細(xì)胞培養(yǎng)的一點(diǎn)經(jīng)驗(yàn)

細(xì)胞培養(yǎng)的一點(diǎn)經(jīng)驗(yàn)第一頁(yè)，共三十八頁(yè)，2022年，8月28日消化傳代

第二頁(yè)，共三十八頁(yè)，2022年，8月28日

將培養(yǎng)液倒干凈，加入PBS輕輕沖洗以去除剩余培養(yǎng)液，然后加入胰酶，放置1至2min，倒掉胰酶，放入37℃，僅靠剩余胰酶消化。如果消化有困難，可以加入EDTA與胰酶協(xié)同作用。第三頁(yè)，共三十八頁(yè)，2022年，8月28日

傳代時(shí)，盡量避免吹打細(xì)胞，如果必須要吹打，動(dòng)作要輕柔不要用力過(guò)猛并避免氣泡出現(xiàn)，這些都對(duì)細(xì)胞有損傷。第四頁(yè)，共三十八頁(yè)，2022年，8月28日

氣泡對(duì)細(xì)胞的損傷表現(xiàn)在多個(gè)方面。第五頁(yè)，共三十八頁(yè)，2022年，8月28日

a.泡破裂的瞬間，與泡相連的細(xì)胞會(huì)受到相對(duì)較高的張力，這種張力的強(qiáng)度足以導(dǎo)致細(xì)胞膜的破裂；第六頁(yè)，共三十八頁(yè)，2022年，8月28日

b.當(dāng)泡沫移動(dòng)時(shí)，會(huì)對(duì)附著在上面的細(xì)胞產(chǎn)生牽引力，泡沫以不同的速度或向不同的方向移動(dòng)所產(chǎn)生的剪切力也會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的損傷。第七頁(yè)，共三十八頁(yè)，2022年，8月28日

c.此外，氣泡還可以導(dǎo)致與之接觸的細(xì)胞與培養(yǎng)液的接觸面積減少而營(yíng)養(yǎng)不足。第八頁(yè)，共三十八頁(yè)，2022年，8月28日凍存與復(fù)蘇

第九頁(yè)，共三十八頁(yè)，2022年，8月28日

選擇生長(zhǎng)狀態(tài)良好，處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞凍存；防凍劑可使用5－10％的DMSO或10－15％的甘油；

第十頁(yè)，共三十八頁(yè)，2022年，8月28日

凍存液中加入高濃度血清可以提高細(xì)胞的存活率，可加至50％～100％，即可以使用純血清加防凍劑作為凍存液。用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞，在復(fù)蘇時(shí)可以離心以去除血清。第十一頁(yè)，共三十八頁(yè)，2022年，8月28日

凍存速率不得大于10℃／min，最好為1℃／min：使用凍存盒；4℃，30min；－20℃，1h；－80℃，過(guò)夜；第十二頁(yè)，共三十八頁(yè)，2022年，8月28日

c.將凍存管用棉花、紗布和塑料泡沫嚴(yán)密包裹以達(dá)到良好隔溫效果，可以直接放入－80℃過(guò)夜；d.之后，細(xì)胞應(yīng)盡快轉(zhuǎn)入液氮。第十三頁(yè)，共三十八頁(yè)，2022年，8月28日

復(fù)蘇時(shí)應(yīng)迅速?gòu)?fù)溫，緩慢稀釋?zhuān)⒈ＷC較高的細(xì)胞密度。第十四頁(yè)，共三十八頁(yè)，2022年，8月28日

稀釋細(xì)胞時(shí)應(yīng)緩慢加入培養(yǎng)液，加入10ml培養(yǎng)液的時(shí)間應(yīng)不小于2分鐘。開(kāi)始時(shí)應(yīng)逐滴緩慢加入，稍后可逐漸加快。如果稀釋速度過(guò)快，可因?yàn)闈B透壓的改變導(dǎo)致細(xì)胞存活率至少下降50％。第十五頁(yè)，共三十八頁(yè)，2022年，8月28日

DMSO可以輕易透過(guò)各種合成的及天然的膜，包括橡膠和皮膚，可以將任何與之結(jié)合的物質(zhì)攜帶透過(guò)皮膚（即使戴著橡膠手套）。因此處理DMSO時(shí)應(yīng)小心并盡量避免與有毒物質(zhì)同時(shí)操作。第十六頁(yè)，共三十八頁(yè)，2022年，8月28日

