DB51T 3006-2023水稻對南方水稻黑條矮縮病抗性鑒定技術(shù)規(guī)程

ICS65.020.01CCSB16DB51四川省地方標(biāo)準(zhǔn)DBT023定技術(shù)四川省市場監(jiān)督管理局發(fā)布 C 前言請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。四川省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳提出、歸口并解釋。業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所。布。4試劑與設(shè)備水稻對南方水稻黑條矮縮病抗性鑒定技術(shù)規(guī)程本文件規(guī)定了水稻品種(資源)抗南方水稻黑條矮縮病田間病圃鑒定和人工接種鑒定的技術(shù)方法。本文件適用于水稻品種(資源)對南方水稻黑條矮縮病的抗性鑒定。范性引用文件，GBT15794稻飛虱測報(bào)調(diào)查規(guī)范NY/T2631南方水稻黑條矮縮病測報(bào)技術(shù)規(guī)范定義1號(hào)。ceptiblestrain方水稻黑條矮縮病癥狀的水稻植株。susceptibleplantratenontoxicwhitebackedplanthopper。numberofeffectiveidentificationplants節(jié)初期存活的參鑒水稻株數(shù)?？烧{(diào)控溫光的養(yǎng)蟲室，溫度保持于26℃±1℃范圍內(nèi)，相對濕度80%~90%，光照每天12h；1000mL玻田間病圃鑒定5.1田間自然誘發(fā)鑒定5.1.1鑒定病圃的選擇與設(shè)置為田間鑒定病圃。.1.2鑒定病圃5.1.2.1分行初步篩選預(yù)留10株參試品種空間。水稻參試品種按同樣規(guī)格單本移栽于TN1保護(hù)行或誘發(fā)行之間，各品種移栽35.1.2.2小區(qū)重復(fù)鑒定.1.3播種與移栽在常年第一代白背飛虱遷入或發(fā)生高峰前7d~10d播種感病對照品種TN1，每隔10d再播種一次，共播種3次~4次，直至第一代白背飛虱遷入或田間白背飛虱已形成一定的種群數(shù)量。參試品種播種一次，播種時(shí)期較當(dāng)?shù)厣a(chǎn)常規(guī)播種期晚5d~10d。種子經(jīng)浸泡、催芽、育苗移栽方式種植。育秧方式為濕潤kgkgmddcmcm.1.4水肥管理及病蟲草防治與常規(guī)管理一致。秧田期較常規(guī)管理增施尿素5kg/667m2。本田管理較常規(guī)肥水管理增施尿.1.5白背飛虱蟲量及帶毒率調(diào)查5.1.5.1蟲量調(diào)查GBT5794，用瓷盤拍蟲法統(tǒng)計(jì)蟲量。5.1.5.2帶毒率調(diào)查頭以上，從中隨機(jī)選取100頭，用RT-PCR檢測(參照本附錄A)小批量白背飛虱或Dot-ELISA(參照NY/T2631附錄C)檢測大批量白背飛虱種群帶毒率。5.1.5.3有效傳毒蟲量計(jì)算田間鑒定的有效傳毒蟲量用FVS表示，按式(1)計(jì)算。FVS=N×PVS………………(1)N——白背飛虱蟲量，單位為頭每公頃(頭/hm2)；PVS——白背飛虱帶毒率，單位為百分率(%)。當(dāng)FVS值處于1.5×106~6.0×106頭/hm2范圍內(nèi)，方可進(jìn)行下一步的病情調(diào)查。.2病情調(diào)查.2.1調(diào)查時(shí)間和內(nèi)容5.2.1.1拔節(jié)期調(diào)查拔節(jié)株數(shù)，參照附錄C的表C.1。5.2.1.2抽穗黃熟期調(diào)查.2.2病株標(biāo)準(zhǔn)5.2.2.1分蘗、拔節(jié)期癥狀5.2.2.2抽穗黃熟期癥狀基部可見縱向皺褶；在莖稈下部節(jié)間和節(jié)上可見蠟白色或黑褐色瘤狀突起。