RNA的選擇性剪切

RNA的選擇性剪切第1頁(yè)/共33頁(yè)概論知識(shí)背景RNA的剪切修飾RNA的選擇性剪切NRDR第2頁(yè)/共33頁(yè)知識(shí)背景（1）生物的復(fù)雜性與其基因組基因數(shù)量似乎存在明顯差異

物種間，脊椎動(dòng)物的相對(duì)應(yīng)的DNA序列有著驚人的相似。第3頁(yè)/共33頁(yè)

選擇性剪切（alternativesplicing）是物種進(jìn)化重要方式之一。Neuropsin是一種主要在大腦海馬區(qū)表達(dá)的絲氨酸蛋白酶。該基因同學(xué)習(xí)和記憶的功能調(diào)節(jié)以及大腦的發(fā)育相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，小鼠僅表達(dá)TypeI蛋白酶,檢測(cè)的獼猴、滇金絲猴和長(zhǎng)臂猿的大腦中也只表達(dá)Type-I。在人的胚胎中，TypeI和TypeII兩種剪切方式都有表達(dá)，且豐度相似。在成人腦中，TypeII蛋白酶成為優(yōu)勢(shì)表達(dá)的蛋白酶，TypeI僅有少量表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)TypeII只在人的大腦中表達(dá)。知識(shí)背景（2）第4頁(yè)/共33頁(yè)RNA的剪切修飾GenomeTranscriptomeProteomeDNARNAProtein第5頁(yè)/共33頁(yè)IntergenicIntergenicGeneExonIntronExonExonIntronTranscriptionofpre-mRNAGTAGAGGTExonExonExonSplicingtomRNA5’5’5’3’3’3’DonorSiteAcceptorSiteU1U2Genome:Transcriptome:RNA的剪切修飾第6頁(yè)/共33頁(yè)RNA的剪切修飾過(guò)去人們一直認(rèn)為，基因的遺傳密碼子是連續(xù)不斷地并列在一起，形成一條沒(méi)有間隔的完整的基因體。但以后通過(guò)對(duì)真核蛋白質(zhì)編碼基因結(jié)構(gòu)的分析發(fā)現(xiàn)，在它們的核苷酸序列中間插入有與氨基酸編碼無(wú)關(guān)的DNA間隔區(qū)，使一個(gè)基因分隔成不連續(xù)的若干區(qū)段。我們稱(chēng)這種編碼序列不連續(xù)的間斷基因?yàn)閿嗔鸦?。在很多情況下，有內(nèi)含子的基因首先轉(zhuǎn)錄成RNA前體，之后內(nèi)含子被去除，外顯子被拼接到一起。成熟的mRNA只含有外顯子序列。我們把內(nèi)含子的刪除過(guò)程稱(chēng)為RNA的剪接第7頁(yè)/共33頁(yè)通過(guò)對(duì)mRNA序列與結(jié)構(gòu)基因核苷酸序列的比較，我們可以確定外顯子與內(nèi)含子的接合點(diǎn)。發(fā)現(xiàn)，在一個(gè)內(nèi)含子的兩端并不存在廣泛的相似性或互補(bǔ)性。然而，接點(diǎn)還是具有很好的保守性，盡管只是短短的一致序列。數(shù)字指示了特定的堿基在每個(gè)一致性位點(diǎn)存在的百分比。結(jié)果只在內(nèi)含子接點(diǎn)上有高一致性序列發(fā)現(xiàn)。這樣，基因內(nèi)含子序列就可以定義為：GT……AG因?yàn)榘褍?nèi)含子定義成從雙核苷酸GT開(kāi)始到雙核苷酸AG結(jié)束，所以接點(diǎn)經(jīng)常被描述為遵守GT-AG法則，RNA中實(shí)際的序列為GU-AG法則。

GT-AG法則可以描述許多真核生物核基因中的剪接點(diǎn)。并不適用于線粒體中的內(nèi)含子，也不適用于酵母的tRNA基因第8頁(yè)/共33頁(yè)RNA的剪切修飾第一階段，在內(nèi)含子5′端剪接點(diǎn)形成一個(gè)切口，左邊的外顯子以直線形式存在，右邊的內(nèi)含子一外顯子則開(kāi)成索套（這里內(nèi)含子5′端和內(nèi)含子內(nèi)一個(gè)堿基形成5′-2′鍵，這個(gè)目標(biāo)堿基為腺苷，被稱(chēng)為分枝點(diǎn)）。第二階段，3′端剪接點(diǎn)的剪切從索套形式中釋放了內(nèi)含子，同時(shí)，右邊的外顯子和左邊的外顯子連接起來(lái)。第三階段，索套隨即脫離分枝點(diǎn)，形成一個(gè)線性的刪除內(nèi)含子，然后很快被降解。第9頁(yè)/共33頁(yè)RNA的剪切修飾第10頁(yè)/共33頁(yè)RNA的剪切修飾第11頁(yè)/共33頁(yè)RNA的選擇性剪切概念選擇性剪切是指從一個(gè)mRNA前體中通過(guò)不同的剪接方式（選擇不同的剪接位點(diǎn)組合）產(chǎn)生不同的mRNA剪接異構(gòu)體的過(guò)程。

