1-13液固流化狀態(tài)示意圖1-11其它模型的生物反應器液固流化時，液體從設備下方流入，通過分布器，進入顆粒物料層。流速低時，固態(tài)顆粒靜止不動，液體從顆粒間縫隙流過。此時屬于固定床。流速升高至某一值，床層中顆粒開始松動，孔隙增大，一些顆粒開始一定部位振動或游動，此時的床層稱為膨脹床。流速在增大，床層內部分顆粒處于運動狀態(tài)，懸浮于液體中，顆粒與液體間的摩擦力與顆粒的重力相平衡，此時顆粒與顆粒相互間的擠壓力變?yōu)?，稱為臨界流化床。當流速繼續(xù)增大到液體與顆粒間的摩擦力大于顆粒重力時，顆粒被液體帶走。如果不添加顆粒床層不復存在，若連續(xù)加入顆粒，床層變?yōu)檩斔痛不蛄鲃哟病?/p>

1-11其它模型的生物反應器以氣體為流化劑時，除了上述五種流化狀態(tài)以外，完全流化時還存在三種不同的情況。當氣固流化床不均勻時，部分氣體以氣泡的形式通過床層，此式床層稱為鼓泡流化床。此外，氣固流化床還會產生液固流化不會有的情況，騰涌和溝流。

圖1-14氣固完全流化時的三種狀態(tài)1-11其它模型的生物反應器三、膜生物反應器1、開發(fā)膜反應器的目的增大反應速率。許多反應為產物抑制型。隨反應的進程，產物濃度提高，反應速率下降。采用膜反應器可以在反應過程中移去產物，使產物濃度保持恒定，反應速率因此會比原來提高。提高反應的最終選擇性。通過選用適當?shù)哪?，將產物移出，截留副產物和反應物提高選擇性簡化生產步驟，使反應和分離同時在一個單元里操作截留生物催化劑，使細胞或酶在高濃度下運行。提高反應速率和產物濃度，減輕下一工段的負荷。同時可重復利用酶或細胞，以降低成本。

1-11其它模型的生物反應器2、膜反應器的分類按照反應器內流體與生物催化的接觸形式，可將膜反應器分為直接接觸式、擴散式和多項膜三類。（1）直接接觸式膜反應器中的膜有的只起分離作用，分離區(qū)與反應區(qū)是分開的，通常酶活細胞呈游離狀態(tài)，與膜直接接觸

1-11其它模型的生物反應器圖1-15直接接觸式膜反應器中流體相對于膜的流動方式1-11其它模型的生物反應器（2）擴散式這類反應器中物料是以擴散的方式通過膜的。膜除分離以外同時還起催化作用，酶或細胞固定于膜上，稱為催化功能分離膜反應器。即是指把酶或細胞固定在分離膜的表面或著內部，使分離膜具有催化功能作為反應場。

1-11其它模型的生物反應器（3）多項膜反應器多項膜提供酶與底物之間的界面接觸，底物和產物可處于任一相，擴散為界面?zhèn)鬟f的主要傳遞機制。膜通常作為不同相的界面，底物和產物儲存在不同的相內

1-11其它模型的生物反應器3、膜的傳遞推動力被動傳遞，靠產物的濃度差進行傳遞，作用原理和透析相同促進傳遞，以電勢差為推動力，所使用的是一種特殊的半透膜，稱為離子交換膜。他能選擇性透過陰陽離子。主動傳遞，其推動力是壓力梯度，根據(jù)膜的平均孔徑大小，對不同組分的截留能力不同，可分為微慮膜、超濾膜和反滲透膜等幾種。第四節(jié)連續(xù)培養(yǎng)優(yōu)點：與分批培養(yǎng)比較，具有反應速率容易控制，可以提高生產率，降低勞動強度等優(yōu)點。應用：用于酵母、酒精、葡萄糖酸的生產和活性污泥處理污水缺點：由于是長期連續(xù)生產，菌種易變異，而且純培養(yǎng)基也有困難。分批培養(yǎng)時，培養(yǎng)液中的菌體濃度、底物濃度等都是時刻在變化的，培養(yǎng)系統(tǒng)一直處于非定態(tài)