以黃熟期初期植株有1個(gè)以上不孕、不實(shí)(結(jié)實(shí)粒少于全穗1/3)分蘗癥狀為感病單株判定標(biāo)準(zhǔn)。.2.3相對發(fā)病率計(jì)算Rif=(nif+nd)/(ntf+nd)×100%…………(2)式中:Rif——抽穗黃熟期感病株率，單位為百分率(%)；nd——分蘗期感病株且在抽穗黃熟期死亡株數(shù)，單位為株；相對發(fā)病率Rr表示，數(shù)值以%計(jì)，按式(3)計(jì)算：Rr=Rif/Rsf×100%…………(3)式中:Rif——抽穗黃熟期感病株率，單位為百分率(%)；接種鑒定接種用白背飛虱的準(zhǔn)備白背飛虱的采集無毒白背飛虱種群的獲得選取飼喂白背飛虱的水稻種子用水浸種24h后，紗布覆蓋，恒溫箱32℃±2℃催芽24h~48h，選取發(fā)芽良好的種子25粒~30粒均勻播于盛有自然肥力土壤的內(nèi)徑80mm~110mm塑料杯中；大約6d~7d后，待苗長至1.5葉期時(shí)，將待產(chǎn)的單頭白背飛虱移入杯中產(chǎn)卵，約3d后將成蟲移出，單獨(dú)保存，7d~10d行繁殖，每批隨機(jī)取出30頭~50頭白背飛虱進(jìn)行帶毒率檢測，帶毒率始終為0%，則該批白背飛虱為無毒病株準(zhǔn)備病株的采集縮病疑似癥狀的水稻植株種植在防蟲網(wǎng)籠中的塑料桶中。病株檢測確定采病株葉片按照NY/T2631附錄C的規(guī)定或參考附錄A進(jìn)行檢測，確認(rèn)感染南方水稻黑條矮縮病毒則飼毒方法將7.2的病株種于內(nèi)徑100mm~200mm大燒杯中,土面覆蓋濾紙,將適量1齡~2齡無毒白背飛虱移入其中,并用60目防蟲網(wǎng)封口。飼毒2d后將蟲移入內(nèi)徑80mm~110mm，預(yù)先育有白背飛虱喜食品種如TN1育苗方法參試品種，含感病對照經(jīng)5.1.3方法浸種、催芽；選取30粒左右發(fā)芽良好的種子均勻播于盛有自然肥力土壤的內(nèi)徑80mm~110mm塑料杯中。每參試品種重復(fù)3次。接種時(shí)期水稻幼苗生長至1.5葉~2葉齡期。接種方法.3已飼毒且度過循回期的白背飛虱成蟲接種種群，并計(jì)算有效接種蟲量，人工接種鑒定的有效接種蟲量用IVS表示，數(shù)值以頭/株計(jì)，按式(4)計(jì)算：IVS=N×PVS ()4式中:IVS位為頭/株；N——接種白背飛虱數(shù)量，單位為頭。IVS。從接種種群中隨機(jī)抽取50頭以上蟲，測定帶d將秧苗移出塑料杯，至15℃~30℃條件下培育，常規(guī)管理，定期觀察植株發(fā)病情況。調(diào)查時(shí)間病株標(biāo)準(zhǔn) (按照NY/T2631附錄C的規(guī)定)或RT-PCR檢測確認(rèn)(參考附錄A)。相對發(fā)病率計(jì)算若出現(xiàn)感病對照的平均感病株率小于30％，則重復(fù)進(jìn)行試驗(yàn)。按式(3)方法計(jì)算相對發(fā)病率。苗期感病株率用Rit表示，數(shù)值以%計(jì)，按式(5)計(jì)算：Rit=nit/ntt×100%…………(5)式中:Rit——苗期感病株率，單位為百分率(%)；ntt——接種病毒的總株數(shù)，單位為株。價(jià)抗性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)見附錄B.1?？剐栽u定附錄A(規(guī)范性)A.1試劑(焦碳酸乙二酯)水處理后高壓滅菌并分裝。A.1.1A.1.2A.1.3A.1.4A.1.5A.1.6A.1.7A.1.8A.1.9A.1.10A.1.11A.1.12A.1.13A.1.14agentsInvitrogen冷。75%酒精(DEPC水配制)。瓊脂糖。Tris堿。冰乙酸。 50×TAE配方:Tris堿242g；冰乙酸57.1ml；EDTA(0.5mol/L)100ml，定容至1000ml。PrimeScriptTMOneStepRT-PCRKit一步反轉(zhuǎn)錄試劑盒(購自寶生物工程(大連)有限公司)。DNAMarker(國產(chǎn))。 A.2儀器設(shè)備A.2.2高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)(離心速度12000r/min以上)。A.2.3冰箱(2℃~8℃和-20℃兩種)。A.2.4微量可調(diào)移液器(2μL、10μL、100μL、1000μL)及配套帶濾芯吸頭。A.2.5Eppendorf管(0.2mL、1.5mL、2.0mL)。A2.6研砵。A.3檢測引物正向引物SRB-S10-F5’-CCACATCGCGTCATCTCAAACTAC-3’反向引物SRB-S10-R5’-CGGTCTTACGCAACGATGAACC-3’A.4試驗(yàn)操作A.4.1采樣工具下列采樣工具必須經(jīng)(121±2)℃，15min高壓滅菌并烘干：LA.4.2樣品采集置于裝有液氮的保溫桶內(nèi)，盡快運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室4℃條件下保存待檢，存放不能超過7d。