蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法-cropped

基礎(chǔ)學(xué)·蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法陳 姍 綜述劉基礎(chǔ)學(xué)·蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法陳 姍 綜述劉紅審校關(guān)鍵詞蛋白質(zhì)組學(xué) 2D電泳色譜技術(shù)質(zhì)譜技術(shù)芯片技術(shù)蛋白質(zhì)相互作用著人類(lèi)功能基因組計(jì)劃的實(shí)施和推進(jìn),以蛋白質(zhì)組(Pome)和蛋白質(zhì)組學(xué)(Pomcs)的提出為志,類(lèi)從蛋白質(zhì)水平全面揭示生命本質(zhì)的研究進(jìn)入一個(gè)全新的領(lǐng)域工欲善其事,必先利其器,近年來(lái)蛋白質(zhì)組學(xué)的迅猛發(fā)展與研究方法的改和研究手的提高是不可分的蛋白質(zhì)組學(xué)的展是伴隨著蛋白質(zhì)研究技術(shù),尤其是雙向凝電泳(2D凝膠泳)和新型譜技術(shù)以及生物信息學(xué)發(fā)展而發(fā)的本文對(duì)主要蛋質(zhì)組學(xué)技術(shù)作概述。從技術(shù)度而言,主要得于以下兩面的成功:①蛋白分技術(shù),包括以凝膠為基礎(chǔ)的或不需要凝膠的,以2D凝電泳為代表;譜技術(shù)(masspec2top,M)[4]外,生物信息學(xué)的發(fā)展,包括生物分析件的完善信息平臺(tái)數(shù)據(jù)庫(kù)的立也是不可缺的?；螂m是遺傳信息的源頭,而功能性蛋白是基因功能執(zhí)行體一個(gè)基因過(guò)不同的譯后修飾(posttansatonalmodfcaton,PM)可以產(chǎn)生不同的蛋白蛋白質(zhì)是生理功能的執(zhí)行者,是生命現(xiàn)象的直體現(xiàn)者,對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的研究將直蛋白組學(xué)及其究技術(shù)平臺(tái)接闡明生命在生理或病理?xiàng)l件下的變化機(jī)制[4,5]。而我們了解這些蛋白質(zhì)的信息,就必須通過(guò)一系列的蛋質(zhì)研究方法蛋白質(zhì)學(xué)方法的立使我們能夠生命體蛋質(zhì)進(jìn)行更廣更細(xì)更通量的研究般來(lái)說(shuō),蛋白質(zhì)組學(xué)平臺(tái)包括以下幾大部分:前期的樣提取純化,中期蛋白分離蛋白分析鑒定,以及后期數(shù)據(jù)分析前期的樣提取純化是以往的生物化學(xué)細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)為基礎(chǔ),近年來(lái)激光捕獲微分離(aercpuemcodisecton,LM)等新方法的應(yīng)用為樣本更精確和完的制備提了條件期的蛋白離和蛋白分析鑒定蛋白質(zhì)組技術(shù)的核部分,后期的數(shù)據(jù)分是對(duì)其必可少的輔助典型的白質(zhì)組學(xué)分析在蛋白提后,先凝膠的如2D電泳)或凝膠的如液相色譜)方法分離蛋白,然后以不同的質(zhì)譜析方法進(jìn)蛋白分析鑒定,接著生物信息學(xué)輔獲取和深入分析全面的信息,并可以指導(dǎo)1994年,澳大利亞Macquare大學(xué)的MacWikn和eihWillm在意大利召開(kāi)的一次科學(xué)會(huì)議首次提出蛋白質(zhì)組的概念蛋白質(zhì)組(Pome)詞是由英文單詞蛋白質(zhì)(Poen)的前部加上基因組(eme)的后半部分組合而成,其意指基因組表達(dá)產(chǎn)生的所有相應(yīng)的蛋白質(zhì)[1]。1995年Wasner等[1]第一次在出版物中(Eecto2poesi)使了該詞,并定義胞或組織或機(jī)體內(nèi)全蛋白質(zhì)的存在及其活動(dòng)方式,同時(shí)提出了蛋白質(zhì)組學(xué)(Pomcs)一詞自此以后,蛋白質(zhì)組成為生命學(xué)中一個(gè)新的領(lǐng)域蛋白質(zhì)組學(xué)是門(mén)對(duì)某一物或細(xì)胞特定生理病理狀態(tài)下表的所有蛋白質(zhì)的特征數(shù)量和功能進(jìn)行系統(tǒng)性研究的科學(xué)[2]近年來(lái)蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展非常迅速,以發(fā)表的相關(guān)文章為例,最早1995年只有3篇,至2003年累計(jì)有492篇,2004年已近10000篇[3]蛋白質(zhì)學(xué)發(fā)展,除了基因組學(xué)的發(fā)展尤其是人和其他物種基因全長(zhǎng)測(cè)序的基本完成以外,[4,68]更深層功能蛋白學(xué)研究。