選擇性剪切不僅僅是mRNA剪去內(nèi)含子的過(guò)程，還包括不同外顯子之間的組合過(guò)程第12頁(yè)/共33頁(yè)RNA的選擇性剪切1980年Baltimore在小鼠

IgM

基因發(fā)現(xiàn)第一個(gè)選擇性剪接現(xiàn)象，不同外顯子組合分別產(chǎn)生膜型、分泌型IgM。高通量的基因組測(cè)序和EST測(cè)序，使生物信息學(xué)方法來(lái)研究選擇性剪接成為可能。最近研究結(jié)果顯示，約35%－60%的人基因有選擇性剪接形式。

第13頁(yè)/共33頁(yè)選擇性剪接是調(diào)節(jié)基因表達(dá)和產(chǎn)生蛋白質(zhì)組多樣性的重要機(jī)制。選擇性剪接可以從一個(gè)基因產(chǎn)生多種蛋白，從而使蛋白質(zhì)組中蛋白質(zhì)的數(shù)量超過(guò)基因組中基因的數(shù)量。其中，從影響基因的數(shù)量和生物種類(lèi)范圍來(lái)看，選擇性剪接是擴(kuò)大蛋白質(zhì)多樣性的最重要的機(jī)制

第14頁(yè)/共33頁(yè)RNA的選擇性剪切二單個(gè)基因選擇性剪接的方式

1.內(nèi)含子的保留；2.可變外顯子的保留或切除；

3.3’和5’剪接位點(diǎn)的轉(zhuǎn)移（shift）導(dǎo)致外顯子的增長(zhǎng)或縮短。

第15頁(yè)/共33頁(yè)RNA的選擇性剪切pre-mRNAExonIntronExonExonIntronGTAGAGGTGT3’5’ExonIntronExonExonIntronGTAGAGGTGT3’5’AGExonIntronExonGTAGAGGTAG3’5’ExonIntronExonGTAGGTGT3’5’AG第16頁(yè)/共33頁(yè)三、選擇生剪接的功能和生物學(xué)意義

1.選擇性剪接是在RNA水平調(diào)控基因表達(dá)的機(jī)制之一。

2.選擇性剪接使生物表型具有多樣性與復(fù)雜性。RNA的選擇性剪切第17頁(yè)/共33頁(yè)NRDR的選擇性剪切全反式維甲酸(aRA)通過(guò)與其在核內(nèi)受體結(jié)合調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄來(lái)發(fā)揮其重要的生理功能，包括正常胚胎的發(fā)育，形態(tài)、神經(jīng)系統(tǒng)的形成，成體動(dòng)物的生長(zhǎng)，發(fā)育，繁殖等，

并通過(guò)調(diào)節(jié)組織及細(xì)胞的分化來(lái)促使一些惡性腫瘤向良性轉(zhuǎn)變。臨床上我國(guó)科學(xué)家率先將aRA用于急性早幼粒細(xì)胞白血病的治療并取得了良好的療效。aRA在體內(nèi)是由維生素A也稱(chēng)視黃醇(Retinol)經(jīng)兩步代謝而成，中間代謝產(chǎn)物為視黃醛(Retinal)，

即

Retinol?Retinal→aRA第18頁(yè)/共33頁(yè)NRDR的選擇性剪切已有不同組織的多種酶被認(rèn)為參與這兩步代謝過(guò)程。輔酶II依賴(lài)性視黃醇脫氫酶(NADP-dependentretinoldehydrogenase/reductase，NRDR)是由黃東陽(yáng)教授在兔肝細(xì)胞中純化的一種新酶，NRDR普遍存在于哺乳動(dòng)物肝中，顯示出較強(qiáng)的Retinol氧化與Retinal還原活性。兔、小鼠、人與牛肝臟NRDRcDNA全長(zhǎng)已相繼被克?。℅enBank登錄號(hào)為AB045133，AB045132，AB045131，AF487454），這些NRDR的C-末端都有過(guò)氧化物酶體定位信號(hào)-SRL，屬于短鏈脫氫酶/還原酶家族（SDR）。預(yù)測(cè)這些cDNA編碼區(qū)序列（ORF），發(fā)現(xiàn)它們均有兩個(gè)ORF，分別編碼278與260個(gè)氨基酸，后者符合Kozak序列。第19頁(yè)/共33頁(yè)NRDR的選擇性剪切人NRDR基因位于14號(hào)染色體長(zhǎng)臂(14q11.2,LOCUSNT_025892)，被命名為DHRS4，由3個(gè)外顯子簇（clusters），共97634堿基組成。Cluster1是人與哺乳動(dòng)物共有的保守序列，含有構(gòu)成NRDR的8個(gè)外顯子，Cluster2含有8個(gè)，Cluster3含有7個(gè)相對(duì)應(yīng)的外顯子。

