常見病毒性產(chǎn)品安全檢驗和效力檢驗

常見病毒性產(chǎn)品安全檢驗

和效力檢驗常見病毒性產(chǎn)品安全檢驗和效力檢驗第1頁常見病毒性產(chǎn)品安全檢驗

安全檢驗技術(shù)依據(jù)及原理安全檢驗內(nèi)容常見病毒性產(chǎn)品安全檢驗方法安全檢驗判定標(biāo)準(zhǔn)安全檢驗注意事項常見病毒性產(chǎn)品安全檢驗和效力檢驗第2頁安全檢驗技術(shù)依據(jù)及原理

對人、畜環(huán)境安全是對各類獸用生物制品最基本要求，獸用生物制品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求：對于預(yù)防、治療等用途不一樣類型獸用生物制品必須進(jìn)行安全檢驗。在依據(jù)獸用生物制品研究匯報所制訂生物制品標(biāo)準(zhǔn)中，用一定劑量和適當(dāng)路徑接種試驗動物（家兔、小鼠、豚鼠等）、雞胚或靶動物（牛、牦牛、山羊、綿羊、馬、犬、豬、雞、鴨、鵝等），經(jīng)過一定觀察期，經(jīng)過對被接種動物（或雞胚）局部或全身評價，能夠反應(yīng)被接種產(chǎn)品安全性。常見病毒性產(chǎn)品安全檢驗和效力檢驗第3頁安全檢驗內(nèi)容檢驗外源性病原污染：如致病性細(xì)菌污染或非致病性細(xì)菌數(shù)量過多（代謝產(chǎn)物影響安全）；外源病毒或支原體污染；活疫苗細(xì)胞培養(yǎng)時帶毒或培養(yǎng)用犢牛血清有其它病毒；原材料、環(huán)境及生產(chǎn)過程各個步驟污染。檢驗病毒滅活情況：對滅活疫苗而言。檢驗殘余毒力或毒性物質(zhì)：主要對活疫苗而言。殘余毒力指生產(chǎn)制品菌毒株本身是活減毒株或弱毒株，允許有輕微毒力存在，能在接種機體內(nèi)表現(xiàn)出來。按制品不一樣，這種殘余毒力大小有不一樣指標(biāo)要求，測定和檢驗方法也不一樣。

