細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察

細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察第一頁，共二十四頁，2022年，8月28日一、活體細(xì)胞的觀察和攝影技術(shù)1.倒置顯微鏡：P60圖3-3（提問光鏡使用注意）

適用：觀察貼壁生長的培養(yǎng)中細(xì)胞

構(gòu)造特點(diǎn)：因物鏡置于觀察標(biāo)本下方而得名

技巧：調(diào)弱光亮度，集光器稍遠(yuǎn)些，增大光線反差，對正光軸；攝影時(shí)，使觀察物稍偏遠(yuǎn)離焦點(diǎn)，照片會(huì)更清晰。底片選用正片，反差大第二頁，共二十四頁，2022年，8月28日2.相差顯微鏡P62圖3-4

適用：可增強(qiáng)活細(xì)胞同背底反差，幫助看清細(xì)胞的輪廓和細(xì)胞內(nèi)細(xì)微結(jié)構(gòu)，如：核仁、染色質(zhì)、線粒體等。

構(gòu)造特點(diǎn)：有兩個(gè)附加構(gòu)件：相差接物鏡：其光學(xué)系統(tǒng)中有一個(gè)光環(huán)透鏡相差聚光器：內(nèi)有數(shù)個(gè)相位板，使用時(shí)與物鏡倍數(shù)一致

技巧：細(xì)胞培養(yǎng)瓶質(zhì)地均勻透明較好，最好用塑料瓶；觀察攝影時(shí)，瓶壁要擦凈；光軸對正，照明度適宜，摸索試調(diào)至最佳第三頁，共二十四頁，2022年，8月28日3.熒光顯微鏡P67圖3-6

適用：觀察細(xì)胞內(nèi)天然的熒光物質(zhì)，如維生素、脂褐素、核黃素等，也可觀察可與熒光染料結(jié)合的細(xì)胞組分。

構(gòu)造特點(diǎn)：與普通光鏡比，區(qū)別在于用高壓汞燈光源，波長可激發(fā)熒光物質(zhì)產(chǎn)生熒光；濾光片不同。

技巧：觀察必須是自發(fā)熒光或經(jīng)熒光染色的標(biāo)本；選用效果最好的濾光片；熒光標(biāo)本易褪色，不能長期保存，觀察操作要迅速，作好記錄；儀器的高壓汞燈光源啟動(dòng)后15分鐘內(nèi)不得關(guān)閉，關(guān)閉后，燈冷卻后方可再起動(dòng)，否則壽命大減，長時(shí)間觀察標(biāo)本時(shí)，需帶護(hù)目鏡。第四頁，共二十四頁，2022年，8月28日4.暗視野顯微鏡P64圖3-5

適用：觀察記錄活細(xì)胞或細(xì)胞器的運(yùn)動(dòng)軌跡，提高分辨率

構(gòu)造特點(diǎn)：只有聚光器不同于普通顯微鏡，設(shè)有一個(gè)中央遮光板使照明光線不能直射。 標(biāo)本進(jìn)入目鏡，只許標(biāo)本散射光進(jìn)入目 鏡技巧：物鏡的數(shù)值孔徑必小于聚光器的數(shù)值孔徑；蓋玻片，載玻片應(yīng)清潔無痕；聚光鏡和載玻片之間加香柏油，保證效果。第五頁，共二十四頁，2022年，8月28日二.顯微攝影技術(shù)p681.概念：顯微攝影術(shù)是利用顯微攝影裝置拍攝顯微鏡視野的物象的技術(shù)。2.技術(shù)類型：膠片相機(jī)攝像數(shù)碼相機(jī)攝像

CCD圖像采集三者前期操作一致，但成像和圖像存儲原理不同。第六頁，共二十四頁，2022年，8月28日3.圖像記錄原理：

膠片相機(jī)攝像：顯微攝影時(shí)，光線自標(biāo)本片的微小物件射入物鏡后，造成一個(gè)倒立的放大實(shí)像，經(jīng)目鏡進(jìn)一步放大后，投射在照相底片上，使底片感光而記錄下顯微鏡視野下物象。

數(shù)碼相機(jī)攝像：是以數(shù)字的形式用電子設(shè)備儲存圖像。拍照后，可通過數(shù)據(jù)線將所拍攝圖像傳輸?shù)诫娔X，也可將相機(jī)的存儲卡取出，通過讀卡器將拍攝的圖像傳輸?shù)诫娔X上。第七頁，共二十四頁，2022年，8月28日數(shù)碼相機(jī)攝像原理與CCD圖像采集器相同。

CCD圖像傳感器：即CCD(chargecopledDevice,感光耦合組件）

CCD的組成結(jié)構(gòu)有三個(gè)層次：上層：聚光鏡片（增光鏡片）中層：一個(gè)類似馬賽克的網(wǎng)絡(luò)（分色網(wǎng)絡(luò)）下層：墊在下層的電子線路矩陣（感應(yīng)線路是可記錄光線變化的半導(dǎo)體）第八頁，共二十四頁，2022年，8月28日