蛋白質(zhì)學(xué)研究技術(shù)二維聚丙烯酰胺凝膠電泳1975年Oarell者位]南軍南京醫(yī)院解放腎病究所京,210002)和Koe首先在兩實(shí)驗(yàn)室分別建立了二維聚丙烯酰胺凝膠電泳技酰胺凝膠電泳技術(shù)(odmensonalpoacymdeeleectpoesi,2D電泳),亦稱(chēng)雙向凝膠電泳技術(shù),其基本理是利用不同蛋白質(zhì)具有不同等電點(diǎn)(p)不同分子大小的點(diǎn)將它們離他們將高分辨率的等電聚集電泳(ioeectoocusn,EF)和D聚烯酰胺凝膠電泳(DAE)聯(lián)合組成雙向泳,一向?yàn)镋F,采用經(jīng)典的兩性電解質(zhì)載體在流作用下形成pH梯度,依據(jù)p的不同進(jìn)行分離;第二向利用DAE根據(jù)分子量大小進(jìn)行分離[9,10]。1982年固相pH梯度(PG)應(yīng)用于等電聚集泳與傳兩性電解載體在電作用下形成pH梯度不同,P由丙烯胺衍生物聚丙烯酰胺共聚合而成相pH膠梯度。P形成的pH梯度穩(wěn)定,聚集準(zhǔn)確,消除了傳統(tǒng)EF陰極漂移問(wèn)題,顯著提了雙向凝電泳結(jié)果重復(fù)性[11,12]。2D凝膠泳一般包括樣品制備EF電泳平衡D電泳染色保存樣制備方法根據(jù)樣本蛋白不同而有所不同,目的主要在于盡可能完全取白質(zhì)的同時(shí)去除非蛋白成分樣品制備后,在預(yù)的P膠條上電泳使具有不同p的蛋白質(zhì)分離,然后在第二向利用水平或垂直的DAE使蛋質(zhì)按分子大小分離經(jīng)過(guò)電荷質(zhì)量?jī)纱畏蛛x后,具不同等電點(diǎn)和分子量信息蛋白質(zhì)分子就具不同的定位凝膠染有考馬斯蘭染、同位標(biāo)記熒光標(biāo)記不同方法,也可將蛋白轉(zhuǎn)至DF(povnyldenedforde)膜上后再顯色。染色電泳圖經(jīng)掃描和計(jì)算機(jī)處理后,就可以得到相應(yīng)品2D電泳圖譜[11,12]將不同生理或理理?xiàng)l件下的樣本分別進(jìn)行2D凝膠電泳,再將它的2D電泳圖譜進(jìn)行比較,就可以獲取在相應(yīng)生或病理生理?xiàng)l件下發(fā)生改變的蛋白質(zhì)的信息,即所謂比較蛋白質(zhì)組學(xué)。2D電泳后凝膠上的白質(zhì)可以切割分離純化,用以進(jìn)一步的分析鑒定[1317]。2D凝膠泳可以使們較快地獲取樣本整個(gè)蛋白組大量蛋質(zhì)變化分布的觀信息,同時(shí)也可以助后續(xù)的方法進(jìn)行微觀分析此外,它還具有大通量的優(yōu)勢(shì)。2D凝膠電泳也有其自身局限性,主要在于:豐度表達(dá)白的鑒定人體的低豐度達(dá)蛋白往是重要信轉(zhuǎn)導(dǎo)和調(diào)蛋白及受體,但是在2D凝膠電時(shí),豐度的蛋?？裳谏w低豐表達(dá)蛋白的檢出;膜蛋白等難溶蛋白的檢測(cè)膜白涉及信轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞粘附代謝離子轉(zhuǎn)等重生命活動(dòng),但是能以2D凝膠電泳檢測(cè)出的完整膜蛋白只占總量的極少數(shù);分子量過(guò)大(>200D)過(guò)小(<10D)蛋白質(zhì)的分離;極[12,13,16,17]。酸或極蛋白的分離隨技術(shù)的進(jìn)步,蛋分離方法不斷改進(jìn),二維色譜液相分離技術(shù)日益成熟,將來(lái)也許可對(duì)22D凝膠電形成補(bǔ)充替代[57,17]。色技術(shù)色法又稱(chēng)層析法,其原理是溶于流動(dòng)相(mobiephae)中的各組分經(jīng)過(guò)固定相(satonayphae)時(shí),與固定發(fā)生相互用吸附分配離子吸引排阻親和等),由于作用的大小強(qiáng)弱等不同,各組分在定相中滯的時(shí)間不同,由從固定相中流的先后也不同,最終使不同組成成分得到分離譜法根據(jù)離原理分類(lèi),有附色譜分配色譜離子交色譜排阻色譜凝膠滲透色譜及親和色譜等按操作形式可分為紙色譜法薄層色譜法柱色譜法等根據(jù)流動(dòng)相的物理狀態(tài)不同可分為:氣相色譜法(aschmaogph,C)和液相色譜法(lqudchmaogph,LC)。C根據(jù)固定相不同又分為氣固色譜法和氣液色譜法。