分子生物學C 自整

/Immunologybasedtechniques:ELISA酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)即將已知的抗原或抗體吸附在固相載體表面，使酶標記的抗原抗體反應在固相表面進行的技術。該技術可用于檢測大分子抗原和特異性抗體等，具有快速、靈敏、簡便、載體易于標準化等優(yōu)點?；驹?它采用抗原與抗體的特異反應將待測物與酶連接，然后通過酶與底物產(chǎn)生顏色反應，用于定量測定。測定的對象可以是抗體也可以是抗原。在這種測定方法中有3種必要的試劑：①固相的抗原或抗體（免疫吸附劑）②酶標記的抗原或抗體（標記物）③酶作用的底物（顯色劑）測量時，抗原（抗體）先結合在固相載體上，但仍保留其免疫活性，然后加一種抗體（抗原）與酶結合成的偶聯(lián)物（標記物），此偶聯(lián)物仍保留其原免疫活性與酶活性，當偶聯(lián)物與固相載體上的抗原（抗體）反應結合后，再加上酶的相應底物，即起催化水解或氧化還原反應而呈顏色。其所生成的顏色深淺與欲測的抗原（抗體）含量成正比。這種有色產(chǎn)物可用肉眼、光學顯微鏡、電子顯微鏡觀察，也可以用分光光度計（酶標儀）加以測定。其方法簡單，方便迅速，特異性強。特點:靈敏性高:該測定法的靈敏度來自作為報告基團的酶。眾所周知,酶是一種有機催化劑，很少量的酶即可誘導大量的催化反應，產(chǎn)生可供觀察的顯色反應現(xiàn)象。因此該體系常被稱為酶放大體系。ELISA實現(xiàn)了在細胞或亞細胞水平上示蹤抗原或抗體的所在部位，或在微克、甚至納克水平上對其進行定量。特異性強:其特異性來自抗體或抗原的選擇性?？乖贵w的結合實質(zhì)上只發(fā)生在抗原的抗原決定簇與抗體的抗原結合位點之間。由于兩者在化學結構和空間構型上呈互補關系，所以抗原抗體反應具有高度的特異性。Immunohistochemistry免疫組化，是應用免疫學基本原理——抗原抗體反應，即抗原與抗體特異性結合的原理，通過化學反應使標記抗體的顯色劑（熒光素、酶、金屬離子、同位素）顯色來確定組織細胞內(nèi)抗原（多肽和蛋白質(zhì)），對其進行定位、定性及相對定量的研究，稱為免疫組織化學技術(immunohistochemistry)或免疫細胞化學技術(immunocytochemistry)?；驹恚嚎贵w和抗原之間的結合具有高度的特異性，免疫組織化學正是利用了這一原理。先將組織或細胞中的某種化學物質(zhì)提取出來，以此作為抗原或半抗原，通過免疫動物后獲得特異性的抗體，再以此抗體去探測組織或細胞中的同類的抗原物質(zhì)。由于抗原與抗體的復合物是無色的，因此還必須借助于組織化學的方法將抗原抗體結合的部位顯示出來，以其達到對組織或細胞中的未知抗原進行定性，定位或定量的研究。免疫組織化學的臨床應用主要包括以下幾方面：⑴惡性腫瘤的診斷與鑒別診斷；⑵確定轉移性惡性腫瘤的原發(fā)部位；⑶對某類腫瘤進行進一步的病理分型；⑷軟組織腫瘤的治療一般需根據(jù)正確的組織學分類，因其種類多、組織形態(tài)相像，有時難以區(qū)分其組織來源，應用多種標志進行免疫組化研究對軟組織腫瘤的診斷是不可缺少的；⑸發(fā)現(xiàn)微小轉移灶，有助于臨床治療方案的確定，包括手術范圍的確定。⑹為臨床提供治療方案的選擇。WesternBlotting蛋白質(zhì)印跡法（免疫印跡試驗）即WesternBlot。它是分子生物學、生物化學和免疫遺傳學中常用的一種實驗方法。其基本原理是通過特異性抗體對凝膠電泳處理過的細胞或生物組織樣品進行著色。