色譜分離過程課件最終2

色譜分離過程課件最終版演示文稿當前1頁，總共73頁。優(yōu)選色譜分離過程課件最終版當前2頁，總共73頁。概述色譜分離過程的基本原理色譜的分類色譜分離過程基礎理論色譜技術的應用當前3頁，總共73頁。

1.概述-發(fā)展關于色譜分離方法的研究始于1901年，俄國植物學家Tswett（茨維特）在研究植物葉子的組成時，用碳酸鈣填充豎立的玻璃管，以石油醚洗脫植物色素的提取液，經(jīng)過一段時間洗脫之后，植物色素在碳酸鈣柱中實現(xiàn)分離，由一條色帶分散成三種顏色的6個色帶。兩年后他發(fā)表了他的研究成果“一種新型吸附現(xiàn)象及其在生化分析上的應用”，提出了應用吸附原理分離植物色素的新方法，在這一方法中把玻璃管叫做“色譜柱”，碳酸鈣叫做“固定相”，石油醚叫做“流動相”。三年后，他將這種方法命名為色譜法（Chromatography）。當前4頁，總共73頁。色譜法于二十世紀五十年代之后飛速發(fā)展，并發(fā)展出一個獨立的三級學科-色譜學。1952年英國科學家阿切爾·馬丁、理查德·辛格因發(fā)明了分配色譜法而共同獲得諾貝爾化學獎，此外色譜分析方法還在12項獲得諾貝爾化學獎的研究工作中起到關鍵作用。當前5頁，總共73頁。

1.概述-色譜分離的特點應用范圍廣復雜混合物，有機同系物，異構體，手性異構體。氣相色譜：沸點低于400℃的各種有機或無機試樣的分析。液相色譜：高沸點、熱不穩(wěn)定、生物試樣的分離分析。分離效率高若用塔板理論數(shù)來表示色譜柱的效率，每米柱長可達幾千至幾十萬的塔板數(shù)，特別適用于極復雜混合物的分離，且通常收率、產(chǎn)率、和純度都較高。操作模式多樣可通過選擇不同的操作模式，以適應不同樣品的分離。靈敏度高可以檢測出μg.g-1(10-6)級甚至ng.g-1(10-9)級的物質(zhì)量。當前6頁，總共73頁。2.色譜分離過程的基本原理

色譜分離的幾個概念所有的色譜分離操作均分為：裝柱、上樣、層析、洗脫。其中的固定不動的相，稱為固定相；攜帶試樣混合物流過此固定相的流體，稱為流動相；作為流動相的液體或氣體，稱為洗脫劑；洗脫時從柱中流出的溶液，稱為洗脫液；加入洗脫劑使各組分分層的操作，叫層析，也叫展開。當前7頁，總共73頁。分離原理