LC同樣可分為固色譜法和液液色譜法,此外還有超臨界流體色法液液譜法按固相和流動(dòng)的極性不同可為正相LC和反相L正相LC采用極性固定相,流動(dòng)為相對(duì)非性的疏水溶劑,常用于分離中極性和極性較強(qiáng)的化合物反相LC一般用非極固定相,流動(dòng)相水或緩沖液,并加入與水互溶有機(jī)溶劑以調(diào)節(jié)保留時(shí)間,適用于分離非性和性較弱的化合物。C由于使用氣體為流動(dòng)相,不能分大多數(shù)金屬鹽類(lèi)和熱穩(wěn)定性差的物質(zhì),對(duì)于此類(lèi)物質(zhì)的分析需要借助LC,尤其是高效液相色法[18]。高液相色譜高效液相譜法(hhpeom2ancelqudchmaogph,HLC)是以液體作為流動(dòng)相,并采用粒極細(xì)的高效固定相的柱色譜分離技術(shù)它是在傳統(tǒng)LC的基礎(chǔ)上,輔以高效固定相、高壓泵高靈敏度檢測(cè)器及計(jì)算機(jī)技術(shù)的應(yīng)用,從而實(shí)現(xiàn)液相色譜析的高效高速高靈和自動(dòng)化操作,因此被稱(chēng)為HL它對(duì)樣品的適用性廣,不受分對(duì)象揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制,適于分離分析沸高穩(wěn)定性差分子大的許多機(jī)物和在mol(1在mol(10-15)乃至atmoe(10-18)水平檢測(cè)分子量高達(dá)幾十萬(wàn)的生物大分子成為可能[21,22]在蛋白質(zhì)組中,前最為常用的質(zhì)譜分析系統(tǒng)包括兩一些機(jī)物,彌補(bǔ)了不足但是HLC的固定相的離效率檢測(cè)器的檢測(cè)范圍以及靈敏度等目還如,此外于氣體和揮發(fā)物質(zhì)的分析方[1820]。面也不如大類(lèi):以單一譜為基礎(chǔ)和以串聯(lián)譜為基礎(chǔ)的。以單一質(zhì)譜為基礎(chǔ)的質(zhì)譜分析系統(tǒng)以D2OFM為代表聯(lián)質(zhì)譜以ESMSM為代表,常用的多質(zhì)量分析器有quadpoetmeoflht(Q2OF)trpequadpo四極桿飛行時(shí)間質(zhì)量分析器(quadpoetmeofflhtanae)等。DOFMS基質(zhì)輔助激光解吸附飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrxasisedaerdeoptononaton/tmeoflhtmasspectop,DOFMS)是將作為子源的D和分析檢測(cè)的飛行時(shí)間質(zhì)譜連用D的電離方式在1988年由aas和Hilenkmp出D的本原理是分析物分散在基分子中并成晶體,當(dāng)用激照射晶體時(shí),質(zhì)分吸收激光量與樣品解吸附,基質(zhì)樣品之間發(fā)生電荷轉(zhuǎn)移使樣品分子電離[21,22]然后離子源中每一脈沖激光產(chǎn)生的離子先經(jīng)過(guò)一個(gè)加速電場(chǎng),獲得動(dòng)能,再進(jìn)入一個(gè)高真空無(wú)電場(chǎng)飛行管道,離子在無(wú)場(chǎng)飛行道內(nèi)以在速電場(chǎng)獲的速度飛行量較輕的離子飛行速度快,較早到達(dá)檢測(cè)器,較重的離飛行速度慢,較晚到達(dá)檢測(cè)器,離子的飛行時(shí)間與其質(zhì)荷比的平方根(m/z)1/2成正比,通過(guò)檢測(cè)行時(shí)間來(lái)定離子的荷比,此即為O[21,22]。DOFMS常用于蛋白質(zhì)的肽指紋圖譜(pptdemassfneprntn,MF)鑒定。MF是指蛋白質(zhì)酶切位點(diǎn)一的蛋白水解后得的肽片段質(zhì)量譜由于每種蛋白質(zhì)的氨基酸序列不同,蛋白質(zhì)酶水解后,產(chǎn)生肽片段序也各不相同,其肽混物質(zhì)量數(shù)亦具特征性,所以稱(chēng)為指紋圖譜(fnepntn)將獲取的指紋圖譜在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索,尋找具有相似MF的蛋白質(zhì),就可以初完成白質(zhì)的確認(rèn)[21,23]。2D泳凝膠上的蛋白可被位酶切或印到DF上酶切獲得肽混合物,經(jīng)質(zhì)譜析得到M。