CART聯(lián)合移植治療

CART聯(lián)合移植治療第1頁/共39頁

復(fù)發(fā)性白血病診斷標(biāo)準(zhǔn)（符合下列條件之一）誘導(dǎo)化療獲得CR的AL患者骨髓原始細(xì)胞大于5％但少于20％，經(jīng)過一療程標(biāo)準(zhǔn)化療未獲得完全緩解。誘導(dǎo)化療獲得CR的AL患者骨髓原始細(xì)胞大于20％。髓外出現(xiàn)白血病細(xì)胞浸潤。第2頁/共39頁難治性白血病的主要原因白血病細(xì)胞對化療藥物產(chǎn)生耐受原發(fā)耐藥：化療之前即存在繼發(fā)耐藥：反復(fù)化療誘導(dǎo)白血病細(xì)胞產(chǎn)生耐藥正常造血干細(xì)胞功能衰竭第3頁/共39頁難治性白血病的治療原則常用的方法使用無交叉耐藥的新藥組成聯(lián)合化療方案中、大劑量化療臨床試驗異基因造血干細(xì)胞移植使用耐藥逆轉(zhuǎn)劑新的靶向治療藥物或生物治療第4頁/共39頁復(fù)發(fā)、難治性AML患者的治療選擇大劑量Ara-C再誘導(dǎo)治療中劑量Ara-C為基礎(chǔ)的方案（FLAG或聯(lián)合蒽環(huán)、蒽醌類藥物）再誘導(dǎo)治療二線藥物再誘導(dǎo)治療臨床試驗異基因造血干細(xì)胞移植（二線方案獲得CR后再移植或直接移植）第5頁/共39頁雖然化療治療兒童急性淋巴細(xì)胞白血病取得很好的療效，70%以上患者可獲得5年以上長期生存，但在成人ALL療效仍然很差，尤其是復(fù)發(fā)難治性急性淋巴細(xì)胞白血病的患者預(yù)后極差，甚至即使接受挽救性造血干細(xì)胞移植治療，大多患者僅能獲得短期病情控制，如果是在異基因造血干細(xì)胞移植之后復(fù)發(fā)或無條件接受移植治療，該類患者基本上處于無藥可救境地。第6頁/共39頁近期CD19嵌合抗原受體技術(shù)在治療兒童和成人復(fù)發(fā)B-ALL方面初步顯示出很好療效，近兩年的ASH會議上均有所報道。為了強調(diào)這個領(lǐng)域的重要性，CAR-T療法成為2014、2015年ASH年會中的一個重點。這種新型療法為復(fù)發(fā)難治性B-ALL患者帶來了一線生機(jī)，尤其給那些此前各種實驗療法均失敗、無藥可治的患者帶來了希望。第7頁/共39頁

CAR-T細(xì)胞治療惡性腫瘤有多重優(yōu)勢：短時間內(nèi)擴(kuò)增腫瘤特異的T細(xì)胞群，靶抗原的非HLA依賴，可反復(fù)多療程使用等。但作為是一種剛剛應(yīng)用于臨床的新型治療方法，還存在很多問題和未確定因素需要進(jìn)一步研究和探索，包括“CAR-T細(xì)胞最基本的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)的制定和監(jiān)控，回輸?shù)淖罴褧r機(jī)和方式，治療相關(guān)不良反應(yīng)及其控制，以及近期、遠(yuǎn)期確切的治療效果等等”。尤其對中國的患者臨床療效如何？第8頁/共39頁病例選擇：1.1復(fù)發(fā)難治性急性B淋巴細(xì)胞白血?。˙-ALL）患者經(jīng)其他傳統(tǒng)治療手段無效，治療前確認(rèn)白血病細(xì)胞CD19+。復(fù)發(fā)難治性急性B淋巴細(xì)胞白血病定義：初治病人對標(biāo)準(zhǔn)誘導(dǎo)化療無效（ALL1個療程，AML兩個療程）；在首次緩解6個月內(nèi)、即早期復(fù)發(fā)的白血病；雖然在首次緩解6個月后復(fù)發(fā)，但以原方案再誘導(dǎo)