CCD工作方式之一：當(dāng)數(shù)碼相機(jī)的快門開啟，來自影像的光線穿過，這些馬賽克會(huì)讓感光點(diǎn)的=氧化硅材料釋放出電子（正電）與電洞（負(fù)電）。經(jīng)由外部加入電壓，這些電子和電洞會(huì)被轉(zhuǎn)移到不同極性的另一個(gè)硅區(qū)暫存。電子數(shù)的多寡和曝光點(diǎn)所接受的光量成正比。在一個(gè)影像最明亮部位，可有十萬電子被積存起來。第九頁，共二十四頁，2022年，8月28日CCDIMAGESENSOR外形第十頁，共二十四頁，2022年，8月28日彩色CCD的組成結(jié)構(gòu)分圖CCD的三層結(jié)構(gòu)：上：增光鏡片、中：色塊網(wǎng)格下：感應(yīng)線路由微型鏡頭、馬賽克分色網(wǎng)格，及墊于最底層的電子線路矩陣所組成第十一頁，共二十四頁，2022年，8月28日4.拍攝技術(shù)步驟：膠片相機(jī)拍攝：p69-74(生物教研室李相偉）數(shù)碼相機(jī)拍攝：p74-75(同上）

CCD圖像采集：（病理教研室姚海濤（實(shí)驗(yàn)中心劉君星）第十二頁，共二十四頁，2022年，8月28日5.縮時(shí)顯微攝影術(shù)

適用：記錄細(xì)胞或細(xì)胞器連續(xù)動(dòng)態(tài)變化過程正常時(shí)態(tài)連續(xù)拍照縮時(shí)逐格拍照主要裝備：倒置顯微鏡，16mm攝影機(jī)，自控縮時(shí)啟動(dòng)拍攝裝置。原理：縮時(shí)間隔時(shí)間：目標(biāo)物實(shí)際活動(dòng)時(shí)間

X1/24

影片排成后要求放鏡時(shí)間

=3600秒／10秒x1／24=15秒

所以，每隔15秒攝取1張照片。第十三頁，共二十四頁，2022年，8月28日三、光鏡下的固定細(xì)胞觀察法（組胚，病理）細(xì)胞器培養(yǎng)皿內(nèi)鋪蓋片單層培養(yǎng)取蓋片細(xì)胞懸液離心沉淀涂片固定染色觀察拍照

（固定劑，染色劑知識介紹）固定劑的作用：穿透，固定，保形，防腐固定劑的選擇：P83第十四頁，共二十四頁，2022年，8月28日細(xì)胞內(nèi)組分的差異染色。染色劑的選擇：Giemsa—染色體桃紅色。本書P84Feulgen—DNA紫紅色，細(xì)胞質(zhì)綠色。鄂P141吖啶橙—RNA紅色，DNA亮綠色。本書P86蘇木精-伊紅（HE)—細(xì)胞核藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)紅色本書P85過碘酸席夫—細(xì)胞內(nèi)含糖原區(qū)—紫紅色。章P58蘇丹紅III—細(xì)胞內(nèi)含脂肪區(qū)—橘紅色。章P59鬼筆環(huán)肽—溦絲染色。章P59免疫熒光法—溦管染色。章P60聯(lián)苯胺+H2O2—過氧化氫體染色。小章P37詹納斯綠B—活體細(xì)胞線粒體。小章P43