DOFMS的主要優(yōu)點(diǎn)在于:操作較為簡(jiǎn)便DOFM是在質(zhì)譜術(shù)中操作最簡(jiǎn)易的一種;在與2D凝膠泳聯(lián)用時(shí),可以樣本的獲取至理及上樣分析實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化,保了實(shí)驗(yàn)的精確性,并合大通量分析的要求;靈敏度高,維液相分系統(tǒng) 液色譜是蛋質(zhì)組學(xué)非凝膠白分離技術(shù)中最常用的方法,除此之外還有毛細(xì)管電泳(cpilayeectpoesi,CE),它是一類(lèi)以細(xì)管為分通道以高壓直電場(chǎng)為驅(qū)力,根據(jù)品中各組之間遷移度和分配為上的差異而現(xiàn)分離的一類(lèi)液相分離技術(shù)[19]單一的液相分技術(shù)由于自身分離能力的限制,常不能滿(mǎn)足復(fù)雜白質(zhì)復(fù)合物分離的需要,多維液相分離系統(tǒng)的建促進(jìn)了蛋質(zhì)組學(xué)的展多維相分離系統(tǒng)是種或兩種上具有不分離原理性的液相分離法的優(yōu)化組合由多維液相離系統(tǒng)的總分率約等于各維平方和的平方根,總峰容量約等于維峰容量的乘積,多維液相分離系統(tǒng)有效地提高系統(tǒng)對(duì)樣的分辨率峰容量外多維液分系統(tǒng)還具有快速高通量自動(dòng)化重復(fù)性好優(yōu)點(diǎn)[19]常見(jiàn)多維液相分離系統(tǒng)有二維色譜(DLC)二維毛細(xì)管電泳(DCE)液相色譜毛細(xì)管電泳(LCCE)等其中DLC又包括二維離子交色譜體積排阻色譜二維離子交換色譜反向色譜二體積排阻色譜反向色譜等色譜技術(shù)除了接對(duì)蛋白離分析外,常與譜技術(shù)聯(lián)用,為蛋白質(zhì)組的分離分析和鑒定提供了有力的平臺(tái)[6,7,1720]。譜技術(shù) 譜技術(shù)的本原理是品分子離子化后,根據(jù)不同離子間的荷質(zhì)比(m/e)的差異分離并定分子量一個(gè)完整質(zhì)譜分析統(tǒng)由離子源質(zhì)量分器和檢測(cè)器3個(gè)部分成,輔以進(jìn)樣系統(tǒng)后續(xù)分析統(tǒng)[6,21]質(zhì)分析器是質(zhì)譜的核心元件,決著質(zhì)譜的準(zhǔn)確度靈敏度和分辨率等。常用質(zhì)譜分析技術(shù)有以下四種:離子肼質(zhì)譜(iontp,T)飛行時(shí)間質(zhì)譜(tmeoflh,OF)四極桿質(zhì)譜(quadpoe,Q)和傅立葉變換離子回旋共振質(zhì)譜(ourertanomonccoton,FTR)質(zhì)譜技術(shù)從復(fù)雜的本中定性定量析蛋白質(zhì),而新的離化技術(shù)則質(zhì)譜技術(shù)靈敏度和確度均有了顯提高,尤其是基輔助的激解吸附離子化(matrasisedaerdeopton/onaton,DI)和電霧離子化(eectopayonaton,ES),使得可以檢測(cè)出10-18mo可以檢測(cè)出10-18mol級(jí)的蛋白質(zhì);精確度較高,并隨著OF的改進(jìn)而使精確度得到更好保證[2123]。固相支物表面高度密集排列探針蛋白點(diǎn)陣,當(dāng)待測(cè)蛋白其反應(yīng)時(shí),可特異性地捕獲樣品中的靶蛋白,然后通過(guò)測(cè)系統(tǒng)對(duì)靶蛋白進(jìn)行定性及定量分析其最常用的探針蛋白是抗體[6,25,26]現(xiàn)在伴隨著標(biāo)技術(shù)和檢技術(shù)的進(jìn)及探針標(biāo)物的多樣化,蛋白質(zhì)片技術(shù)已日益廣泛地應(yīng)用于蛋白質(zhì)組學(xué)的個(gè)領(lǐng)域蛋白質(zhì)芯片技術(shù)具有高效高通量靈敏度高優(yōu)點(diǎn)。蛋質(zhì)抗體芯片 蛋白質(zhì)體芯片是能和不同抗原異性結(jié)合多種抗體密度地固在玻片或其他體上,使待測(cè)樣通過(guò)芯片面,過(guò)洗脫把非特性結(jié)合的蛋白洗掉,從而對(duì)特異性地結(jié)合在上面抗原進(jìn)行檢測(cè)[26]對(duì)結(jié)合抗原的檢測(cè)可以通過(guò)譜光色等直接間接地進(jìn)行抗體蛋白質(zhì)片具有以下優(yōu)點(diǎn):特異性高這是由抗原抗體間的特異性結(jié)合決定的;高通量在一次實(shí)驗(yàn)可同時(shí)檢多種蛋白,所需體量少,花費(fèi)少,檢測(cè)時(shí)間短;敏感性較高,可達(dá)到ngL水平;可重性好,不同次實(shí)驗(yàn)間相同兩點(diǎn)之間變異小于10%第一張品化的抗芯片由美國(guó)DCon2ech公司出,芯片上排列了378種已知蛋白的單抗,新一代的芯片已超過(guò)500種這些單抗對(duì)應(yīng)的ESMSMSES是在質(zhì)譜進(jìn)樣端的毛細(xì)管柱出口施加一高電壓,利用高電場(chǎng)使從毛細(xì)管流出的液霧化成細(xì)小的帶電液滴,并在干燥或氣流等的作下,液滴崩解為大量帶一個(gè)或多個(gè)電荷的離子,最終分析物離子化并以帶單電荷或多電荷離子的形式進(jìn)入質(zhì)量分析器[22]。