有機(jī)小分子熒光探針的研究1課件

有機(jī)小分子熒光探針的研究什么是熒光探針？

熒光探針是建立在光譜化學(xué)和光學(xué)波導(dǎo)與測量技術(shù)基礎(chǔ)上，選擇性的將分析對象的化學(xué)信息連續(xù)轉(zhuǎn)變?yōu)榉治鰞x器易測量的熒光信號的分子測量裝置。熒光探針受到周圍環(huán)境的影響，使其發(fā)生熒光發(fā)射發(fā)生變化，從而使人們獲知周圍環(huán)境的特征或者環(huán)境中存在的某種特定信息熒光分子探針的優(yōu)點(diǎn)靈敏度高選擇性好使用方便成本低不需預(yù)處理不受外界電磁場影響遠(yuǎn)距離發(fā)光熒光分子探針的設(shè)計(jì)原理

熒光分子探針的設(shè)計(jì)原理主要有以下幾種：鍵合-信號輸出法、置換法和化學(xué)計(jì)量計(jì)法。1、鍵合-信號輸出法

熒光連接體識別被分析物信號輸出基團(tuán)基團(tuán)鍵合-信號輸出法是指將探針中的識別基團(tuán)和熒光基團(tuán)通過共價(jià)鍵連接起來設(shè)計(jì)熒光探針的方法。

當(dāng)識別基團(tuán)與被分析物結(jié)合時會引起熒光基團(tuán)的化學(xué)環(huán)境發(fā)生變化，通過顏色的改變、光譜的移動、熒光強(qiáng)度的增減等現(xiàn)象來表現(xiàn)，這些變化可被裸眼或者儀器識別。這是目前為止在設(shè)計(jì)熒光探針中應(yīng)用最廣泛的方法。作為熒光基團(tuán)的香豆素和作為識別基團(tuán)的鄰氨基苯硫醚以席夫堿相連，加入鋅離子后，與硫醚上的硫原子、席夫堿上的氮原子及香豆素上的氧原子配位得到結(jié)構(gòu)2，抑制了席夫堿上C=N鍵的旋轉(zhuǎn)，實(shí)現(xiàn)了熒光從無到有的變化基于鍵合-信號輸出法設(shè)計(jì)的鋅離子熒光探針

化合物3以氟硼熒為熒光團(tuán)修飾了DPA為識別基團(tuán)，探針本身熒光很強(qiáng)，但與銅離子絡(luò)合后可形成結(jié)構(gòu)3，從而淬滅了氟硼熒的熒光，加入氰根離子后，由于銅離子與氰根離子的結(jié)合常數(shù)更大，從而把作為熒光基團(tuán)的氟硼熒衍生物從絡(luò)合狀態(tài)中置換出來得到結(jié)構(gòu)4，使之進(jìn)入溶液，熒光恢復(fù)，而其它的陰離子沒有這樣的現(xiàn)象，因此可以實(shí)現(xiàn)對氰根離子的檢測。3、化學(xué)計(jì)量計(jì)法

探針分子被分析物新物質(zhì)A

探針分子被分析物中間體新物質(zhì)B新物質(zhì)C

基于化學(xué)計(jì)量計(jì)設(shè)計(jì)的熒光探針（I）被分析物和探針分子反應(yīng)形成了共價(jià)化合物；（II）被分析物催化探針分子反應(yīng)生成兩種新物質(zhì)化學(xué)計(jì)量計(jì)法是利用探針分子和被分析物之間發(fā)生的特定化學(xué)反應(yīng)（一般是不可逆反應(yīng)）來改變探針?biāo)幍幕瘜W(xué)環(huán)境，從而對被分析物進(jìn)行識別的一種方法。根據(jù)化學(xué)計(jì)量計(jì)法設(shè)計(jì)的探針可以稱為化學(xué)計(jì)量計(jì)，主要包括兩種類型：

一、探針分子和被分析物發(fā)生化學(xué)反應(yīng)后形成共價(jià)化合物（I）；二、被分析物催化探針分子反應(yīng)生成兩種新物質(zhì)（II）。

一般而言，基于化學(xué)計(jì)量計(jì)原理設(shè)計(jì)的熒光分子探針通常具有不可逆性和較好的選擇性。熒光探針的響應(yīng)機(jī)理

熒光分子探針主要有如下幾種響應(yīng)機(jī)理：1、光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移（PET,photo-inducedelectrontransfer）2、分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移（ICT,intramolecularchargetransfer）3、熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET,fluorescenceresonanceenergytransfer）4、激基締合物（excimer/exciplex）1光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移（PET,photo-inducedelectrontransfer）