通過分析著色的位置和著色深度獲得特定蛋白質(zhì)在所分析的細胞或組織中表達情況的信息。蛋白免疫印跡(WesternBlot)是將電泳分離后的細胞或組織總蛋白質(zhì)從凝膠轉移到固相支持物NC膜或PVDF膜上，然后用特異性抗體檢測某特定抗原的一種蛋白質(zhì)檢測技術，現(xiàn)已廣泛應用于基因在蛋白水平的表達研究、抗體活性檢測和疾病早期診斷等多個方面。基本原理：與SouthernBlot或NorthernBlot雜交方法類似，但WesternBlot法采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質(zhì)，“探針”是抗體，“顯色”用標記的二抗。經(jīng)過PAGE(聚丙烯酰胺凝膠電泳)分離的蛋白質(zhì)樣品，轉移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對應的抗體起免疫反應，再與酶或同位素標記的第二抗體起反應，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達的蛋白成分。該技術也廣泛應用于檢測蛋白水平的表達。Immunoprecipitation免疫沉淀是利用抗體特異性反應純化富集目的蛋白的一種方法。抗體與細胞裂解液或表達上清中相應的蛋白結合后，再與蛋白A/G（ProteinA/G）或二抗偶聯(lián)的agarose或Sepharose珠子孵育，通過離心得到珠子-蛋白A/G或二抗-抗體-目的蛋白復合物，沉淀經(jīng)過洗滌后，重懸于電泳上樣緩沖液，煮沸5-10min，在高溫及還原劑的作用下，抗原與抗體解離，離心收集上清，上清中包括抗體、目的蛋白和少量的雜蛋白。優(yōu)點（1）相互作用的蛋白質(zhì)都是經(jīng)翻譯后修飾的，處于天然狀態(tài)；（2）蛋白的相互作用是在自然狀態(tài)下進行的，可以避免人為的影響；（3）可以分離得到天然狀態(tài)的相互作用蛋白復合物。缺點（1）可能檢測不到低親和力和瞬間的蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用；（2）兩種蛋白質(zhì)的結合可能不是直接結合，而可能有第三者在中間起橋梁作用；（3）必須在實驗前預測目的蛋白是什么，以選擇最后檢測的抗體，所以，若預測不正確，實驗就得不到結果，方法本身具有冒險性。（4）靈敏度沒有親和色譜高。Cytometry流式細胞術（FlowCytometry,FCM）是一種在功能水平上對單細胞或其他生物粒子進行定量分析和分選的檢測手段，它可以高速分析上萬個細胞，并能同時從一個細胞中測得多個參數(shù)，與傳統(tǒng)的熒光鏡檢查相比，具有速度快、精度高、準確性好等優(yōu)點，成為當代最先進的細胞定量分析技術。流式細胞儀(Flowcytometry,FCM)將流體噴射技術、激光光學技術、電子技術和計算機技術等集于一體,較其它方法有不可比擬的優(yōu)越性，既可定性又可定量,且具有簡單、快速和敏感性高的特點,可進行多參數(shù)和活體細胞分析。在APO的研究得到較為廣泛的應用，開辟了新途徑。特點1.測量速度快；2.可進行多參數(shù)測量；3.是一門綜合性的高科技方法（FCM綜合了光學，電子學，流體力學，細胞化學，免疫學，激光和計算機等多門學科和技術）；4.既是細胞分析技術，又是精確的分選技術。Animalmodels:動物疾病模型主要用于實驗生理學、實驗病理學和實驗治療學（包括新藥篩選）研究。