檢驗對胚胎毒性：如國外豬瘟一些弱毒株，可經(jīng)過孕豬胎盤屏障傳給胚胎造成死胎、胎兒畸形或出生后發(fā)育不良等。如歐洲藥典明確要求豬瘟病毒應(yīng)經(jīng)過對胚胎毒性檢驗。常見病毒性產(chǎn)品安全檢驗和效力檢驗第4頁安全檢驗方法△成品安全檢驗方法主要是動物檢驗。依據(jù)產(chǎn)品特點選取一定數(shù)目標(biāo)要求動物（或雞胚），按指定接種路徑接種活疫苗，不能出現(xiàn)要求條件之外不良反應(yīng)和異常。⊕動物要求：敏感（普通無母源抗體）、健康、一定品種、大小。⊕安檢劑量應(yīng)大于使用劑量。普通說來，活毒疫苗安檢用劑量是使用劑量10倍，滅活疫苗安檢用劑量是使用劑量2倍。⊕凡能以小動物作出正確判斷者，則多用試驗小動物（材料易得，費用較低）。△病毒類產(chǎn)品安全檢驗方法主要有四種類型：1、用本動物進(jìn)行安全檢驗2、用本動物或試驗動物（或雞胚）任選其一進(jìn)行安全檢驗3、只用試驗動物進(jìn)行安全檢驗4、用本動物和試驗動物同時進(jìn)行安全檢驗常見病毒性產(chǎn)品安全檢驗和效力檢驗第5頁安全檢驗四種類型主要產(chǎn)品用本動物進(jìn)行安全檢驗（18種）：雞新城疫滅活疫苗、雞產(chǎn)蛋下降綜合征滅活疫苗、雞傳染性鼻炎和雞新城疫二聯(lián)滅活疫苗、兔出血癥滅活疫苗、雞痘活疫苗（Ⅰ）、雞痘活疫苗（Ⅱ）、雞傳染性支氣管炎活疫苗（H120、H52）、雞新城疫中等毒力活疫苗、雞傳染性法氏囊中等毒力株活疫苗（B87）、鴨溫活疫苗、小鵝瘟活疫苗、雞新城疫、雞傳染性支氣管炎二聯(lián)活疫苗、雞傳染性喉氣管炎活疫苗、豬瘟活疫苗（Ⅱ）、偽狂犬活疫苗、山羊痘活疫苗、綿羊痘活疫苗。本動物或試驗動物（或雞胚）任選其一安全檢驗（3種）：雞馬立克氏病活疫苗、雞馬立克氏病火雞皰疹病毒活疫苗、雞新城疫低毒力活疫苗。只用試驗動物進(jìn)行安全檢驗（3種）：牛瘟活疫苗（Ⅰ）、牛瘟活疫苗（Ⅱ）、偽狂犬滅活疫苗。用本動物和試驗動物同時進(jìn)行安全檢驗（6種）：牛口蹄疫O型滅活疫苗、口蹄疫O、A型活疫苗、馬傳染性貧血活疫苗、豬口蹄疫O型滅活疫苗、豬瘟活疫苗（Ⅰ）、豬瘟、豬丹毒和豬肺疫三聯(lián)活疫苗。常見病毒性產(chǎn)品安全檢驗和效力檢驗第6頁安全檢驗方法舉例用本動物進(jìn)行安全檢驗：兔病毒性出血癥滅活疫苗安全檢驗：用體重1.5—3kg家兔4只，每只皮下注射4ml，觀察7日，應(yīng)全部健活。本動物或試驗動物（或雞胚）任選其一安全檢驗：馬立克氏病火雞皰疹病毒活疫苗安全檢驗，以下方法任擇其一：1、用雞檢：選取1-3日齡易感雛雞或SPF雛雞20只，其中10只各肌肉或皮下注射疫苗0.2ml（含10個使用劑量），觀察14日，對照組最少存活8只，免疫組非特異死亡數(shù)不超出對照組，判疫苗合格。2、用雞胚檢：用10日齡易感雞胚或SPF雞胚10只，每胚尿囊腔接種疫苗0.1ml（含10個使用劑量），接種后24-68小時內(nèi)雞胚非特異死亡不超出20%，死亡雞胚尿囊液對雞紅細(xì)胞凝集試驗應(yīng)為陰性，120小時搜集活胚尿囊液混合，對雞紅細(xì)胞凝集試驗應(yīng)為陰性。只用試驗動物進(jìn)行安全檢驗：牛瘟活疫苗(Ⅱ)安全檢驗:按瓶簽注明頭份，用生理鹽水稀釋為1ml含1個使用劑量，皮下注射小白鼠5只，每只0.2ml；肌肉注射豚鼠2只，每只1ml。觀察10日，均應(yīng)健活。用本動物和試驗動物同時進(jìn)行安全檢驗：

1、用體重350-450g豚鼠2只，每只皮下注射疫苗2ml；用體重18-22g小白鼠5只，每只皮下注射疫苗0.5ml。連續(xù)觀察7日，均不得出現(xiàn)因注射疫苗引發(fā)死亡或顯著局部不良反應(yīng)或全身反應(yīng)。2、用最少6月齡健康易感牛（細(xì)胞中和抗體滴度≤1：8，或乳鼠中和抗體滴度≤1：4）3頭，每頭舌后面皮內(nèi)注射20個點，每點0.1ml疫苗，逐日觀察最少4日。之后，每頭牛按推薦接種路徑接種3頭份疫苗，繼續(xù)逐日觀察6日。均不得出現(xiàn)口蹄疫癥狀或顯著因注射疫苗引發(fā)毒性反應(yīng)。