光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移是指電子給體或電子受體受光激發(fā)后，激發(fā)態(tài)的電子給體與電子受體之間發(fā)生電子轉(zhuǎn)移的過程。識別基團(tuán)與被分析物結(jié)合之前，熒光基團(tuán)受激發(fā)，最終被光激發(fā)到激發(fā)態(tài)的電子不能躍遷到基態(tài)，使得熒光基團(tuán)的熒光淬滅。而識別基團(tuán)與被分析物結(jié)合后，PET過程受阻，熒光基團(tuán)的熒光得以恢復(fù)。

PET過程可以用前線軌道理論具體解釋：當(dāng)識別基團(tuán)不存在時，熒光團(tuán)被光激發(fā)后，其最高占據(jù)軌道（HOMO）的一個電子躍遷到最低空軌道（LUMO）,能夠產(chǎn)生熒光；若外來識別基團(tuán)的HOMO或LOMO軌道介于熒光團(tuán)兩軌道能量之間，此時就可以發(fā)生識別基團(tuán)與熒光團(tuán)之間的電子轉(zhuǎn)移而導(dǎo)致熒光的猝滅。即PET過程阻止了熒光團(tuán)的一個電子從激發(fā)態(tài)到基態(tài)的非輻射躍遷途徑，降低了熒光團(tuán)的量子產(chǎn)率，表現(xiàn)為熒光強(qiáng)度的減弱或淬滅。PET識別分析物理論示意圖

總的來說，識別基團(tuán)對熒光基團(tuán)的電子轉(zhuǎn)移，即識別基團(tuán)的HUMO軌道上的電子占據(jù)了熒光基團(tuán)的HOMO軌道；熒光基團(tuán)對識別基團(tuán)的電子轉(zhuǎn)移(PET2),即識別基團(tuán)LUMO消耗掉了熒光基團(tuán)被激發(fā)的電子，兩者最終導(dǎo)致熒光基團(tuán)被激發(fā)的電子不能回到基態(tài)，使熒光被淬滅。2、分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移

（ICT，intramolecularchargetransfer）

分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移是指分子在激發(fā)態(tài)時發(fā)生分子內(nèi)電子轉(zhuǎn)移，造成正負(fù)電荷分離，形成分子電荷轉(zhuǎn)移態(tài)。分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移熒光探針分子通常是熒光團(tuán)上同時連有推電子基團(tuán)（電子給體，Donor）和吸電子基團(tuán)（電子受體，Acceptor）,通過π鍵提供電子轉(zhuǎn)移的通道，形成強(qiáng)的推-拉作用的共軛體系，其吸電子基團(tuán)或推電子基團(tuán)本身充當(dāng)識別基團(tuán)的一部分。當(dāng)識別基團(tuán)和被分析物結(jié)合后，作為識別基團(tuán)的供電子部分或拉電子部分的推拉電能力發(fā)生的改變，整個體系的的π電子結(jié)構(gòu)重新分布，從而導(dǎo)致吸收光譜，發(fā)射光譜發(fā)生變化，主要是光譜紅移或藍(lán)移。識別基團(tuán)分別為電子供體和電子受體的ICT過程光譜移動示意圖（其中D、A分別表示電子給體和電子受體）3熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET,fluorescenceresonaceenergytransfer）