第四節(jié)連續(xù)培養(yǎng)理論上，連續(xù)培養(yǎng)過程常近似于全混流反應過程菌的生長受到某種底物的限制，培養(yǎng)液中的菌體和底物濃度等保持恒定，培養(yǎng)系統(tǒng)處于定態(tài)。按照全混流反應器定義，反應物和產物在反應器內均勻分布，濃度恒定。同時連續(xù)培養(yǎng)還常需要系統(tǒng)無雜菌，保持菌的生長速率恒定。第四節(jié)連續(xù)培養(yǎng)連續(xù)培養(yǎng)有兩種控制方式。一、恒化器以某種化學物質作為控制微生物生長的因素，通過控制器加入培養(yǎng)液中的速率來控制微生物生長速率，這種能控制微生物生長的物質稱為限制性底物。限制性底物可以是一種，如碳源、氮源，也可采用兩種限制性底物。二、恒濁器是用來控制培養(yǎng)液的渾濁度，從而使菌的生長速率保持恒定的裝置，一般用于光合微生物的連續(xù)培養(yǎng)，這種裝置是一個具有外循環(huán)管的容器，循環(huán)管裝有濁度計，當培養(yǎng)物的濁度不符合規(guī)定的要求時，通過濁度計對進料或出料進行反饋控制，使培養(yǎng)物的濁度達到規(guī)定的水平。

1-12單罐連續(xù)培養(yǎng)在一個發(fā)酵罐中進行的連續(xù)培養(yǎng)稱為單罐連續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)開始時，以含有一定濃度的限制性底物的培養(yǎng)基用分批培養(yǎng)的方法進行培養(yǎng)。當限制性底物幾乎被消耗盡而菌體生長到預定濃度時，一面以恒定連續(xù)加入含有同樣濃度的限制性底物的無菌培養(yǎng)基，一面以恒速出料，開始連續(xù)培養(yǎng)。經過一定階段的適應，菌生長進入定態(tài)。

1-12單罐連續(xù)培養(yǎng)圖1-16單罐連續(xù)培養(yǎng)1-12單罐連續(xù)培養(yǎng)一、單罐發(fā)酵的通用衡算模型

假定物料混合均勻，細胞平衡生長，忽略細胞自溶，可得下列細胞衡算方程式：（F為容積流率）活細胞：

非活性細胞：

產物：

底物：

總容積：

1-12單罐連續(xù)培養(yǎng)前四個衡算式可寫成一般形式，以表示某種物質的濃度式中，表示所有產生速率的總和；表示所有消失速率的總和；（稱為稀釋速率，單位為，即培養(yǎng)液在發(fā)酵罐中平均停留時間的倒數(shù)），，和分別為進料和出料的容積流率，下標d表示非活性細胞。

1-12單罐連續(xù)培養(yǎng)假定只有一種限制性營養(yǎng)物，最簡單動力學方程為細胞生長：細胞死亡：用于細胞生長和產物生成的底物消耗：

用于維持的底物消耗：

產物生成：（混和動力學）

1-12單罐連續(xù)培養(yǎng)三、單罐連續(xù)培養(yǎng)過程分析在連續(xù)培養(yǎng)的細胞、產物和底物衡算中，所涉及到的變量和參數(shù)有如下幾類。狀態(tài)變量。由過程的狀態(tài)的確定，包括操作變量。它們由過程操作者給定，包括通常為零。中間變量。它們是由狀態(tài)變量表示的速率項，包括動力學參數(shù)。包括計量參數(shù)。包括，1-12單罐連續(xù)培養(yǎng)令為零，可求解衡算方程，得到操作變量和狀態(tài)變量之間的關系。（通過157-160式）約束條件是1-12單罐連續(xù)培養(yǎng)在進一步分析一種簡化的模型，除去上面所做的假設外，還忽略細胞死亡、產物生成和細胞維持，式（1-157）－（1-160）就成為如下形式