人類疾病的發(fā)展十分復雜，以人本身作為實驗對象來深入探討疾病發(fā)生機制，推動醫(yī)藥學的發(fā)展來之緩慢，臨床積累的經(jīng)驗不僅在時間和空間上都存在局限性，而且許多實驗在道義上和方法上也受到限制。而借助于動物模型的間接研究，可以有意識地改變那些在自然條件下不可能或不易排除的因素，以便更準確地觀察模型的實驗結果并與人類疾病進行比較研究，有助于更方便、更有效地認識人類疾病的發(fā)生發(fā)展規(guī)律，研究防治措施。動物模型的優(yōu)越性主要表現(xiàn)在以下幾下方面。（一）避免了在人身上進行實驗所帶來的風險（二）臨床上平時不易見到的疾病可用動物隨時復制出來（三）可以克服人類某些疾病潛伏期長，病程長和發(fā)病率低的缺點（四）可以嚴格控制實驗條件，增強實驗材料的可比性（五）可以簡化實驗操作和樣品收集（六）有助于更全面地認識疾病的本質(zhì)因此利用動物疾病模型來研究人類疾病，可以克服平時一些不易見到，而且不便于在病人身上進行實驗的各種人類疾病的研究。同時還可克服人類疾病發(fā)生發(fā)展緩慢，潛伏期長，發(fā)病原因多樣，經(jīng)常伴有各種其它疾病等因素的干擾，可以用單一的病因，在短時間內(nèi)復制出典型的動物疾病模型，對于研究人類各種疾病的發(fā)生、發(fā)展規(guī)律和防治疾病療效的機理等是極為重要的手段和工具。GeneticsmodelDevelopmentmodelSpecialmodel(e.g.languagemodelandcircadianmodel)DiseasesmodelCellculturebasedtechniquesCellviabilitytest細胞活力檢測：由組織中分離細胞檢查活力以了解分離過程對細胞是否有損傷作用。復蘇后的細胞也要檢查細胞活力，了解凍存和復蘇的效果。Cellmigrationtest細胞遷移也稱為細胞爬行、細胞移動或細胞運動，是指細胞在接收到遷移信號或感受到某些物質(zhì)的梯度后而產(chǎn)生的移動。細胞遷移為細胞頭部偽足的延伸、新的黏附建立、細胞體尾部收縮在時空上的交替過程。細胞遷移是正常細胞的基本功能之一，是機體正常生長發(fā)育的生理過程，也是活細胞普遍存在的一種運動形式。胚胎發(fā)育、血管生成、傷口愈合、免疫反應、炎癥反應、動脈粥樣硬化、癌癥轉移等過程中都涉及細胞遷移。細胞凋亡檢測：為了研究某一蛋白質(zhì)在細胞遷移中所扮演的角色，一般來說科學家可以將某蛋白的編碼基因進行突變，甚至應用新近的RNAi現(xiàn)象，或者加入該蛋白質(zhì)的阻斷劑（inhibitor）來抑制某一個蛋白質(zhì)的表現(xiàn)，并分析此抑制對于細胞遷移的影響，反而得知被抑制的蛋白質(zhì)與細胞遷移的作用。Apoptosisdetection細胞凋亡檢測：在胚胎發(fā)育、造血、免疫系統(tǒng)的成熟以及維護正常組織和器官的細胞恒定與生長平衡，乃至機體衰老方面都起著重要作用。因此，有關凋亡的研究在臨床和基礎等各個領域已經(jīng)廣泛開展,凋亡細胞的檢測方法顯得非常重要。Cellcyclesynchronization在一般培養(yǎng)條件下，群體中的細胞處于不同的細胞周期時相之中。為了研究某一時相細胞的代謝、增殖、基因表達或凋亡，常需采取一些方法使細胞處于細胞周期的同一時相，這就是細胞同步化技術。選用DNA合成抑制劑可逆地抑制S期細胞DNA合成而不影響其他細胞周期運轉，最終可將細胞群體阻斷在G1/S期交界處；一些抑制微管聚合的藥物，因抑制有絲分裂裝置的形成和功能行使，可將細胞阻斷在有絲分裂中期，即使細胞同步于M期。