常見病毒性產(chǎn)品安全檢驗和效力檢驗第7頁安全檢驗判定標(biāo)準(zhǔn)

安檢期間死亡動物經(jīng)解剖明確非制品所致者能夠重檢，如結(jié)果可疑難以判斷時，應(yīng)以加倍頭數(shù)該種動物重檢。凡要求用各種動物進(jìn)行安檢制品（如?？谔阋逴型滅活疫苗），每種動物均應(yīng)安全合格。用小動物檢驗不合格者，有要求可用使用對象動物重檢。但用使用對象動物檢驗不合格者，不能再以小動物重檢。

常見病毒性產(chǎn)品安全檢驗和效力檢驗第8頁安全檢驗注意事項

1.為確保檢驗公正性，防止在對安全檢驗結(jié)果判定主觀影響，所以應(yīng)由2名檢驗員共同進(jìn)行。2.為預(yù)防污染，包括疫苗稀釋等操作步驟，應(yīng)該在無菌條件下進(jìn)行。3.動物喂養(yǎng)環(huán)境要符合動物喂養(yǎng)和檢驗要求，假如環(huán)境原因不穩(wěn)定，應(yīng)該設(shè)置適當(dāng)數(shù)量同起源動物對照。4.檢驗過程要注意對試驗動物進(jìn)行定時觀察，發(fā)病時要增加觀察次數(shù)，對死亡動物要及時進(jìn)行解剖。常見病毒性產(chǎn)品安全檢驗和效力檢驗第9頁安全檢驗注意事項

5.安檢動物舍應(yīng)該專用。并按強毒舍進(jìn)行管理（如試驗結(jié)束后動物應(yīng)按相關(guān)要求進(jìn)行處理、動物舍和喂養(yǎng)器具應(yīng)進(jìn)行全方面消毒。6.假如檢驗結(jié)果可疑，難以判斷時，應(yīng)以加倍動物數(shù)量重新檢驗。7凡生產(chǎn)口蹄疫疫苗生物制品企業(yè)，其生產(chǎn)豬用活疫苗，均需用乳鼠進(jìn)行安檢；凡使用豬瘟強毒或污染豬瘟強毒生物制品企業(yè)，其生產(chǎn)豬用活疫苗均用無豬瘟抗體敏感豬進(jìn)行安檢。（方法見規(guī)程P20）常見病毒性產(chǎn)品安全檢驗和效力檢驗第10頁安全檢驗注意事項

8.安全辦法：（1）檢驗過程中應(yīng)注意預(yù)防對檢驗人員和環(huán)境污染，檢驗人員必須穿戴工作服、口罩及相關(guān)安全防護(hù)器具，撒在操作臺、地面產(chǎn)品要進(jìn)行消毒處理。檢驗完成后開封產(chǎn)品均要進(jìn)行高壓滅菌處理。（2）發(fā)病或死亡動物、糞便及其污染物必須嚴(yán)格按照“預(yù)防散毒”等相關(guān)要求處理。（3）懷孕或手部有外傷檢驗人員禁止解剖死亡動物（4）在檢驗過程中發(fā)生烈性傳染病或人員意外時，必須快速通知相關(guān)部門采取緊急辦法。常見病毒性產(chǎn)品安全檢驗和效力檢驗第11頁常見病毒性產(chǎn)品效力檢驗