1-12單罐連續(xù)培養(yǎng)由此得出了連續(xù)培養(yǎng)中一個非常重要的關系

（由1-166和1-147得到，因所以）由1-168式變形整理得

（由10-162式推導出，忽略、、等因素）

1-12單罐連續(xù)培養(yǎng)如果單罐連續(xù)培養(yǎng)的目的是生成菌體，則其生產率

為式中為單位時間單位反應器體積生產的細胞量。最大生產率可通過下式求得

1-12單罐連續(xù)培養(yǎng)從式（1-169）知，當時，隨著D增加，線性增加。當D值接近時，急劇增加。當時，將趨于無窮，但有約束條件可知，不可能大于，同樣，對細胞濃度，當很小時，接近于，當時，等于，這就是洗出點（此時底物消耗殆盡）。如將各個D下的,,對D作圖，即得圖1-16，有圖可見，隨著D的增加而增加，在接近最大稀釋速率時，達到最大值。此時的D值就稱為單罐連續(xù)培養(yǎng)的最適稀釋率，以Dm表示。圖1-16稀釋率與底物、菌體濃度和生產能力的關系1-12單罐連續(xù)培養(yǎng)對式（1-168）作整理可得其中表示平均停留時間。

在洗出條件下（），可用特殊方法確定。對于下，用細胞的平衡方程，有（利用和t的線性回歸，可求出）

根據(jù)式（1-170），也可以求得

1-12單罐連續(xù)培養(yǎng)四、連續(xù)培養(yǎng)中菌體維持、死亡的分析當模型與實驗現(xiàn)象不一致時（模型假設去掉的很多影響因素），需要對模型加以修正。有時，減少稀釋速率，連續(xù)培養(yǎng)達到定態(tài)后，菌體濃度反而會減少。這種現(xiàn)象可由菌體維持和死亡作出解釋。

（由10-152式(由1-152式轉化）

（由1-155轉化忽略產物）

1-12單罐連續(xù)培養(yǎng)達到非洗出定態(tài)后

(和

，1-177、1-178合并得)和對連續(xù)培養(yǎng)的性能都有較大的影響。當稀釋速率趨于零時，這兩種因素都導致菌體濃度趨于零。

1-12單罐連續(xù)培養(yǎng)同時，菌體死亡還造成洗出點的稀釋速率變?。?即1-180式，轉換代入的)細胞比死亡速率和維持系數(shù)可通過實驗數(shù)據(jù)，通過（1-179）和（1-180）求得，把1-179式轉化成按對作圖為一直線

1-12單罐連續(xù)培養(yǎng)如果無維持作用和死亡現(xiàn)象，等于。如果和已知，可在不同稀釋速率下得到一套定態(tài)數(shù)據(jù)，就能確定產率系數(shù)和維持系數(shù)。從式（1-182）可見，和的作用很相似，因此要把這兩個參數(shù)的作用區(qū)分開來是很困難的。關鍵在于精確的求取洗出點與的差別。1-13多罐串聯(lián)連續(xù)培養(yǎng)為了得到一個簡單的模型，設有n個等體積的罐（圖1-17），對第I個罐作物料衡算

圖1-17多罐串聯(lián)聯(lián)系培養(yǎng)示意圖1-13多罐串聯(lián)連續(xù)培養(yǎng)活細胞：

產物:

底物：

1-13多罐串聯(lián)連續(xù)培養(yǎng)與單罐培養(yǎng)的分析一樣，培養(yǎng)液從第i-1罐流入第i罐，立即混合均勻，罐中的培養(yǎng)液與流出液組成相同，在各罐中具有相同的值（反應方程式分子量固定），且為常數(shù)。在定態(tài)條件下，1-184方程的左邊為零，則于是

1-13多罐串聯(lián)連續(xù)培養(yǎng)即同樣，對于產物（1-186）和底物（1-188），也有

1-14具有循環(huán)的單罐連續(xù)培養(yǎng)在單罐連續(xù)培養(yǎng)過程中，為保持罐內高的微生物濃度，常采用具有循環(huán)的單罐連續(xù)培養(yǎng)的方法圖1-18，對罐作物料衡算。定態(tài)下，，則

（活細胞含量）

1-14具有循環(huán)的單罐連續(xù)培養(yǎng)圖1-18具有循環(huán)的單罐連續(xù)培養(yǎng)示意圖1-14具有循環(huán)的單罐連續(xù)培養(yǎng)由上式和式（1-194）得對分離器進行物料平衡:

根據(jù)和，有

1-14具有循環(huán)的單罐連續(xù)培養(yǎng)再把上式代入式