熒光共振能量轉(zhuǎn)移指一個熒光體系含有兩個熒光團(tuán)，一個充當(dāng)能量供體D，另一個為能量受體A，當(dāng)用供體D的激發(fā)去激發(fā)熒光體系時，可以發(fā)生從D到A的非輻射能量轉(zhuǎn)移，從而發(fā)射出受體熒光團(tuán)的熒光。熒光共振能量轉(zhuǎn)移發(fā)生必須具備以下幾個條件：（1）能量供體熒光團(tuán)D的熒光發(fā)射位于短波長處，且發(fā)射光譜和能量受體熒光團(tuán)A的吸收光譜有一定重疊，能量受體能夠在能量供體的發(fā)射波長處吸收能量；（2）能量供體與能量受體相隔的距離必須遠(yuǎn)大于它們之間的碰撞直徑（有時甚至為70-100?）；（3）能量供體與能量受體還必須以適當(dāng)?shù)姆绞脚帕??；衔?0是以氟硼熒和羅丹明為熒光團(tuán)設(shè)計(jì)的FRET熒光探針，由于氟硼熒的熒光發(fā)射光譜與羅丹明的吸收光譜有較大范圍重疊，通過連接臂連接，氟硼熒作為能量供體，羅丹明作為能量受體，加入被分析物后，熒光共振能量轉(zhuǎn)移過程便能實(shí)現(xiàn)。加入汞離子之前，表現(xiàn)為氟硼熒的綠色熒光，汞離子的存在能促使氨基硫脲形成噁二唑酮類化合物而致使羅丹明內(nèi)酰胺結(jié)構(gòu)開環(huán)，此時氟硼熒的能量傳遞給羅丹明，最終使得共振能量轉(zhuǎn)移發(fā)生，氟硼熒的發(fā)射峰減弱，從而發(fā)射出羅丹明的紅色熒光，從而實(shí)現(xiàn)了對汞離子的比率型檢測。

10114激基締合物/復(fù)合物（excimer/exciplex）

激基締合物指一些熒光團(tuán)在激發(fā)態(tài)與另一相同或不同的基態(tài)熒光團(tuán)接近時往往能生產(chǎn)激基締合物（通過π-π堆積作用形成激基締合物）可觀察到雙重?zé)晒?。它的發(fā)射光譜不同于單體的熒光，新的熒光會產(chǎn)生一定的紅移，且出現(xiàn)強(qiáng)而寬的，無精細(xì)結(jié)構(gòu)發(fā)射峰。這種作用本質(zhì)上是光致電荷轉(zhuǎn)移作用，在兩個相同的熒光分子之間形成激基締合物以及在兩個完全不同的熒光分子之間形成激基復(fù)合物，可以用下式表示：A*+AA*-A(excimer)A*+BA*-B(exciplex)化合物12基于激基締合物的熒光探針，加入汞離子之前兩個芘分子相距很遠(yuǎn)，因此發(fā)射的是芘單體熒光，當(dāng)汞離子存在時，O、N原子與其配位形成化合物13，從而拉近了兩個芘分子之間的距離，且讓其平行排列，最后產(chǎn)生二聚體熒光。

12135、有機(jī)載體在熒光分子探針中的應(yīng)用

羅丹明羅丹明及其衍生物是一種氧雜蒽類熒光染料，由于苯環(huán)間氧橋的存在，從而分子具有剛性共平面結(jié)構(gòu)，使其分子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性增強(qiáng)，開環(huán)狀態(tài)下，在激發(fā)光的作用下能產(chǎn)生強(qiáng)烈的吸收和熒光，其最大發(fā)射波長位于500-700nm之間，為紅色可見光區(qū)，可有效的避開生物體系背景熒光，從而能提高探針的靈敏度，因此是生物分析中經(jīng)常用到的熒光探針，具有很高的研究和應(yīng)用價(jià)值。

檢測銀離子:化合物16和17，加入了Ag+后，該探針熒光由單體熒光變?yōu)榧せ喓衔锏臒晒猓瑢g+有高靈敏度和高選擇性。其中，化合物17對Ag+只有微弱的響應(yīng)，這是由于化合物16帶有羥基與Ag+配位起了決定性的作用。在自由態(tài)時，化合物18表現(xiàn)出很強(qiáng)的激基締合物熒光，Ag+存在時與氮配位，使兩個芘分子距離變遠(yuǎn)，激基締合物熒光減弱，單體熒光增強(qiáng)，因此可以對銀離子進(jìn)行比率型檢測。16-171816R=OH17R=H有機(jī)熒光探針最新研究進(jìn)展

隨著熒光探針的合成及應(yīng)用技術(shù)的不斷改進(jìn),人們對有機(jī)熒光化合物的認(rèn)識和研究也不斷深入,有機(jī)熒光探針的發(fā)展前景將越來越廣闊。1BODIPY類二氟化硼－2－二吡咯甲烷(BODIPY)是一類重要的有機(jī)熒光染料，由于其分子結(jié)構(gòu)易于改性，近十年來研究人員合成了一系列的BODIPY衍生物，并在熒光探針技術(shù)上得到應(yīng)用。這類熒光染料具有熒光量子產(chǎn)率高、摩爾吸光系數(shù)大、穩(wěn)定性好、對pH、溶液極性不敏感等優(yōu)點(diǎn)，因而在金屬離子檢測、PH值測定、DNA的標(biāo)記及測序等方面得到重要應(yīng)用。1.1基于BODIPY的金屬離子熒光分子探針研究進(jìn)展