同步化細胞的檢測：對各個時期的同步化細胞可通過流式細胞術來鑒定其細胞周期，通過比較各時相細胞的百分比，看是否達到預期的目的。HighcontentscreeningHCS是指在保持細胞結構和功能完整性的前提下，同時檢測被篩樣品對細胞形態(tài)、生長、分化、遷移、凋亡、代謝途徑及信號轉導各個環(huán)節(jié)的影響,在單一實驗中獲取大量與基因、蛋白及其他細胞成分相關的信息,確定其生物活性和潛在毒性的過程。同時,也是一種應用高分辨率的熒光數(shù)碼影像系統(tǒng)，旨在獲得被篩樣品對細胞產(chǎn)生的多維立體和實時快速的生物效應信息,在細胞水平上檢測多個指標的多元化、功能性篩選技術平臺。HCS的優(yōu)勢高內(nèi)涵篩選的篩選結果是多樣化的,它以多指標多靶點共同作用為主要特點,涉及的靶點包括胞內(nèi)成分、細胞的膜受體、細胞器等。從篩選載體上看，高內(nèi)涵藥物篩選與高通量藥物篩選并沒有顯著的區(qū)別，也在微孔板上進行。其優(yōu)點是它的檢測體積并未因檢測指標增加而增高，操作步驟同樣簡單可行、自動化。更重要的是,獲取信息是以細胞為單位，而不像是以微板孔為單位，這就意味著研究者可以從細胞群體中的各種反應獲取信息，而不是像以前那樣信息僅僅來源于一個微板孔中的所有細胞的平均反應。也就是說，研究者得以用更少的時間和花費進行更多的實驗，獲取更多研究信息和統(tǒng)計相關數(shù)據(jù)?；诩毎男》肿訋旄邇?nèi)涵篩選已用于識別新的有治療作用的先導化合物，目前已對十萬余個化合物展開了基于圖像的篩選。目前高內(nèi)涵藥物篩選主要在影響細胞功能方面應用，例如細胞毒性、G蛋白偶聯(lián)受體調(diào)節(jié)劑、轉錄因子的活化、活性物質(zhì)釋放等?？烧{(diào)節(jié)的掃描模板可用于腔室玻片、多孔板以及組織芯片掃描。多重掃描任務可應用于單個腔室或多孔，對個體實驗設計提供最大的自由度。獲取的數(shù)據(jù)立刻傳輸?shù)奖镜胤掌饕员氵M行有效分析和存儲，獨立于平臺的開放式顯微鏡環(huán)境(OME)接口自動創(chuàng)建鏈接到現(xiàn)有的圖像分析解決方案——總而言之，HCS為單個實驗提供高度的靈活性和真實的圖像，并確保高通量研究所需的自由度，應用廣泛且靈活性強。ImagingbasedtechniquesFluorescentlabeling熒光標記技術指利用一些能發(fā)射熒光的物質(zhì)共價結合或物理吸附在所要研究分子的某個基團上，利用它的熒光特性來提供被研究對象的信息。FRET熒光共振能量轉移當一個熒光分子（又稱為供體分子）的熒光光譜與另一個熒光分子（又稱為受體分子）的激發(fā)光譜相重疊時，供體熒光分子的激發(fā)能誘發(fā)受體分子發(fā)出熒光，同時供體熒光分子自身的熒光強度衰減。FRET程度與供、受體分子的空間距離緊密相關，一般為7～10nm時即可發(fā)生FRET;隨著距離延長，F(xiàn)RET呈顯著減弱。供體和受體之間FRET的效率，可以由E=1/1+(R/R0)exp6反映，其中R表示供體和受體之間的距離，R0表示福氏半徑，依賴供體發(fā)射譜和受體激發(fā)譜的重疊程度，以及供體和受體能量轉移的偶極子的相對方位。發(fā)生原理熒光共振能量轉移是指在兩個不同的熒光基團中，如果一個熒光基團（供體Donor）的發(fā)射光譜與另一個基團（受體Acceptor）的吸收光譜有一定的重疊，當這兩個熒光基團間的距離合適時（一般小于100?），就可觀察到熒光能量由供體向受體轉移的現(xiàn)象，即以前一種基團的激發(fā)波長激發(fā)時，可觀察到后一個基團發(fā)射的熒光。