A.4.3樣品保存。A.4.4樣品處理A碎至粉末TRIzolreagentA.4.4.3每1mLTRIzolreagent加入0.2mL氯仿，蓋好管蓋，充分震蕩15s，室溫靜置5min；nminL于吸水紙上，盡量沾干液體(不同樣品須在吸水紙不同地方沾干)。保存須放置-70℃冰箱。A.4.5檢測A.4.5.1擴(kuò)增試劑準(zhǔn)備A試反應(yīng)體系PrimeScriptStepEnzymeMixμLStepBuffer(DyePlus)SRBSFμL0.4μMSRBS10-RμL0.4μMplateRNA1μL~3μLNaseFreedHO體積至20μLA.4.5.2循環(huán)條件設(shè)置ssmin~30個(gè)循環(huán)；A.4.5.3電泳檢測取PCR反應(yīng)液(約5μL)于1%瓊脂糖凝膠中電泳(120V，0.5×TAE緩沖液體系),電泳(20min~30min)A.5結(jié)果判定A.5.1結(jié)果分析條件設(shè)定根據(jù)成像結(jié)果，凝膠中根據(jù)DNAMarker標(biāo)識(shí)在920bp的水平位置，如果陽性對照和檢測樣品均具有病毒。附錄B(規(guī)范性)品種抗性評價(jià)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)縮病品種抗性評價(jià)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)見表B.1。B黑條矮縮病抗性評價(jià)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)00.1~55.1~1515.1~3030.1~60>60.1矮縮病病情級(jí)別及癥狀見表B.2。B黑條矮縮病病情級(jí)別及癥狀均能正常抽穗、結(jié)實(shí)，無明顯矮化分蘗，感病單株數(shù)為0。結(jié)實(shí)。-2個(gè)分蘗明顯矮化，頂部有小穗結(jié)實(shí)，但結(jié)實(shí)率低于1/3響、穎殼褐變分蘗。蘗明顯矮化或全株矮化。附錄C(資料性)品種抗性調(diào)查記載表矮縮病品種抗性調(diào)查記載表—分蘗拔節(jié)期見表C.1。C稻黑條矮縮病品種抗性調(diào)查記載表—分蘗拔節(jié)期期調(diào)查日期調(diào)查人記載人AAAAAAAAA………矮縮病品種抗性調(diào)查記載表—分蘗拔節(jié)期見表C.1。C稻黑條矮縮病品種抗性調(diào)查記載表—抽穗黃熟期期調(diào)查日期調(diào)查人記載人AAAAAAAAA………附錄D(資料性)品種抗性田間鑒定示意圖品種抗性田間鑒定示意圖見圖D.1。TNTNTNTNTNTNTNTNTN1TN1TN1TN1TNTNTNTNTNTNTNTNTN1TN1TN1TN1TN1TN1TN1A1A1A1A1A1A1A1A1A1A1TN1TN1TN1TN1TN1TN1A2A2A2A2A2A2A2A2A2A2TN1TN1TN1TN1TN1TN1A3A3A3A3A3A3A3A3A3A3TN1TN1TN1TN1TN1TN1A4A4A4A4A4A4A4A4A4A4TN1TN1TN1TN1TN1TN1A5A5A5A5A5A5A5A5A5A5TN1TN1TN1TN1TN1TN1A6A6A6A6A6A6A6A6A6A6TN1TN1TN1TN1TN1TN1A7A7A7A7A7A7A7A7A7A7TN1TN1TN1TN1TN1TN1A8A8A8A8A8A8A8A8A8A8TN1TN1TN1TN1TN1TN1A9A9A9A9A9A9A9A9A9A9TN1TN1TN1TN1TN1TN1A10A10A10A10A10A10A10A10A10A10TN1TN1TN1TN1TN1TN1TN1TN1TN1TN1TN1TN1TN1TN1TN1TN1TN1TN1TN1TN1TN1TN1TN1TN1TN1TN1TN1TN1TN1TN1A1A1A1A1A1A1A1A1A1A1TN1TN1TN1TN1TN1TN1A2A2A2A2A2A2A2A2A2A2TN1TN1TN1TN1TN1TN1A3A3A3A3A3A3A3A3A3A3TN1TN1TN1TN1TN1TN1A4A4A4A4A4A4A4A4A4A4TN1TN1TN1TN1TN1TN1A5A