治療失敗者；

2次或2次以上復(fù)發(fā)的患者。第9頁/共39頁1.2患者自愿入組參加，依從性好，能全程配合試驗觀察，一般情況尚好，心、肝、腎功能基本正常，無重癥感染，采血時外周血CD3+T淋巴細(xì)胞計數(shù)必須≥0.8x109/L。T淋巴細(xì)胞數(shù)量和亞型的評估白血病細(xì)胞表面抗原CD19的檢測和鑒定第10頁/共39頁2.治療方法：

用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體導(dǎo)入CD19CAR的自體T細(xì)胞（CAR-T-CD19）輸注給患者，輸注劑量為

5×108~無上限，分3-5次回輸。第11頁/共39頁回輸前對體外制備的CAR-T細(xì)胞進(jìn)行質(zhì)量檢測和鑒定：1）基本指標(biāo)：數(shù)量、活性度、有無病原體等污染。2）靶抗原轉(zhuǎn)染率和細(xì)胞殺傷功能。對照組轉(zhuǎn)染組第12頁/共39頁RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染結(jié)果CD19GAPDHCAR質(zhì)?；颊哧栃詫φ贞幮詫φ誄AR質(zhì)?；颊哧栃詫φ贞栃詫φ盏?3頁/共39頁相對定量----Cp值與內(nèi)參Cp值注：L2為患者細(xì)胞，X1為另一組感染效率的對照細(xì)胞，NC為經(jīng)過相同時間周期培養(yǎng)的未感染的T細(xì)胞（NC-CD19的Cp值超過35，說明樣品中沒有模板）。左側(cè)CD19的引物位于CAR的scFv上，，正常的T細(xì)胞不表達(dá)；右側(cè)為GAPDH，作為上樣內(nèi)參；樣品名CD19GAPDHL2（患者）19.8912.61X1（陽參）21.7512.68NC（陰參）36.2714.19Cp值平均數(shù)第14頁/共39頁FCM檢測轉(zhuǎn)染結(jié)果未轉(zhuǎn)染細(xì)胞轉(zhuǎn)染后細(xì)胞第15頁/共39頁回輸前T細(xì)胞亞群檢測第16頁/共39頁CAR-T細(xì)胞回輸前1周內(nèi)，除予以小劑量環(huán)磷酰胺(0.3g/M2iv.-6d,-5d,-4d)進(jìn)行預(yù)處理幫助刪除抑制性淋巴細(xì)胞之外（也有患者采用FC），禁用其他一切細(xì)胞毒藥物和免疫抑制劑?；剌敃r至少由三人（醫(yī)生、護(hù)士和細(xì)胞制備技術(shù)人員）對患者的姓名、性別、年齡、住院號、細(xì)胞培養(yǎng)序列號和質(zhì)控報告單等資料進(jìn)行嚴(yán)格核對，確認(rèn)無誤后再行回輸，回輸過程中密切觀察患者情況。第17頁/共39頁3.觀察指標(biāo)：1）安全性，患者接受CAR-T-CD19治療，可能出現(xiàn)的

各種相關(guān)不良反應(yīng)及患者耐受性。2）CAR-T-CD19體內(nèi)清除白血病細(xì)胞效能。3）

CAR-T-CD19在體內(nèi)持續(xù)存留的時間。第18頁/共39頁4.結(jié)果1）6例成人接受CAR-T-CD19治療患者的一般情況性別年齡臨床診斷和既往治療男：4例女：2例16歲~52歲均為難治性或反復(fù)復(fù)發(fā)（含髓外浸潤3/6）的B-ALL，其中3例bcr/abl陽性（含1例B髓雙系列混合型AL），1例t(4;11)、MLL-AF4陽性,1例Pro-B-ALL伴CD33、CD13表達(dá)，1例Pre-Pre-B-ALL伴骨髓纖維化第19頁/共39頁4.結(jié)果2）安全性：所有患者在回輸細(xì)胞后均出現(xiàn)不同程度的發(fā)熱，一般均在37℃~38℃，偶然最高可達(dá)39℃以上，但均為一過性，無畏寒、寒戰(zhàn)、心慌、胸悶等不適，無需特殊處理或僅用物理降溫即可退熱。第1例患者在回輸CAR-T2周后復(fù)查骨髓發(fā)現(xiàn)有嗜血現(xiàn)象，無其他嚴(yán)重毒副反應(yīng)。第20頁/共39頁被巨噬細(xì)胞吞噬的成熟紅細(xì)胞原始細(xì)胞（白血病細(xì)胞）第1例：CAR-T回輸后15d骨髓涂片細(xì)胞學(xué)檢查（