ES的特點(diǎn)是產(chǎn)生高荷離子而不是碎片離子,其所形成的多電荷離子以直接用準(zhǔn)確地和靈敏度地定多肽與蛋白的分子量。DOFM要用于獲蛋白質(zhì)或肽的質(zhì)量數(shù)據(jù),串質(zhì)譜(andmMS)則可完成肽的測(cè)序。白由20種氨基酸成,段3個(gè)氨酸的肽有23種能排列方式,4個(gè)氨基酸的肽有24種可能排列方式,一個(gè)特定序列的4肽出現(xiàn)的概率為1/16000所以6個(gè)氨基酸殘基的序列片段在一個(gè)白質(zhì)組中已具有很高的特異性,因此測(cè)出N端或C端56個(gè)氨基酸殘基的序列可以用來(lái)鑒定蛋白質(zhì)串聯(lián)質(zhì)譜在第一級(jí)質(zhì)譜得到肽的分子離子,選取目標(biāo)肽的離子作為母離子,與惰性氣體碰撞,使肽鏈的肽鍵斷裂,形成一系列離子,即N端碎片離子系列和C端碎片離子系列,再將這些碎片離子列綜合分析,得出肽段的氨基酸序列[1820]。將讀部分的氨酸序列結(jié)此段序列后的離子質(zhì)量肽段母離質(zhì)量,在數(shù)據(jù)庫(kù)查尋,即為肽序蛋白涉信號(hào)傳導(dǎo)腫瘤細(xì)胞期調(diào)控細(xì)胞結(jié)構(gòu)、細(xì)胞凋和神經(jīng)生學(xué)等廣泛領(lǐng)域通這張芯片,我們?cè)谝粚?shí)驗(yàn)中就能夠了解幾百種蛋白的表[26]達(dá)情況 。DOMS表面加強(qiáng)光解吸電飛行時(shí)間質(zhì)譜術(shù)(uaceenhancedaerdeopton/ona2tontmeoflhtM,DOMS)實(shí)質(zhì)上是一種含層與質(zhì)譜的殊蛋白質(zhì)芯片技術(shù)。D蛋白質(zhì)芯根據(jù)芯片表面的成分,可分為化學(xué)表面芯片和生表面芯片其中化學(xué)面芯片又分為疏水親水陽(yáng)離子陰離子金屬離子合芯片五種;而生物表面芯片又分為抗體抗原受體配體和A蛋質(zhì)芯片等種類(lèi)蛋白質(zhì)樣本首先通過(guò)親合作用合到芯片的化學(xué)或生物位點(diǎn)上,在洗去非特異結(jié)后,入的能量子與蛋白成晶體,然后通過(guò)激光解吸附電離電離的蛋白質(zhì)通過(guò)OF被測(cè)出質(zhì)量,最可以得到一個(gè)整體的結(jié)合蛋白的質(zhì)譜圖。DOMS技術(shù)的主要特色是能夠直接自未經(jīng)理的生物品獲取蛋質(zhì)圖譜[17,18,27]。[24],或者直列標(biāo)技術(shù)(pptdeequencea,P)接用串聯(lián)質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行檢索相對(duì)于D2OFM常和2D凝膠電泳聯(lián)用而言,ESMSMS常和LC聯(lián)用[19]。ESMSM可檢測(cè)出mo數(shù)量極的樣品,檢測(cè)確度可達(dá)0005%。ESMSM還可以檢測(cè)分子量超過(guò)200D的蛋白質(zhì),不過(guò)當(dāng)分子質(zhì)量超過(guò)100D時(shí),由于多電荷峰難以分辨而使分析非復(fù)雜。實(shí)上,隨著DOFMS技術(shù)的改進(jìn)和精度的提高,部分肽序列測(cè)序也可由DOFMS完成比如:近年來(lái)采的源后衰變基質(zhì)輔助激光解吸子化質(zhì)譜(posoucedecayDIM,PD2DIM)術(shù)可以測(cè)肽序列[23]。白質(zhì)芯片術(shù) 蛋白組學(xué)研究另一重要技術(shù)蛋白質(zhì)芯技術(shù)(poenmcoaray),它是在聚焦顯鏡式細(xì)聚焦顯鏡式細(xì)胞儀等檢測(cè)方法的聯(lián)用不但使對(duì)活體胞進(jìn)行細(xì)胞定位成為可能,更可通過(guò)觀察蛋白的胞共定位究蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)間相互作用,蛋白質(zhì)學(xué)也因此到了日益泛的應(yīng)用[30]。熒蛋白融合術(shù) 熒光白是一類(lèi)有發(fā)光功能的蛋白質(zhì),以綠色熒光蛋白(geenfoecentpoen,FP)為代表,此外還有紅色熒光蛋白藍(lán)色熒光蛋白等等。FP是一類(lèi)存在于水母水螅和珊瑚等腔腸動(dòng)物體內(nèi)的生物發(fā)光蛋白,由238個(gè)氨基殘基成,子量為27D,可以在紫外或藍(lán)光的激發(fā)下顯示出綠色熒光[31]。