第十五頁，共二十四頁，2022年，8月28日四、激光掃描共聚焦顯微鏡技術(shù)（實(shí)驗(yàn)中心）1.概念和原理P76

lasterscanningconfocalmicroscopeLSCM激光共聚焦顯微鏡是20世紀(jì)80年代以來發(fā)展起來的一項(xiàng)細(xì)胞生物學(xué)和高分子材料科學(xué)領(lǐng)域的高科技分析儀器。第十六頁，共二十四頁，2022年，8月28日其在傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡基礎(chǔ)上，利用激光作為光源，經(jīng)照明針孔可形成點(diǎn)光源照射熒光樣品，所產(chǎn)生的激發(fā)光斑被探測器針孔以共軛的形式接收于同一焦平面上，可通過計(jì)算機(jī)控制顯微鏡移動(dòng)，以實(shí)現(xiàn)在同一焦平面（x-y)上的逐點(diǎn)掃描。計(jì)算機(jī)以像點(diǎn)的方式在計(jì)算機(jī)屏幕上形成圖像。 同時(shí)，也可沿z軸方向逐漸改變焦平面，完成對樣品厚片不同層面的掃描，進(jìn)行類似CT斷層掃描的無損傷連續(xù)光學(xué)切片，經(jīng)計(jì)算機(jī)三維重建處理，可形成觀察標(biāo)本的三維結(jié)構(gòu)圖形。第十七頁，共二十四頁，2022年，8月28日2.LSCM的主要組成部分及工作原理①激光光源:氫離子激光,能同時(shí)/順序/分別輸出紫外光和可見光②照明針孔:使激光通過照明針孔后形成點(diǎn)光源,點(diǎn)光源具有方向性強(qiáng),發(fā)散小、亮度高等優(yōu)點(diǎn)③光束分離器：可將樣品經(jīng)點(diǎn)光源照射所激發(fā)的熒光與其它非信號光線分開，排除非信號光線干擾，提高分辨率和清晰度。④物鏡⑤焦平面：激光點(diǎn)光源照射標(biāo)本樣品，激發(fā)樣品發(fā)射熒光，形成焦點(diǎn)光斑，在焦平面處聚焦成像。第十八頁，共二十四頁，2022年，8月28日⑥探測器針孔：起到空間濾波器作用。阻斷非聚焦平面散色光和焦平面上非焦點(diǎn)光斑散色光。保證樣品所衍射的聚焦光斑和探測器針孔的成像光斑，包含相同信息。（兩點(diǎn)共扼聚焦）⑦光電倍增器：接受通過探測器針孔的光信號，轉(zhuǎn)換成電信號后轉(zhuǎn)輸至計(jì)算機(jī)，在屏幕上形成焦平面圖形⑧多熒光通道:可以同時(shí)對樣品進(jìn)行多種熒光標(biāo)記的信號檢測⑨計(jì)算機(jī)控制系統(tǒng)：控制步動(dòng)電動(dòng)機(jī)帶動(dòng)顯微鏡移動(dòng)，實(shí)現(xiàn)在同一焦面(x-y軸)上逐點(diǎn)掃描；控制共聚焦系統(tǒng)；控制沿z軸改變焦平面，進(jìn)行對樣品厚度的連續(xù)光學(xué)切片和對樣品結(jié)構(gòu)的三維重建；控制信號的采集、轉(zhuǎn)輸、分析。第十九頁，共二十四頁，2022年，8月28日3.LSCM相對光學(xué)顯微鏡的優(yōu)點(diǎn)①LSCM的圖像是以電信號形式記錄下來的，可用電子計(jì)算機(jī)技術(shù)模擬數(shù)字化處理②利用共聚焦系統(tǒng)有效排除了焦點(diǎn)外信號干擾，不僅提高了x-y軸焦平面分辨率和清晰度，而且可對觀察樣品進(jìn)行z軸無損傷光切片，實(shí)現(xiàn)三維結(jié)構(gòu)的定位成像③可廣泛應(yīng)用于活細(xì)胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)，定量、定性、定位分析。與熒光探針技術(shù)結(jié)合，可進(jìn)行單細(xì)胞分選和多種細(xì)胞分子生物學(xué)研究及細(xì)胞機(jī)能學(xué)研究第二十頁，共二十四頁，2022年，8月28日4.LSCM的應(yīng)用①貼壁細(xì)胞的分選數(shù)量較多細(xì)胞群的分選:在特別培養(yǎng)皿上一類細(xì)胞群經(jīng)熒光染色，另一類細(xì)胞群未經(jīng)染色，可用高能激光把熒光染色的細(xì)胞群殺死，而另一類保存，可繼續(xù)培養(yǎng)。少量或單克隆細(xì)胞的分選：對于選中的突變細(xì)胞、雜交細(xì)胞或腫瘤轉(zhuǎn)移細(xì)胞，可利用鋪有特制膜的培養(yǎng)皿上，在選中的細(xì)胞克隆周圍切割成八角帶，再用高能激光殺傷八角帶之外的細(xì)胞。第二十一頁，共二十四頁，2022年，8月28日②細(xì)胞形態(tài)學(xué)研究：可行X-Y焦平面形態(tài)研究，尤其是可行工z軸三維形態(tài)結(jié)構(gòu)研究。可對細(xì)胞形狀，周長，面積，平均熒光強(qiáng)度，也可對細(xì)胞內(nèi)溶酶體，線粒體，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，細(xì)胞骨架，結(jié)構(gòu)性蛋白形態(tài)、數(shù)量、位置的描述。③細(xì)胞內(nèi)某些大分子組分分析：與免疫熒光技術(shù)和熒光探針技術(shù)相結(jié)合，可對細(xì)胞內(nèi)蛋白、DNA、RNA、酶、受體等組份進(jìn)行定性定量定時(shí)定位分析，以及細(xì)胞內(nèi)PH和細(xì)胞內(nèi)某些離子進(jìn)行分析。用于細(xì)胞機(jī)能學(xué)研究。細(xì)胞通訊研究。④細(xì)胞機(jī)能學(xué)研究及細(xì)胞通訊研究⑤細(xì)胞顯微外科手術(shù)：在LSCM鏡下可將激光作光子刀使用進(jìn)行細(xì)胞穿孔、染色體精切，細(xì)胞器燒灼，神經(jīng)元突觸切除，細(xì)胞器轉(zhuǎn)移等手術(shù)。第二十二頁，共二十四頁，2022年，8月28日五、電鏡觀察法P78分辨率：肉眼0.1mm光鏡（油鏡）0.2um

電鏡可達(dá)0.08nm培養(yǎng)細(xì)胞的電鏡觀察途徑透射電鏡觀察內(nèi)部結(jié)構(gòu)原位切片組織消化分離后切掃描電鏡觀察c表面結(jié)構(gòu)原位掃描觀察