BM細(xì)胞）第21頁/共39頁原始細(xì)胞（白血病細(xì)胞）回輸后15dBM細(xì)胞回輸后33dBM細(xì)胞骨髓增生極度低下第22頁/共39頁4.結(jié)果3）臨床療效（反應(yīng)率）3例外周血和骨髓均達(dá)到完全緩解，2例PR，1例病情穩(wěn)定。1例PR患者因長期粒缺、合并肺部重癥感染死亡。第23頁/共39頁第1例：治療前骨髓中的白血病細(xì)胞﹥70%第24頁/共39頁第1例：治療后15d骨髓中的白血病細(xì)胞＜20%第25頁/共39頁FCM檢測治療后白血病細(xì)胞清除效率1）2015-06-11（回輸前）2）2015-07-01（回輸后7d）3）2015-07-10（回輸后17d）4）2015-07-27（回輸后33d）CD34第1例SSC第26頁/共39頁1）2015-06-11（回輸前）2）2015-07-01（回輸后7d）3）2015-07-10（回輸后17d）4）2015-07-27（回輸后33d）CD19FCM檢測治療后白血病細(xì)胞清除效率第1例第27頁/共39頁第2例治療前BMBC＞80%治療后22d,60d

BM完全緩解（

BC﹤5%）第28頁/共39頁第2例治療前第29頁/共39頁第2例治療后22d第30頁/共39頁第3例治療前BMBC＞70%治療后BMBC﹤35%第31頁/共39頁第32頁/共39頁4.結(jié)果4）CAR-T在體內(nèi)持續(xù)存留時間

第2例CAR-T回輸后第60天，骨髓和外周血CR。PB-RT-PCR可檢出CAR-T特異性核苷酸片段。3個月時測不出。第33頁/共39頁第4例：CAR-T回輸后第30天，骨髓和外周血細(xì)

胞學(xué)CR。bcr/abl（T315I突變）融合基因

P21019.3%陽性

PB-RT-PCR可檢出微量CAR-T特異性核

苷酸片段。微弱陽性第34頁/共39頁討論第35頁/共39頁一、CAR-T治療的安全性：CAR有多安全？迄今為止報道的CART治療相關(guān)副作用：1.細(xì)胞因子風(fēng)暴，腫瘤裂解效應(yīng)、外周血中CAR-T細(xì)胞的數(shù)量和促炎癥細(xì)胞因子的水平直接相關(guān)。2.靶向細(xì)胞毒性，B細(xì)胞再生性貧血障礙或瞄定CD19分子而引起的低丙種球蛋白血癥。3.神經(jīng)系統(tǒng)毒性，幾個研究組在用CAR-T治療白血病的過程中，觀察到少部分患者出現(xiàn)神經(jīng)錯亂，語言障礙，癲癇等神經(jīng)系統(tǒng)不良反應(yīng)。4.其他合并的免疫炎癥反應(yīng)，巨噬細(xì)胞活化，類自身免疫性疾病等。第36頁/共39頁第1例患者CAR-T細(xì)胞回輸后雖然骨髓中白血病細(xì)胞明顯減少，但始終未能恢復(fù)正常造血，最終因持續(xù)粒細(xì)胞缺乏，肺部重癥感染離世。分析原因：治療前患者一般情況極差，查PB：WBC0.73×109/L,N6.8%,

Neu0.05×109/L,Ly93.2%0.68x109/LHb26g/L，PLT10×109/L，骨髓中原始細(xì)胞73%。經(jīng)長期使用IL-2和支持治療后，患者勉強達(dá)到采血標(biāo)準(zhǔn)。既往長期反復(fù)強化療，損傷正常造血干祖細(xì)胞，有繼發(fā)再障、MDS可能。既往化療時，曾反復(fù)合并肺部重癥感染（包括肺真菌?。菀自俅渭せ?。不排除巨噬細(xì)胞活化加重或延長粒細(xì)胞缺乏，

患者出院后再次入院