色譜過程的本質(zhì)是待分離物質(zhì)分子在固定相和流動相之間分配平衡的過程，不同的物質(zhì)在兩相之間的分配會不同，這使其隨流動相運動速度各不相同，隨著流動相的運動，混合物中的不同組分在固定相上相互分離。不同組分在色譜分離過程中分離情況取決于各組分在兩相間的分配系數(shù)、吸附能力、親和力等的差異。當前8頁，總共73頁。常用的固定相（色譜柱填料）硅膠活性炭離子交換樹脂大孔吸附樹脂氧化鋁凝膠纖維素衍生物環(huán)糊精聚丙烯酰胺當前9頁，總共73頁。硅膠：應用廣泛，適合各類成分氧化鋁：主要用于堿性或中性親脂性成分，如生物堿、甾體、萜類等活性炭:用于水溶性氨基酸、糖類及苷類聚酰胺：主用于酚類、醌類如黃酮類、蒽醌類及鞣質(zhì)等成分當前10頁，總共73頁。3.色譜的分類按兩相狀態(tài)氣固色譜、氣液色譜、液固色譜、液液色譜按固定相幾何形式柱色譜、紙色譜、薄層色譜按分離原理吸附色譜、分配色譜、離子交換色譜、凝膠色譜、排阻色譜、親和色譜當前11頁，總共73頁。吸附色譜凝膠過濾色譜離子交換色譜大孔樹脂色譜分配色譜色譜分離法當前12頁，總共73頁。吸附色譜物理吸附：硅膠、氧化鋁、活性炭為吸附劑進行的吸附色譜；化學吸附：黃酮等酚酸性物質(zhì)被氧化鋁吸附、生物堿被酸性硅膠吸附等；半化學吸附：聚酰胺與黃酮類、醌類等酚性化合物之間的氫鍵吸附，吸附力較弱，介于物理吸附與化學吸附之間。常用的極性吸附劑：硅膠、氧化鋁。常用的非極性吸附劑：活性炭。當前13頁，總共73頁。凝膠過濾色譜（凝膠滲透色譜、分子篩濾過色譜、排阻色譜）原理：分子篩作用葡聚糖凝膠（sephadexG）羥丙基葡聚糖凝膠(sephadexLH-20)凝膠過濾色譜當前14頁，總共73頁。當前15頁，總共73頁。離子交換樹脂法原理：可交換離子與樹脂上的交換基團進行離子交換，并被吸附，用適當?shù)娜軇闹舷疵撓聛恚瑢崿F(xiàn)物質(zhì)的分離。吸附規(guī)律陽離子交換樹脂—分離堿性成分陰離子交換樹脂—分離酸性成分當前16頁，總共73頁。大孔吸附樹脂吸附性和分子篩原理相結合以苯乙烯為母體，二乙烯苯為交聯(lián)劑（非極性）吸附力：范德華力或氫鍵工藝流程：樹脂預處理→樹脂上柱→藥液上柱→樹脂的解吸→樹脂的清洗、再生。當前17頁，總共73頁。當前18頁，總共73頁。分配色譜原理：被分離成分在固定相和流動相之間的分配系數(shù)不同。正相分配色譜：流動相極性<固定相極性反相分配色譜：流動相極性>固定相極性HPLC、MPLC、LPLC當前19頁，總共73頁。4.色譜分離過程理論基礎隨著色譜技術的發(fā)展，為了解釋色譜分離現(xiàn)象，指導色譜技術的發(fā)展，許多研究者對色譜基礎理論進行了不懈的研究，提出了多種色譜過程的理論。主要有速率方程理論、平衡色譜理論、

塔板理論、軸向擴散理論。當前20頁，總共73頁。4.色譜分離過程理論基礎塔板理論由馬?。∕artin）和欣革（Synge）最早提出將色譜柱比作蒸餾塔，把一根連續(xù)的色譜柱設想成由許多小段組成。在每一小段內(nèi)，一部分空間被固定相占據(jù)，而另一部分空間充滿流動相。組分隨流動相進入色譜柱后，就在兩相間進行分配。在每一個塔板內(nèi)組分分子在固定相和流動相之間形成平衡，隨著流動相的流動，組分分子不斷從一個塔板移動到下一個塔板，并不斷形成新的平衡。一個色譜柱的塔板數(shù)越多，其分離效果就越好。當前21頁，總共73頁。4.色譜分離過程理論基礎-保留值保留時間（tR）：從進樣到某個組分的色譜峰頂點之間的時間間隔死時間（tM）：不被固定相滯留的組分從進樣開始、通過色譜柱、到出現(xiàn)峰最大值所需要的時間。調(diào)整保留時間（tR＇）：tR＇=tR－tM保留值是色譜過程的基本熱力學參數(shù)之一。在相同的操作條件下，不同的物質(zhì)有各自固有的保留時間，因此它也是色譜定性的基本依據(jù)。當前22頁，總共73頁。峰寬Wb：色譜峰拐點處的兩條切線與基線的兩個交點之間的距離；半峰寬Y1/2：峰高一半處對應的峰寬，為2.35

；相鄰色譜峰峰頂之間的距離除以此二色譜峰的平均寬度。用R表示：分離度當前23頁，總共73頁。定性時要求：R=1.0（相鄰兩峰分離程度98%）定量時要求：R=1.5（相鄰兩峰分離程度99.7%，基線分離，作為完全分離的標準）。一般將R≥1作為色譜能較好分離的判據(jù)。當前24頁，總共73頁。柱效率實際工作中，塔板數(shù)的計算用下列公式：