效力檢驗內(nèi)容效力檢驗原理及方法效力檢驗應(yīng)注意問題常見病毒性產(chǎn)品安全檢驗和效力檢驗第12頁效力檢驗內(nèi)容

免疫原性：制備制品毒種免疫原性應(yīng)良好。制備疫苗毒株必須要與流行株相對應(yīng)，才能起到好免疫效果。制品免疫連續(xù)期：理想制品應(yīng)含有較長免疫連續(xù)期，免疫連續(xù)期過短制品應(yīng)考慮增加免疫接種次數(shù)?？乖€(wěn)定性：普通滅活苗熱穩(wěn)定性很好，弱毒苗較差，但也可隨制品種類而已?？乖繙y定：活疫苗效力取決于接種動物毒量，即一定量病毒才能在體內(nèi)增殖，促使機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，若數(shù)量不夠，則達(dá)不到免疫效果。滅活苗一樣也需要一定抗原量才有效。所以應(yīng)測定制品最小免疫量。但制品抗原量并非越多越好，應(yīng)適量，不然會出現(xiàn)副反應(yīng)。常見病毒性產(chǎn)品安全檢驗和效力檢驗第13頁效力檢驗方法之一：攻毒保護(hù)試驗1、攻毒保護(hù)試驗原理：使用疫苗進(jìn)行接種最終目標(biāo)是使接種過動物取得抵抗強毒病原感染能力。所以，對靶動物或已經(jīng)建立試驗動物模型進(jìn)行接種后，用強毒病原進(jìn)行人工攻毒，依據(jù)動物保護(hù)情況判斷疫苗效力，是用以檢驗疫苗效力最直觀方法。常見病毒性產(chǎn)品安全檢驗和效力檢驗第14頁效力檢驗方法之一：攻毒保護(hù)試驗2、攻毒保護(hù)試驗方法：按照疫苗特點和使用對象選擇一定數(shù)目指定年紀(jì)（或體重）無特異性抗體易感健康動物，按照要求路徑和劑量給動物接種疫苗。除有特殊要求外，普通注苗3—4周后連同條件相同對照動物用指定強毒和毒量按要求進(jìn)行攻毒。攻毒后在要求時間內(nèi)觀察動物健康情況，不應(yīng)出現(xiàn)要求以外不良反應(yīng)和異常。常見病毒性產(chǎn)品安全檢驗和效力檢驗第15頁3、采取攻毒保護(hù)試驗方法常見疫苗以下（17種）：雞新城疫滅活疫苗、雞傳染性鼻炎-雞新城疫二聯(lián)滅活疫苗、偽狂犬病滅活疫苗、兔病毒性出血癥滅活疫苗、豬口蹄疫O型滅活疫苗、?？谔阋逴型滅活疫苗、豬瘟活疫苗(I)、豬瘟活疫苗（II）、雞傳染性喉氣管炎活疫苗、雞傳染性法氏囊病中等毒力株活疫苗、豬瘟、豬丹毒、豬多殺性巴氏桿菌三聯(lián)活疫苗、偽狂犬活疫苗、雞傳染性支氣管炎活疫苗、雞新城疫中等毒力活疫苗、雞新城疫低毒力活疫苗、雞新城疫-雞傳染性支氣管炎二聯(lián)活疫苗、鴨瘟活疫苗。