對金屬離子探針的研究早在20世紀(jì)七八十年代就已開始，2008年，SerdarAtilgan

等人通過逐步法合成了一種高靈敏的鋅離子熒光探針。WenwuQin,MukuleshBaruah等人合成了含氮雜冠醚取代基的BODIPY衍生物，這種基于BODIPY的染料分子表現(xiàn)強(qiáng)烈的依賴溶劑的熒光發(fā)射特征XiaojunPeng研究組合成了一個能專識別Cd2+離子的熒光探針，該探針具有較好的細(xì)胞穿透性，并且首次被應(yīng)用于活體細(xì)胞內(nèi)Cd2+的檢測，其機(jī)理為分內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移機(jī)理(IcT)。探針的最大發(fā)射波長為656nm與Cd2+絡(luò)合后藍(lán)移至597nln，而Zn2+及其它金屬離子沒有干擾，結(jié)構(gòu)如圖所示YufangXu和XuhongQian則根據(jù)PET機(jī)理設(shè)計(jì)合成另一種高選擇性的鎘離子熒光探針。探針分子本身在溶液中幾乎無熒光，而且不易受PH的影響。Zn2+,Pb2+,Cr3+,Fe3+,Cu2+,Hg2+,Ag+,Ba2+,Mg2+,Co2+,Cs+,Na+,K+,Ca2+和Ni2+的存在幾乎不影響熒光發(fā)射廣譜，對Cd2+展示出高度的選擇性。

MingjianYuan等設(shè)計(jì)了一個基于PET和ICT雙重機(jī)理的Hg2+熒光探針，該探針包含有兩個受體，分別以PET機(jī)理和ICT機(jī)理與Hg2+結(jié)合。加入Hg2+前熒光較弱，最大發(fā)射波長在668nm，而絡(luò)合Hg2+后熒光增強(qiáng)超過7倍，最大發(fā)射波長藍(lán)移到578nm，對Hg2+顯示出良好的選擇性和高度的敏感性。結(jié)構(gòu)如圖所示XuhongQian等以BODIPY為熒光團(tuán)，以聚酰胺為受體，合成一系列基于PET機(jī)理的Hg2+熒光探針，每個探針分子能夠絡(luò)合兩個Hg2+，熒光增強(qiáng)顯著，該系列探針擁有專一的選擇性、高靈敏性以及良好的水溶性，也許是因?yàn)樗苄蕴盟圆荒軌蛲高^細(xì)胞膜，未能做到在細(xì)胞內(nèi)熒光成像。結(jié)構(gòu)如圖所示1.2基于BODIPY的pH熒光分子探針的研究進(jìn)展

pH在許多體系扮演重要角色，因而測定pH具有重大的意義。目前測定pH的方法很多，熒pH熒光探針是其中一種重要手段。相較其他分析方法，pH熒光探針具有不破壞待測體系、高靈敏度的特性，故在細(xì)胞生物學(xué)、藥物學(xué)、生物化學(xué)上應(yīng)用廣泛。近年來，人們合成了多種pH熒光探針。1.3基于BODIPY的染料的其它熒光探針

目前以BODIPY染料為母體結(jié)構(gòu)的熒光探針多數(shù)都是用于檢測金屬離子及pH的，但研究人員的興趣不局限于此，近來利用BODIPY染料合成了一些可以對某些酸、酸根離子或氧化物響應(yīng)的熒光探針。EnginU.Akkaya

合成了一種BODIPY衍生物可以檢測溶液中微摩爾濃度的氰離子。當(dāng)溶液有氰離子存在時，這種結(jié)構(gòu)簡單的熒光探針的發(fā)射強(qiáng)度急劇下降，溶液顏色可逆的由紅色變?yōu)樗{(lán)色。熒光探針的合成、結(jié)構(gòu)及可能的作用機(jī)理如圖3.2所示YoungkyuDo

將一種三取代硼烷同BODIPY結(jié)合制備了對氰離子具有高度選擇性的熒光探針，由于高靈敏的熒光響應(yīng)特點(diǎn)，可以檢測到低于微摩爾濃度的氰離子的存在。TetsuoNagano在07年合成了一種新