FP與外源基因偶聯(lián)時(shí)一般影響外源蛋白的結(jié)構(gòu)和功能,并可在活細(xì)胞內(nèi)長(zhǎng)間存在,其熒光強(qiáng)度與蛋白量正相關(guān)因此FP與白偶聯(lián)后,可以在活細(xì)胞或生物體內(nèi)動(dòng)觀察標(biāo)蛋白質(zhì)的表達(dá)分布變化,并進(jìn)而探討其生物效應(yīng)如將兩種或種以上蛋分別構(gòu)建熒光位載體,然后轉(zhuǎn)入細(xì)胞,觀察它單獨(dú)存在和共存在時(shí)的表達(dá)分布,就可知這兩種或多種蛋白是存在細(xì)胞定位熒蛋白融合術(shù)操作便,便于動(dòng)態(tài)觀察但是由于觀察的融合蛋白是外源性入,可能與在理?xiàng)l件下分布變化有差異,此時(shí)可運(yùn)用免疫熒光技術(shù)確定內(nèi)源表達(dá)蛋白的定位。熒光技術(shù)免疫熒光技術(shù)(muofoe2cence)是根抗原抗體反應(yīng)的原理,先將已知的抗原或抗標(biāo)記上熒光素制成熒光標(biāo)記物,再用這種熒光抗體或抗原)作為分子探針檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的相抗原或抗體)抗原抗體結(jié)合后,免疫復(fù)合物由帶有熒光標(biāo)記,可以在熒光顯微鏡下被發(fā)研究白質(zhì)相互用的技術(shù)蛋白質(zhì)在生命活動(dòng)中彼此協(xié)調(diào)和控制,它們之間的互作用不僅參與和調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄細(xì)胞分裂增殖信號(hào)導(dǎo)代謝等重要生命活動(dòng),同時(shí)還與疾的生展密切相關(guān)認(rèn)識(shí)和了解蛋白質(zhì)之間的相互作用,建立基因組蛋白連鎖圖(emepo2enlnkaemp)和白作用網(wǎng)絡(luò)圖,對(duì)于認(rèn)識(shí)生命活動(dòng)著重要意義。母雙雜交統(tǒng) 酵母雙雜交系統(tǒng)(easto2hbrdysm)是作為發(fā)現(xiàn)和研究活細(xì)胞體內(nèi)蛋白質(zhì)與白質(zhì)之間相互作用建立的技平臺(tái)酵母雙交系統(tǒng)的立是基于真核生物控轉(zhuǎn)錄起始過(guò)的認(rèn)識(shí)眾所周知,細(xì)胞起始基因轉(zhuǎn)錄需要有反轉(zhuǎn)錄激活子的參與由此將反轉(zhuǎn)錄激活因子如酵母轉(zhuǎn)錄因子L4的A結(jié)合功能域(Abndngman,AD)和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(actatonman,AD)分開(kāi),分別構(gòu)建兩個(gè)質(zhì)粒,其中將AD與作誘餌蛋白(bai)的已知蛋質(zhì)構(gòu)建在同一個(gè)表達(dá)載體上,而AD和稱(chēng)獵物蛋白(pey)的待檢蛋白構(gòu)建于另一表達(dá)載體將兩個(gè)質(zhì)粒同時(shí)轉(zhuǎn)入帶有報(bào)告基因的酵母有當(dāng)連著AD獵物蛋白能夠與連著AD的誘餌蛋白結(jié)合時(shí),AD和AD才結(jié)合發(fā)揮反式轉(zhuǎn)錄激活因子的作用,啟動(dòng)告基因的表達(dá)反之,當(dāng)檢測(cè)出報(bào)告基因的表達(dá),就說(shuō)獵物蛋白能誘餌蛋白相互發(fā)生作用酵母雙交系統(tǒng)不可用于驗(yàn)兩個(gè)已知蛋白的相互作用或找尋它們相互作用的結(jié)構(gòu)域,還可用來(lái)從A文庫(kù)中篩與已知蛋白作用的蛋白因由酵雙雜交系衍生的酵單雜交系統(tǒng)酵母三交系統(tǒng)和反向雙雜交系統(tǒng)等使這一技術(shù)得了更廣泛應(yīng)用[6,28]規(guī)模酵母雙雜交系統(tǒng)如母雙雜交統(tǒng)芯片的立為蛋白組學(xué)研究提供支持[29]。胞共定位術(shù) 不同蛋白質(zhì)具不同的細(xì)胞定位,并能隨著生和病理生的改變而變。蛋白細(xì)胞內(nèi)的位對(duì)于蛋之間的相作用和它們的物學(xué)功能有重要意義傳統(tǒng)的胞定位技術(shù),如:蛋白親和譜疫共沉淀術(shù)胞組分分離及疫印跡技等主要適于非活體胞的蛋白定位,熒光白融合免疫熒等新技術(shù)建立及共現(xiàn)免疫熒光技術(shù)分為直接法間接法和補(bǔ)體法。以不同熒光素標(biāo)不同的蛋可以同時(shí)察兩種或兩種上蛋白的分布情況,包括它們的共同定位分布。