而理論塔板數(shù)的計算公式為：

n=L/H其中L為色譜柱的柱長；H為理論板高度。當前25頁，總共73頁。

考慮到組分在死時間內(nèi)不參與柱內(nèi)分配，用調(diào)整保留時間代替保留時間，得有效塔板數(shù)和有效塔板高度：當前26頁，總共73頁。5.色譜分離的應用色譜法的應用可以根據(jù)目的分為分析性色譜和制備性色譜兩大類。分析性色譜的目的是定量或者定性測定混合物中各組分的性質(zhì)和含量。定性的分析性色譜有薄層色譜、紙色譜等，定量的分析性色譜有氣相色譜、高效液相色譜等。制備性色譜的目的是分離混合物，獲得一定數(shù)量的純凈組分。當前27頁，總共73頁。5.色譜分離的應用薄層色譜（TLC）氣相色譜法（GC）高效液相色譜（HPLC）典型制備色譜當前28頁，總共73頁。1938年俄國人首先實現(xiàn)了在氧化鋁薄層上分離一種天然藥物。1965年德國化學家Stahl出版了“薄層色譜法”一書，推動了這一技術的發(fā)展。因TLC法設備簡單，分析速度快，分離效率高，結果直觀，很快被用作定性和半定量的方法。70年代中后期發(fā)展了高效薄層色譜。80年代以后發(fā)展了薄層色譜光密度掃描儀，和各步操作的儀器化，并實現(xiàn)了計算機化。薄層層析流動相的移動是依靠毛細作用。薄層色譜（TLC）當前29頁，總共73頁。當前30頁，總共73頁。比移值（Rf值）:用來表征斑點位置的基本參數(shù)是保留因子，通常稱作比移值，用Rf表示。當前31頁，總共73頁。顯色方法日光下觀察,劃出有色物質(zhì)的斑點位置在紫外燈下(254nm或365nm),觀察有無熒光的產(chǎn)生,用硅膠G板熒光淬滅法,適用于有紫外吸收的物質(zhì)，用GF254板顯色劑顯色,破壞性檢出方法當前32頁，總共73頁。常用顯色劑硫酸硫酸-水；硫酸-甲醇/乙醇；0.5%碘的氯仿溶液對很多化合物顯黃棕色中性0.05%高錳酸鉀溶液易還原性化合物在淡紅色背景上顯黃色堿性高錳酸鉀試劑還原性化合物在淡紅色背景上顯黃色當前33頁，總共73頁。優(yōu)點：設備簡單、操作方便、運行費用低；分離時間短，工作效率高；展開劑選擇范圍廣，展開方式多樣；顯色方便，檢測手段豐富；既可分析，又可制備；試樣一般不需要經(jīng)過嚴格預處理即可分離。

缺點：

分離效率較低；不適用揮發(fā)性試樣分離；定性定量不便。當前34頁，總共73頁。

TLC的應用1.用于柱層析后相同組分的合并2.有機合成監(jiān)控反應，摸索最佳條件3.制備有機化合物4.中藥材的鑒定在中華人民共和國藥典中，共有超過約600種化學合成藥和超過約400種中藥的質(zhì)量控制應用了高效液相色譜的方法。