簡單地說，就是在供體基團的激發(fā)狀態(tài)下由一對偶極子介導的能量從供體向受體轉移的過程，此過程沒有光子的參與，所以是非輻射的，供體分子被激發(fā)后，當受體分子與供體分子相距一定距離，且供體和受體的基態(tài)及第一電子激發(fā)態(tài)兩者的振動能級間的能量差相互適應時，處于激發(fā)態(tài)的供體將把一部分或全部能量轉移給受體，使受體被激發(fā)，在整個能量轉移過程中，不涉及光子的發(fā)射和重新吸收。如果受體熒光量子產(chǎn)率為零，則發(fā)生能量轉移熒光熄滅；如果受體也是一種熒光發(fā)射體，則呈現(xiàn)出受體的熒光，并造成次級熒光光譜的紅移。Infraredimaging紅外成像技術是一項前途廣闊的高新技術。比0.78微米長的電磁波位于可見光光譜紅色以外，稱為紅外線，又稱紅外輻射。是指波長為0.78—1000微米的電磁波，其中波長為0.78—2.0微米的部分稱為近紅外，波長為2.0—1000微米的部分稱為熱紅外線。自然界中，一切物體都可以輻射紅外線，因此利用探測儀測量目標本身與背景間的紅外線差可以得到不同的熱紅外線形成的紅外圖像。Dual-LuciferaseassayLuciferase報告基因系統(tǒng)是以熒光素(luciferin)為底物來檢測螢火蟲熒光素酶(fireflyluciferase)活性的一種報告系統(tǒng)。熒光素酶可以催化luciferin氧化成oxyluciferin，在luciferin氧化的過程中，會發(fā)出生物熒光(bioluminescence)。然后可以通過熒光測定儀也稱化學發(fā)光儀(luminometer)或液閃測定儀測定luciferin氧化過程中釋放的生物熒光。熒光素和熒光素酶這一生物發(fā)光體系，可以極其靈敏、高效地檢測基因的表達。是檢測轉錄因子與目的基因啟動子區(qū)DNA相互作用的一種檢測方法。轉錄因子是一種具有特殊結構、行使調(diào)控基因表達功能的蛋白質(zhì)分子，也稱為反式作用因子。某些轉錄因子僅與其靶啟動子中的特異序列結合，這些特異性的序列被稱為順式作用元件，轉錄因子的DNA結合域和順式作用元件實現(xiàn)共價結合，從而對基因的表達起抑制或增強的作用。熒光素酶報告基因?qū)嶒灒╨uciferaseassay）是檢測這類轉錄因子和其靶啟動子中的特異順序結合的重要手段。其原理簡述如下：（1）構建一個將靶啟動子的特定片段插入到熒光素酶表達序列前方的報告基因質(zhì)粒，如pGL3-basic等。（2）將要檢測的轉錄因子表達質(zhì)粒與報告基因質(zhì)粒共轉染293細胞或其它相關的細胞系。如果此轉錄因子能夠激活靶啟動子，則熒光素酶基因就會表達，熒光素酶的表達量與轉錄因子的作用強度成正比。（3）加入特定的熒光素酶底物，熒光素酶與底物反應，產(chǎn)生熒光，通過檢測熒光的強度可以測定熒光素酶的活性，從而判斷轉錄因子是否能與此靶啟動子片段有作用。Liveimaging分子成像技術使活體動物體內(nèi)成像成為可能，它的出現(xiàn)，歸功于分子生物學和細胞生物學的發(fā)展、轉基因動物模型的使用、新的成像藥物的運用、高特異性的探針、小動物成像設備的發(fā)展等諸多因素。分子成像技術可用于——研究觀測特異性細胞、基因和分子的表達或互作過程，同時檢測多種分子事件，追蹤靶細胞，藥物和基因治療最優(yōu)化，從分子和細胞水平對藥物療效進行成像，從分子病理水平評估疾病發(fā)展過程，對同一個動物或病人進行時間、環(huán)境、發(fā)展和治療影響跟蹤。