復(fù)蘇時(shí)應(yīng)嚴(yán)格操作，避免污染：由于復(fù)蘇時(shí)與有菌環(huán)境接觸較多，如果操作不慎，污染的機(jī)會(huì)極大。因此在復(fù)溫之后，應(yīng)將凍存管浸泡在70％酒精中至少30s－1min，在超凈臺(tái)內(nèi)吹干后按復(fù)蘇常規(guī)步驟處理。第十七頁(yè)，共三十八頁(yè)，2022年，8月28日細(xì)胞的運(yùn)輸

第十八頁(yè)，共三十八頁(yè)，2022年，8月28日

凍存運(yùn)輸使用干冰置于塑料泡沫盒中，處理得當(dāng)，可以保存3天。一旦出現(xiàn)融解，細(xì)胞活力將急劇下降。將細(xì)胞凍存管?chē)?yán)密包裹，所用塑料泡沫盒應(yīng)該不小于300×300×300mm，壁的厚度約為50mm，內(nèi)部空間為200×200×200mm，這樣大的空間需放入5kg干冰。第十九頁(yè)，共三十八頁(yè)，2022年，8月28日

以最快的速度將細(xì)胞從液氮轉(zhuǎn)入干冰中，否則細(xì)胞將以10～20℃／min的速度升溫。絕對(duì)不能讓溫度高于－50℃。到達(dá)目的地后，即可按常規(guī)復(fù)蘇處理。第二十頁(yè)，共三十八頁(yè)，2022年，8月28日

活細(xì)胞運(yùn)輸細(xì)胞應(yīng)該處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期早期或中期，狀態(tài)良好。如果細(xì)胞密度過(guò)大，培養(yǎng)液會(huì)消耗過(guò)快，細(xì)胞也易于脫落。培養(yǎng)液應(yīng)該加滿(mǎn)，擰緊瓶蓋，這樣液體的晃動(dòng)幅度就不會(huì)太大。嚴(yán)密封緊瓶蓋邊緣，用防震材料包裹培養(yǎng)瓶。即可運(yùn)輸。運(yùn)輸標(biāo)簽上應(yīng)注明“易碎品”、“切勿冷凍”等字樣。

第二十一頁(yè)，共三十八頁(yè)，2022年，8月28日

到達(dá)目的地后，可將大部分培養(yǎng)液倒掉，余留正常量的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)至可以傳代時(shí)，換新的培養(yǎng)液。一般不要立刻更換新培養(yǎng)液，以免細(xì)胞不適應(yīng)。第二十二頁(yè)，共三十八頁(yè)，2022年，8月28日污染與防治

第二十三頁(yè)，共三十八頁(yè)，2022年，8月28日

對(duì)于一個(gè)剛剛接觸細(xì)胞培養(yǎng)的人，其所面臨的最大難題之一就是防止污染。而即使是經(jīng)驗(yàn)豐富的研究人員，有時(shí)也難以避免污染。

第二十四頁(yè)，共三十八頁(yè)，2022年，8月28日

操作技術(shù)方面：a.工作界面和設(shè)備不潔－－經(jīng)常清洗工作區(qū)域并消毒。b.培養(yǎng)液溢出到瓶口或超凈臺(tái)－－經(jīng)常用75％酒精擦拭超凈臺(tái)；轉(zhuǎn)移液體最好使用一定的移液設(shè)備（注射器，吸管等）；及時(shí)擦拭溢出物。c.拿吸管時(shí)位置過(guò)低，接觸瓶口或瓶塞內(nèi)部－－正確握持吸管，不要在敞開(kāi)的器皿上方操作。d.拿取物品的操作不規(guī)范－－應(yīng)注意拿取注射器、吸管、培養(yǎng)瓶、皿等的規(guī)范操作。所有無(wú)菌物品的操作都應(yīng)處于視野之內(nèi)，以避免無(wú)意識(shí)的污染。第二十五頁(yè)，共三十八頁(yè)，2022年，8月28日

d.向污物缸內(nèi)傾倒液體時(shí)位置不正確（過(guò)低）－－保持一定高度；在污物缸上加一個(gè)漏斗；使用負(fù)壓抽吸裝置。第二十六頁(yè)，共三十八頁(yè)，2022年，8月28日