注：紅色字體疫苗表示可采取此方法，也可采取其它方法。常見病毒性產(chǎn)品安全檢驗和效力檢驗第16頁4、攻毒保護(hù)試驗效檢方法舉例?？谔阋逴型滅活疫苗效力檢驗：用最少6月齡健康易感牛（細(xì)胞中和抗體滴度≤1：8，或乳鼠中和抗體滴度≤1：4）15頭，分為3組，每組5頭，將待檢疫苗分為1頭份、1/3頭份、1/9頭份3個劑量組，每一劑量組分別于頸部肌肉注射5頭牛。接種21天后，連同條件相同對照牛2頭，每頭牛舌上表面兩側(cè)分兩點皮內(nèi)注射?？谔阋逴型病毒強毒，每點0.1ml（共0.2ml，含10000ID50）。連續(xù)觀察10日。對照牛應(yīng)最少3蹄出現(xiàn)水泡或潰瘍。免疫牛僅在舌面出現(xiàn)水泡或潰瘍，而其它部位無病變時判為保護(hù)，除舌面以外任一部位出現(xiàn)經(jīng)典口蹄疫水泡或潰瘍判為不保護(hù)。依據(jù)免疫牛保護(hù)數(shù)，按Reed-Muench法計算被檢疫苗PD50，每頭份疫苗應(yīng)最少含3PD50。常見病毒性產(chǎn)品安全檢驗和效力檢驗第17頁效力檢驗方法之二：病毒含量測定1、病毒含量測定原理：病毒含量高低直接反應(yīng)了產(chǎn)品質(zhì)量。所以用動物（雞胚、細(xì)胞培養(yǎng)物）接種測定病毒性活制品病毒含量可作為評定效力高低依據(jù)。常見病毒性產(chǎn)品安全檢驗和效力檢驗第18頁效力檢驗方法之二：病毒含量測定2、病毒含量測定方法：每批疫苗按瓶簽注明頭份用指定稀釋液作適當(dāng)稀釋后，通常選擇三個最正確稀釋液，按要求路徑和劑量接種一定數(shù)目指定試驗動物（細(xì)胞、雞胚），在要求時間內(nèi)觀察，依據(jù)動物（細(xì)胞、雞胚）對疫苗反應(yīng)情況來計算疫苗LD5O（TCID50、ELD50、PD50、EID5O）或蝕班數(shù)（PFU），以此來判定疫苗效力。常見病毒性產(chǎn)品安全檢驗和效力檢驗第19頁3、病毒含量測定常見疫苗（12種）：口蹄疫O、A型活疫苗、山羊活疫苗、雞傳染性喉氣管炎活疫苗、雞傳染性法氏囊病中等毒力株活疫苗、雞傳染性支氣管炎活疫苗、雞新城疫中等毒力活疫苗、雞新城疫低毒力活疫苗、雞新城疫、雞傳染性支氣管炎二聯(lián)活疫苗、雞痘活疫苗（Ⅰ）、小鵝瘟活疫苗、雞馬立克氏病活疫苗、雞馬力克氏病火雞皰疹病毒活疫苗。注：紅色字體疫苗表示可采取此方法，也可采取其它方法。常見病毒性產(chǎn)品安全檢驗和效力檢驗第20頁4、病毒含量測定效檢方法舉例口蹄疫O、A型活疫苗單價苗效力檢驗：將疫苗用PBS做10倍系列稀釋，O型苗以10-5、10-6、10-7三個個稀釋度，A型苗以10-6、10-7、10-83個稀釋度，各皮下接種3—4日齡乳鼠4只，每只0.1ml，觀察4-5日，依據(jù)乳鼠發(fā)病死亡數(shù)計算LD50，每0.1mlO型苗≥105.5LD50，A型苗≥106.5LD50，判為合格。