當前35頁，總共73頁。5.色譜分離的應用薄層色譜（TLC）氣相色譜法（GC）高效液相色譜（HPLC）典型制備色譜當前36頁，總共73頁。1953年阿切爾·馬丁和A.T.詹姆斯發(fā)明了氣相色譜法。當前37頁，總共73頁。GC：以氣體（即載氣）為流動相的柱色譜分離技術。GC中常用作的載氣的氣體有N2、He、H2、Ar，均為惰性氣體。GC載氣的功能僅僅是攜帶試樣、洗脫組分。GC的選擇性主要取決于固定相和組分分子間的作用，所以可通過改變固定相來改變GC的選擇性。氣相色譜儀-GC當前38頁，總共73頁。氣相色譜儀流程（圖）氣路系統(tǒng)進樣系統(tǒng)分離系統(tǒng)（色譜柱系統(tǒng)）檢測系統(tǒng)數(shù)據(jù)處理和控制系統(tǒng)（含溫控系統(tǒng)）當前39頁，總共73頁。樣品進樣汽化色譜柱分離檢測器信號記錄載氣當前40頁，總共73頁。進樣系統(tǒng)由進樣器和氣化室構成。液體樣品—微量注射器氣體樣品—六通閥、微量注射器氣化室溫度：要保證樣品瞬間、完全氣化，一般高于沸點50℃以上，但也不宜太高，以防分解當前41頁，總共73頁。柱溫的選擇柱溫應低于固定液的最高使用溫度；柱溫過高，易造成固定液流失、檢測器噪聲變大、基線漂移。柱溫一般選擇接近或略高于組分的平均沸點。降低柱溫可在一定程度內(nèi)改善分離；升高柱溫可加快分析速度。組分復雜，沸程寬（80-100℃）的試樣，采用程序升溫。當前42頁，總共73頁。對檢測器的要求穩(wěn)定性好、噪聲低；靈敏度高；線性范圍寬；死體積小，響應快當前43頁，總共73頁。噪聲和漂移噪聲（N）：在沒有樣品進入檢測器時，基線在短期內(nèi)發(fā)生的波動。噪聲的來源：固定液的流失、載氣的不純，電子元件不穩(wěn)定、溫度變化、外磁場干擾等?；€漂移：基線在一定時間內(nèi)產(chǎn)生的單向、緩慢移動。良好的檢測器其噪聲與漂移都應很小。當前44頁，總共73頁。GC的特點1.優(yōu)點分離效率高（填充柱上千塊塔板）分析速度快樣品用量少（檢測限低，高靈敏檢測器）2.缺點：（約20%樣品適用）樣品須能氣化（350℃下有一定的揮發(fā)性）熱穩(wěn)定性要好定性困難當前45頁，總共73頁。5.色譜分離的應用薄層色譜（TLC）氣相色譜法（GC）高效液相色譜（HPLC）典型制備色譜當前46頁，總共73頁。高效液相色譜儀高效液相色譜是20世紀60年代末發(fā)展的一種以液體為流動相的色譜技術。特點如下：高壓一般可達（150~350）×105Pa高速一般可達1~10mL/min高效高靈敏度分析時使用樣品少一般僅幾毫升當前47頁，總共73頁。高效液相色譜儀流程（圖）1．貯液罐（濾棒，可濾去顆粒狀物質(zhì)）2．高壓泵（輸液泵）3．進樣裝置4．色譜柱——分離5．檢測器——分析6．廢液出口或組分收集器7．記錄裝置當前48頁，總共73頁。貯液器高壓泵梯度洗脫裝置進樣器色譜柱記錄儀數(shù)據(jù)處理機檢測器組分收集器試樣壓力表輸液系統(tǒng)當前49頁，總共73頁。流動相脫氣的方法超聲波振蕩脫氣惰性氣體鼓泡吹掃脫氣在線（真空）脫氣當前50頁，總共73頁。HPLC用水專門的純水機或超純水機；二次或三次重蒸水；市場上瓶裝的純凈水或蒸餾水；其它途徑；當前51頁，總共73頁。流動相溶劑的要求溶劑對于待測樣品必須具有合適的極性和良好的選擇性。溶劑要與檢測器匹配對于紫外吸收檢測器，應注意選用檢測器波長比溶劑的紫外截止波長要長。對于折光率檢測器，要求選擇與組分折光率有較大差別的溶劑作流動相，以達最高靈敏度。高純度由于高效液相靈敏度高，對流動相溶劑的純度也要求高?；瘜W穩(wěn)定性好低粘度若使用高粘度溶劑，勢必增高壓力，不利于分離。常用的低粘度溶劑有丙酮、乙醇、乙睛等。當前52頁，總共73頁。洗脫方式等度洗脫用恒定配比的溶劑系統(tǒng)洗脫梯度洗脫在一個分析周期內(nèi)，按一定程序不斷改變流動相的濃度配比。優(yōu)點：縮短分析周期；提高分離效果；改善峰形；增加檢測靈敏度。缺點：有時引起基線漂移；重復性不佳。當前53頁，總共73頁。HPLC色譜柱類型類型內(nèi)徑D(cm)柱長(cm)粒徑(μm)分析柱0.3–0.463-253-10半制備柱0.8–1.010-255-20制備柱2.0–5.010-255-20當前54頁，總共73頁?；瘜W鍵合相利用化學反應將不同的有機官能團通過共價鍵鍵合到載體硅膠表面的游離羥基上而形成的固定相。種類非極性鍵合相：如鍵合C18、C8、苯基等，其中十八烷（ODS或C18）鍵合相是常用的代表，可完成HPLC分析任務的80%。中等極性鍵合相：如鍵合醚基，可分離能形成氫鍵的化合物（如酚類）當前55頁，總共73頁。評價色譜柱好壞的標準1）理論塔板數(shù)n2）拖尾因子Tf3)色譜柱批與批之間的重現(xiàn)性4）pH值的適用范圍5）使用壽命當前56頁，總共73頁。拖尾因子Tf不對稱因子(As)=BAA拖尾因子(Tf)=A+B2A10%峰高5%峰高當前57頁，總共73頁。對理想檢測器的要求高靈敏度；適用范圍廣，對所有組分都有響應；溫度、流動相流速的變化對響應沒有影響；可梯度洗脫，響應與流動相的組成無關；死體積??；使用方便、可靠、耐用；線性范圍寬；響應時間快；當前58頁，總共73頁。常用檢測器紫外檢測器（UV）熒光檢測器（FD）示差折光檢測器（RID）蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD）當前59頁，總共73頁。紫外檢測器（UV）配置最普遍；主要用于檢測具有π-π、p–π共軛結構的化合物，如芳烴、稠環(huán)芳烴等；靈敏度高；可用于梯度洗脫