第20頁(yè)/共33頁(yè)人DHRS4基因結(jié)構(gòu)、NRDR及其選擇性剪切亞型的構(gòu)造特點(diǎn)

第21頁(yè)/共33頁(yè)NRDR的選擇性剪切亞型最近，在人宮頸癌細(xì)胞、肝癌細(xì)胞及食管癌細(xì)胞中均發(fā)現(xiàn)新的NRDR剪切亞型。近年來(lái)，選擇性剪切對(duì)于蛋白質(zhì)多樣性及其與腫瘤的相關(guān)性引發(fā)人們關(guān)注。作為參與合成、調(diào)節(jié)aRA的NRDR，出現(xiàn)不同形式的剪切亞型，是否與腫瘤的發(fā)生有相關(guān)性，值得深入研究。

第22頁(yè)/共33頁(yè)NRDR的選擇性剪切亞型一NRDR選擇性剪切亞型的克隆1.提取細(xì)胞總RNA:Trizol法提取Hela,BELT,EC7-9706總RNA2.逆轉(zhuǎn)錄為cDNA3.PCR擴(kuò)增：

NRDRsense:5`-tccaccgacgggatcggctt-3`NRDRantisense:5`-atgccagcacaatcctctggct-3`NRDRisosense:5`-atggccagctccgggatga-3`NRDRisoantisense:5`-tcagaggcgggacggggtt-3`4.膠回收：PCR產(chǎn)物純化5.連接至質(zhì)粒載體：pGEM-Teasy載體6.轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌（JM109）7.重組子篩選（藍(lán)白篩選）8.細(xì)菌擴(kuò)大培養(yǎng)9.提質(zhì)粒10.測(cè)序第23頁(yè)/共33頁(yè)NRDR的選擇性剪切亞型二選擇性剪切亞型全長(zhǎng)cDNA的克隆

Invitrogen3`RACE試劑盒

cDNA合成引物:5`-GGCCACGCGTCGACTAGTACTTTTTTTTTTTTTTTTT-3`FirstPCRsense:5`-tccaccgacgggatcggctt–3`AUAP:5`-GGTGTGGGACAAGAGGCG-3`NestedPCRsense:5`-tggtggccacgactctggacat-3`AUAP:5`-GGTGTGGGACAAGAGGCG-3`Invitrogen5`RACE試劑盒

cDNA合成引物：5`-GCAGGAATCCCGAGT-3`FirstPCRAAP:5`-GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGIIGGGIIGGGIIG-3`antisense:5`-tcttatccgcagggtttcttt-3`NestedPCRAUAP:5`-GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3`antisense:5`-catccagagaggagatggactg-3`第24頁(yè)/共33頁(yè)NRDR的選擇性剪切亞型三選擇性剪切亞型的細(xì)胞內(nèi)定位將新的選擇性剪切亞型基因與水母綠色熒光蛋白（GFP）基因融合，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)，并用相應(yīng)的抗體及熒光標(biāo)記二抗進(jìn)一步確認(rèn)其在細(xì)胞內(nèi)的位置。四新的選擇性剪切亞型的體外重組表達(dá)原核表達(dá)，真核表達(dá)蛋白經(jīng)分離、純化后，測(cè)定其功能五制備抗體，檢測(cè)腫瘤組織中新亞型的蛋白表達(dá)第25頁(yè)/共33頁(yè)NRDR的選擇性剪切亞型Hela,BELT,EC9706細(xì)胞株中發(fā)現(xiàn)新的剪切亞型第26頁(yè)/共33頁(yè)NRDR的選擇性剪切亞型第27頁(yè)/共33頁(yè)NRDR的選擇性剪切亞型第28頁(yè)/共33頁(yè)NRDR的選擇性剪切亞型第29頁(yè)/共33頁(yè)NRDR的選擇性剪切亞型預(yù)測(cè)新剪切亞型蛋白仍保留了部分SDR結(jié)構(gòu)功能域，在20-27位氨基酸(TASTDGIG)保留了輔酶結(jié)合模序（TAXXX