成像的優(yōu)點轉基因老鼠分子成像和傳統(tǒng)的體外成像或細胞培養(yǎng)相比有著明顯優(yōu)點。首先，分子成像能夠反映細胞或基因表達的空間和時間分布，從而了解活體動物體內(nèi)的相關生物學過程、特異性基因功能和相互作用。第二，由于可以對同一個研究個體進行長時間反復跟蹤成像，既可以進步數(shù)據(jù)的可比性，避免個體差異對試驗結果的可影響，又不需要殺死模式動物，節(jié)省了大筆科研用度。第三，尤其在藥物開發(fā)方面，分子成像更是具有劃時代的意義。根據(jù)統(tǒng)計結果，由于進進臨床研究的藥物中大部分由于安全題目而終止，導致了在臨床研究中大量的資金浪費，而分子成像技術的問世，為解決這一困難提供了廣闊的空間，將使藥物在臨床前研究中通過利用分子成像的方法，獲得更具體的分子或基因述水平的數(shù)據(jù)，這是用傳統(tǒng)的方法無法了解的領域，所以分子成像將對新藥研究的模式帶來革命性變革。其次，在轉基因動物、動物基因打靶或制藥研究過程中，分子成像能對動物的性狀進行跟蹤檢測，對表型進行直接觀測和（定量）分析。MRIMolecularcloningtechniquesRT-PCR逆轉錄PCR（reversetranscriptionPCR）或者稱反轉錄PCR(reversetranscription-PCR,RT-PCR)，是聚合酶鏈式反應(PCR)的一種廣泛應用的變形。在RT-PCR中，一條RNA鏈被逆轉錄成為互補DNA，再以此為模板通過PCR進行DNA擴增。RT-PCR的指數(shù)擴增是一種很靈敏的技術，可以檢測很低拷貝數(shù)的RNA。RT-PCR廣泛應用于遺傳病的診斷，并且可以用于定量監(jiān)測某種RNA的含量。檢測基因表達的方法，參見NorthernBlot法。RT-PCR的關鍵步驟是在RNA的反轉錄，要求RNA模版為完整的且不含DNA、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)。常用的反轉錄酶有兩種，即鳥類成髓細胞性白細胞病毒（avianmyeloblastosisvirus,AMV）反轉錄酶和莫羅尼鼠類白血病病毒（moloneymurineleukemiavirus,MMLV）反轉錄酶。在完成逆轉錄過程之后,通過PCR進行定量分析的時候，隨著技術的發(fā)展，real-timePCR（實時熒光PCR）或ddPCR（數(shù)字PCR）技術也被用來做定量分析，它們比普通PCR進行定量分析時靈敏度更高，定量更精確。Real-timePCRReal-TimePCR技術，又稱實時定量熒光PCR，是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號累積實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行總量分析或通過Ct值對模板進行相對定量。定量PCR已經(jīng)從基于凝膠的低通量分析發(fā)展到高通量的熒光分析技術，即實時定量PCR。實時熒光定量PCR技術于1996年由美國AppliedBiosystems公司推出，由于該技術不僅實現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR相比，它具有特異性更強、有效解決PCR污染問題、自動化程度高等特點。實時定量PCR(real-timequantitativePCR)是指在PCR指數(shù)擴增期間通過連續(xù)監(jiān)測熒光信號強弱的變化來即時測定特異性產(chǎn)物的量，并據(jù)此推斷目的基因的初始量，不需要取出PCR產(chǎn)物進行分離。