山羊痘活疫苗效力檢驗方法之一：按瓶簽注明頭份，用生理鹽水稀釋測其毒價，每頭份病毒含量應(yīng)≥103.5TCID50。常見病毒性產(chǎn)品安全檢驗和效力檢驗第21頁效力檢驗方法之三：血清學(xué)試驗1、血清學(xué)試驗原理：依據(jù)相關(guān)血清學(xué)檢驗原理，檢驗抗體水平和抗原活性，從而評定產(chǎn)品效力。病毒性產(chǎn)品主要采取以下兩種：（1）抗體效價測定：動物體免疫系統(tǒng)能夠?qū)M(jìn)入體內(nèi)外源物質(zhì)進(jìn)行吸收、加工處理和遞呈，使相關(guān)淋巴細(xì)胞活化并產(chǎn)生特異性抗體。在部分疾病免疫防治中，以這種體液免疫機制為主，其特異性抗體水平與攻毒保護(hù)率之間有一定平行關(guān)系。在這種情況下，對本動物或已經(jīng)建立試驗動物模型進(jìn)行接種后，經(jīng)過適宜血清學(xué)試驗檢測動物抗體水平，能夠作為判斷疫苗效力高低有效方法。常見病毒性產(chǎn)品安全檢驗和效力檢驗第22頁效力檢驗方法之三：血清學(xué)試驗2）中和試驗：病毒與適量抗體完全中和后，接種敏感動物或細(xì)胞，可不受侵害而取得保護(hù)。假如用一定抗原分別與系列稀釋抗體（血清）中和，可得到使50%動物或細(xì)胞取得保護(hù)最高血清稀釋度，即血清中和效價進(jìn)而評價某疫苗（抗原）效價或試驗動物相關(guān)抗體是否符合要求。2、血清學(xué)試驗方法：血清學(xué)相關(guān)方法，如紅細(xì)胞凝集抑制試驗、中和試驗、補體結(jié)合試驗等。常見病毒性產(chǎn)品安全檢驗和效力檢驗第23頁3、血清學(xué)試驗常見疫苗抗體效價測定：主要有雞產(chǎn)蛋下降綜合征滅活疫苗（HI抗體測定）、馬傳染性貧血活疫苗（補體結(jié)合試驗和瓊脂擴(kuò)散試驗）。中和試驗法：雞新城疫-雞傳染性支氣管炎二聯(lián)活疫苗、小鵝瘟活疫苗、偽狂犬病滅活疫苗。注：紅色字體疫苗表示可采取此方法，也可采取其它方法。常見病毒性產(chǎn)品安全檢驗和效力檢驗第24頁4、血清學(xué)試驗效檢方法舉例雞產(chǎn)蛋下降綜合癥效力檢驗：用3-6周齡健康易感雞（HI抗體≤1：4）10只，每只肌肉或皮下注射疫苗0.5ml,另取10只雞喂養(yǎng)不免疫；3-5周后采血，測定HI抗體，免疫雞HI抗體幾何平均滴度≥1：128，對照雞抗體HI抗體效價應(yīng)≤1：4。小鵝瘟活疫苗效力檢驗方法之一；取健康成年鵝4只，分別采血1ml,分離血清并混合備用。然后注射1個使用劑量疫苗，每只鵝1ml，21-28日后采血，分離血清混合，將接種疫苗前后2次血清分別與小鵝瘟GD株在鴨胚中作中和試驗。兩次ELD50值之差≥2對數(shù)值為合格。常見病毒性產(chǎn)品安全檢驗和效力檢驗第25頁其它效力檢驗方法熱型反應(yīng)和發(fā)病觀察：一些疫苗以適當(dāng)劑量及路徑接種試驗動物（本動物、雞胚）后，可產(chǎn)生經(jīng)典熱型反應(yīng)或特征癥狀及病理改變，借以判定疫苗效力。主要產(chǎn)品以下：山羊活疫苗、綿羊痘活疫苗、牛瘟活疫苗（Ⅰ）、牛瘟活疫苗（Ⅱ）、豬瘟活疫苗(I)、豬瘟活疫苗（II）、雞痘活疫苗（Ⅰ）、雞痘活疫苗（Ⅱ）。注：紅色字體疫苗表示可采取此方法，也可采取其它方法。常見病毒性產(chǎn)品安全檢驗和效力檢驗第26頁方法舉例：

牛瘟活疫苗效力檢驗：按瓶簽注明頭份，用生理鹽水稀釋為1ml含0.01個使用劑量，耳靜脈注射1.5-2kg家兔4只，每只1ml。應(yīng)出現(xiàn)經(jīng)典牛瘟兔化弱毒臨床反應(yīng)和病理改變。（癥狀：體溫升高，食欲減退，呼吸緊迫，鼻分泌物增多，精神不佳，懷孕后期母兔，間或流產(chǎn)；感染后3-14日可有死亡，內(nèi)臟可見顯著病理改