熒技術(shù)與共焦顯微鏡結(jié)合使用更加有效地實(shí)細(xì)胞定位[30]共聚焦激光掃描顯微鏡的共焦系是利用點(diǎn)源代替了統(tǒng)光學(xué)顯鏡的場(chǎng)光源,使探測(cè)和照明點(diǎn)軛,而有效地制了同一焦平上測(cè)量點(diǎn)的雜散熒光,同時(shí)亦可抑制來(lái)自樣品非平面的熒光,由此可獲得生物樣品的高反差高分辨率和高靈敏度的二維圖像共聚焦激光掃描顯鏡同時(shí)還具備縱向分辨能力,可對(duì)細(xì)胞及組織進(jìn)無(wú)損傷光學(xué)切片,獲得樣品的系列光學(xué)切片及品中不同度同層面的息,后通過(guò)其三維建和三維顯示功片及品中不同度同層面的息,后通過(guò)其三維建和三維顯示功能,可以顯示樣本的空間結(jié)構(gòu)和白的空間位[30]。生物息學(xué)多根本的進(jìn)步,但它也有很多不完善和局限的地方比如應(yīng)用2D凝膠電泳進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析時(shí),就有可能測(cè)不出低度蛋白跨膜和相關(guān)的蛋白質(zhì),而這蛋白在蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等許多生物學(xué)用中有重要意義,這時(shí)候傳統(tǒng)的免疫學(xué)方法就能發(fā)揮有效的作用[4]蛋白質(zhì)組學(xué)主要適用于大批的研究和物標(biāo)記物(bmak)的搜尋,以及獲取胞織或器官體表達(dá)的據(jù)簡(jiǎn)言之,物信息學(xué)(bonomatc)是生物科學(xué)與計(jì)算機(jī)科以及應(yīng)用學(xué)等多門(mén)科相互交而形成的一門(mén)興學(xué)科將大量系的生物學(xué)據(jù)與數(shù)學(xué)和計(jì)機(jī)科學(xué)的分析理論和實(shí)用工具聯(lián)系起來(lái),通對(duì)物學(xué)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的獲取加工存儲(chǔ)檢索與分析達(dá)到解數(shù)據(jù)所蘊(yùn)含的生物學(xué)意義的目的生物信學(xué)平臺(tái)一般由數(shù)據(jù)庫(kù)計(jì)算機(jī)網(wǎng)絡(luò)和應(yīng)用分析軟三大部分成數(shù)據(jù)的建立使論基因組還是白質(zhì)組學(xué)研究產(chǎn)生的大量驚人數(shù)據(jù)從輸入、儲(chǔ)存加工調(diào)取獲得迅速有效的控制;而計(jì)算機(jī)網(wǎng)絡(luò)現(xiàn)了數(shù)據(jù)庫(kù)之間的聯(lián)系和數(shù)據(jù)的全球化;應(yīng)用分軟件不僅可對(duì)大規(guī)模的已知數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,如序相似性分析電成象及圖分析等,還可以以已數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)對(duì)未知數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)測(cè),如蛋白質(zhì)能測(cè)構(gòu)預(yù)測(cè)等目前全球已建立了許多與蛋白相關(guān)的數(shù)庫(kù),如:PR國(guó)際蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)(htp://)WOT(h2p:/eb.a.uk/wispot)OSE(htp://HYPERLINK://www/epa.ch/posie)等,為蛋白質(zhì)學(xué)研究提供了利條件[32]。生物信息學(xué)伴隨著生命科學(xué)的發(fā)展而發(fā)展,其數(shù)據(jù)建立和應(yīng)用軟件開(kāi)發(fā)日益成熟,已廣泛應(yīng)用于包蛋白質(zhì)組學(xué)在內(nèi)的生物研究各領(lǐng)域,同時(shí)蛋白質(zhì)學(xué)等研究的完成也依賴(lài)于生物信息學(xué)的輔助如,2D凝膠電泳后首先通過(guò)圖象成象和圖象處理,獲得2D電泳圖;然既可以直通過(guò)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)入2D電泳圖庫(kù)進(jìn)行檢索,也可以通過(guò)分析軟件獲取同生理或理生理?xiàng)l下蛋白電圖的改變及改蛋白點(diǎn)的考p和子量;如果要對(duì)某些蛋白點(diǎn)行進(jìn)一步定,相應(yīng)蛋白切割消化后接著以譜分析,質(zhì)譜分析的結(jié)果首先以應(yīng)用軟件分析處理,然不論肽指紋圖譜還肽序列標(biāo)簽,都必須入相應(yīng)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索,才能獲得所需蛋白質(zhì)定資料;之后如果需要進(jìn)行更深入的功能研究,還可利數(shù)據(jù)庫(kù)和應(yīng)用分析軟件對(duì)進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)功預(yù)測(cè)等等。