e.皮膚的分泌物或附著物掉落到培養(yǎng)器皿中－－戴橡膠手套；不要在敞開(kāi)的器皿上方操作。

為避免在敞開(kāi)的器皿上方操作，應(yīng)注意以下方面：

1.培養(yǎng)無(wú)菌意識(shí)，及時(shí)將培養(yǎng)瓶蓋、離心管蓋擰好，將培養(yǎng)皿蓋好；

2.合理擺放超凈臺(tái)內(nèi)的物品，避免不必要的操作經(jīng)過(guò)敞開(kāi)的器皿上方。建議：不要一次性把過(guò)多的物品拿入超凈臺(tái)；臺(tái)內(nèi)物品以操作者為中心成弧形擺放，酒精燈放在與操作者正對(duì)的位置，左手使用的物品放在左邊，右手使用的物品放在右邊；哪只手向污物缸內(nèi)倒液體，就將污物缸放在哪邊。第二十七頁(yè)，共三十八頁(yè)，2022年，8月28日

f.工作臺(tái)內(nèi)的灰塵和溢出的液體－－在工作前，工作后都要用70％酒精擦拭臺(tái)面，工作中溢出的液體要立刻用70％酒精擦拭干凈。

第二十八頁(yè)，共三十八頁(yè)，2022年，8月28日

總之，規(guī)范的操作和良好的習(xí)慣可以最大限度的避免污染，也是細(xì)胞培養(yǎng)最基本的技術(shù)要求。要經(jīng)常注意向有經(jīng)驗(yàn)的細(xì)胞培養(yǎng)人員學(xué)習(xí)良好的操作習(xí)慣。第二十九頁(yè)，共三十八頁(yè)，2022年，8月28日

培養(yǎng)用耗材培養(yǎng)用液a.未滅菌的試劑－－高壓或過(guò)濾除菌。b.物品儲(chǔ)放區(qū)不潔－－經(jīng)常清潔并作滅菌處理。c.消毒過(guò)程不標(biāo)準(zhǔn)－－檢查高壓滅菌器是否工作正常；過(guò)濾后檢查濾膜是否破裂；滅菌后的液體仍需做無(wú)菌試驗(yàn)。d.一次性無(wú)菌用品不合格－－進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)或更換供應(yīng)商。第三十頁(yè)，共三十八頁(yè)，2022年，8月28日

取材：原代組織來(lái)源有污染－－不要把動(dòng)物帶入培養(yǎng)室處理；可能有污染的組織應(yīng)在酒精中浸泡30s－1min，在清洗用的PBS中加入抗生素。第三十一頁(yè)，共三十八頁(yè)，2022年，8月28日

玻璃器皿a.儲(chǔ)存時(shí)灰塵或細(xì)菌孢子進(jìn)入－－消毒后的器皿應(yīng)嚴(yán)密包裹，置于無(wú)菌物品專(zhuān)用放置區(qū)；未包裹物品放置不得超過(guò)24小時(shí)。b.高壓滅菌不徹底（一次放入物品過(guò)多或放置不正確，瓶蓋擰得過(guò)緊等）－－正確擺放高壓鍋內(nèi)的物品，保持瓶蓋微松。第三十二頁(yè)，共三十八頁(yè)，2022年，8月28日

培養(yǎng)瓶及培養(yǎng)用液瓶灰塵或細(xì)菌孢子－－細(xì)胞拿出超凈臺(tái)時(shí)應(yīng)擰緊瓶蓋；任何物品在進(jìn)入超凈臺(tái)前都要用酒精擦拭；懷疑污染者應(yīng)作無(wú)菌試驗(yàn)，一旦證實(shí)，應(yīng)重新消毒或丟棄。第三十三頁(yè)，共三十八頁(yè)，2022年，8月28日

設(shè)備和工作環(huán)境空氣空氣的渦流，灰塵和氣液混和物等－－經(jīng)常打掃、消毒，盡量減少工作區(qū)內(nèi)的活動(dòng)，與培養(yǎng)無(wú)關(guān)的工作不要在培養(yǎng)室內(nèi)進(jìn)行。第三十四頁(yè)，共三十八頁(yè)，2022年，8月28日

超凈臺(tái)a.濾網(wǎng)破裂－－經(jīng)常檢查濾膜是否有破裂。b.濾網(wǎng)需要更換－－檢查透過(guò)濾網(wǎng)的風(fēng)力是否正常。c.溢出的液體進(jìn)入工作臺(tái)下層或縫隙中－－經(jīng)常全面清洗消毒工作臺(tái)，讓酒精進(jìn)入縫隙。第三十五頁(yè)，共三十八頁(yè)，2022年，8月28日

CO2孵箱a.霉菌和細(xì)菌的生長(zhǎng)－－用清潔劑清洗并用75％酒精消毒；培養(yǎng)瓶在放入孵箱前應(yīng)用酒精擦