缺點：只能檢測有紫外吸收的樣品；（衍生化解決）對流動相的選擇有一定的限制；（截止波長）當前60頁，總共73頁。熒光檢測器（FD）適用于能產(chǎn)生熒光的化合物；主要用于氨基酸、多環(huán)芳烴等樣品；靈敏度極高（比紫外高1~3個數(shù)量級），適用于痕量分析；可梯度洗脫

缺點：許多化合物不產(chǎn)生熒光（可衍生化解決）；當前61頁，總共73頁。示差折光檢測器（RID）通用性好；對糖類分析靈敏度尚可；缺點：靈敏度低（比紫外低3個數(shù)量級）；不能梯度洗脫（否則，基線會漂移）當前62頁，總共73頁。蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD）20世紀90年代新開發(fā)；是示差折光檢測器的理想替代品，對葡萄糖最小檢出量5ng；高靈敏；可梯度洗脫；缺點：對有紫外吸收的樣品，檢測靈敏度較低；當前63頁，總共73頁。檢測器比較

紫外

熒光示差折光蒸發(fā)光散射測量參數(shù)吸光度熒光強度折射率質(zhì)量類型選擇型選擇型通用型通用型梯度洗脫可以可以不可以可以最小檢出量約1ng約1pg約1μg0.1~10ng當前64頁，總共73頁。HPLC定性、定量分析定性分析利用保留值定性；色譜-光譜聯(lián)用定性；

利用餾分收集器收集后，再用光譜定性；定量分析歸一化少用外標法內(nèi)標法當前65頁，總共73頁。HPLC與GC比較GC：適于能氣化、熱穩(wěn)定性好的樣品；約占有機物的20%；HPLC：不受樣品揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制，對分子量大、難氣化、熱穩(wěn)定性差的樣品均可檢測，約占有機物的80%。當前66頁，總共73頁。5.色譜分離的應用薄層色譜（TLC）氣相色譜法（GC）高效液相色譜（HPLC）典型制備色譜當前67頁，總共73頁。典型制備色譜制備色譜是適應科技和生產(chǎn)需要發(fā)展起來的一種新型、高效、節(jié)能的分離技術，目前在工業(yè)生產(chǎn)中應用的色譜分離技術主要是中、高壓液相色譜。由于新的高選擇性能固定相的開發(fā)，新型色譜技術的出現(xiàn)，以及色譜機制、色譜柱放大效應理論及相關數(shù)學模型研究的不斷深入，使色譜分離取得了長足的發(fā)展。同時新的概念如S