然蛋白質(zhì)學(xué)較傳統(tǒng)蛋白質(zhì)研方法有很蛋白質(zhì)學(xué)是高通的分析,是對(duì)傳方法的補(bǔ)充。通常我把蛋白質(zhì)組學(xué)分析視為一個(gè)掃描工具,用以產(chǎn)生系列候選者,再以傳統(tǒng)的方法進(jìn)行更深入的究和功能析。蛋白質(zhì)組延續(xù)基因組發(fā)展而來(lái)并與之對(duì)應(yīng),但是又有不同之處:一個(gè)生命體只有一個(gè)確定的基因組,為組成機(jī)體的所細(xì)胞共有;而蛋質(zhì)組則是一個(gè)態(tài)的概念,它不僅在同一個(gè)機(jī)體的不同組織和細(xì)中不同,在同一體的不同育階段不同的生理件或疾病態(tài)下都是同的正這種復(fù)雜的表模式,構(gòu)成了生活動(dòng)的復(fù)性和多樣性,也正是種復(fù)雜的命現(xiàn)象帶了我們無(wú)挑戰(zhàn)和契機(jī)于蛋白質(zhì)學(xué)技術(shù)方的了解和握無(wú)疑將賦予們更具開(kāi)性研究的器。參 考 文 獻(xiàn)WimannF,CackJ,ulzC,eta.odmenonaleectpoetcmppngofhpatcandenaltespoen.Eectpoesi,1995,16:451PengJ,gi.Pomc:hemoeomxue.JMaspec2tm,2001,36:1083Viihononke.Pomcsnnphoo:cuentausanduuediecton.mJNpho,2004,24:360Kpper.PomcsandheKdne.JmocNpho,2002,13:1398HooeB,OeaadM,Vom.Functonalemcsudedbypomc.Boeay,2004,26:901deHogL,Mnn.Pomc.AnnuRevemcsHmen2e,2004,5:267CutilasP,BurlnmeA,Uwn.Pomcstaegesandheirpplcatonnudesofenaluncto.Nwshyolc,2004,19:114HwittM,DearJ,Sar.DioeyofPoenBmakesorRe2nalDieae.JmocNpho,2004,15:1677OFarell.Hheoutonodmensonaleetpoeisofpo2en.JBolChm,1975,250:400712345678910KoeJ,obaz.odmeronaleetpoeisofpoen:anp2daeddaedpooolandmplcatonsoraunctonanayisofheem.Eectpoei,1995,16:103411MoloyM.odmeonaleetpoeisofmmbanepoensu2ngmobiledpHgadnt.AnalBochm,2000,280:112eyJ,Laen.Dorot.odmenonaleleectpoe2i.CurrOpnChmBo,2001,5:2613KenE,KenB,ononked.odmenonaleleecto2poesi:aundmenalolorepeonpomcsude.on2bNpho,2004,141:2514GoganniF,DedeoM,BeaoaGoganni.Pomeana2isungioeectcocungnmobiledpHgadentelsolwedbymaspectmet.Eectpoesi,2003,24:25315ogA,WeissW,DunnM.Cuentodmenonaleectpoeisechooyorpomc.Pomc,2004,4(12):366516ChangJ,RmenV,WadWF,eta.EectpoeisorSatit2calAnayi:MingDaa,Nomalaton,andSatitc.JPomeRe.2004,3:121017ohn.Arhu.Pomc.CurOpnNpholHpen,2003,12:42318Voeer.Lqudchmaogphandmmaspectmety—pplcatonnheclncalaoao.ClnChmLabMed,2003,41:11719myhWF,Boks.Acitcaleauatonofhhpeomancelqudchmaogpheectopayoniatonmaspectmetyandcpi2ayeectpoesieectopamaspectmetyorhedeectonanddeemnatonofmallmoecuesofsnfcancenclncalando2enccen.Eectpoei,2004,25:141320akahahiN