實時定量PCR作為一個極有效的實驗方法，已被廣泛地應用于分子生物學研究的各個領域。適用性和特點：1、具有高適應性和可靠性，實驗結果穩(wěn)定重復性好，特異性更高。2、適用于擴增序列專一的體系的檢測。3、樣品中靶基因含量過低的定量PCR檢測。4、靶基因的特異序列較短，無論怎樣優(yōu)化引物設計條件都不能解決。5、存在與靶基因同源的序列，在PCR中容易出現(xiàn)非特異性擴增，對特異性要求較高的定量。6、廣泛用于人類傳染病的診斷和病原定量,在動物病原體基因的檢測,畜禽產(chǎn)品的檢驗檢疫,生物制品的鑒定。MutagenesisPCRProkaryoticexpressionsystem原核表達系統(tǒng)：在各種表達系統(tǒng)中，最早被采用進行研究的是原核表達系統(tǒng)，這也是目前掌握最為成熟的表達系統(tǒng)。該項技術的主要方法是將已克隆入目的基因DNA片段的載體(一般為質(zhì)粒)轉化細菌(通常選用的是大腸桿菌)，通過IPTG誘導并最終純化獲得所需的目的蛋白。其優(yōu)點在于能夠在較短時間內(nèi)獲得基因表達產(chǎn)物，而且所需的成本相對比較低廉。但與此同時原核表達系統(tǒng)還存在許多難以克服的缺點：如通常使用的表達系統(tǒng)無法對表達時間及表達水平進行調(diào)控，有些基因的持續(xù)表達可能會對宿主細胞產(chǎn)生毒害作用，過量表達可能導致非生理反應，目的蛋白常以包涵體形式表達，導致產(chǎn)物純化困難；而且原核表達系統(tǒng)翻譯后加工修飾體系不完善，表達產(chǎn)物的生物活性較低。Eucaryoticexpressionsystem真核表達系統(tǒng)：為克服上述不足，許多學者將原核基因調(diào)控系統(tǒng)引入真核基因調(diào)控領域，其優(yōu)點是：根據(jù)原核生物蛋白與靶DNA間作用的高度特異性設計，而靶DNA與真核基因調(diào)控序列基本無同源性，故不存在基因的非特異性激活或抑制；②能誘導基因高效表達，可達105倍，為其他系統(tǒng)所不及；③能嚴格調(diào)控基因表達，即不僅可控制基因表達的“開關”，還可人為地調(diào)控基因表達量。因此，利用真核表達系統(tǒng)來表達目的蛋白越來越受到重視。目前，基因工程研究中常用的真核表達系統(tǒng)有酵母表達系統(tǒng)、昆蟲細胞表達系統(tǒng)和哺乳動物細胞表達系統(tǒng)。genomeorcDNAlibrary基因組文庫（GenomicLibrary）定義：把某種生物基因組的全部遺傳信息通過克隆載體貯存在一個受體菌克隆子群體中，這個群體即為這種生物的基因組文庫。用限制性內(nèi)切酶切割細胞的整個基因組DNA，可以得到大量的基因組DNA片段，然后將這些DNA片段與載體連接，再轉化到細菌中去，讓宿主菌長成克隆。這樣，一個克隆內(nèi)的每個細胞的載體上都包含有特定的基因組DNA片段，整個克隆群體就包含基因組的全部基因片段總和稱為基因組文庫。DNAsequencingDNA測序（DNAsequencing，或譯DNA定序）是指分析特定DNA片段的堿基序列，也就是腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）、胞嘧啶（C）與鳥嘌呤的（G）排列方式。快速的DNA測序方法的出現(xiàn)極大地推動了生物學和醫(yī)學的研究和發(fā)現(xiàn)。在基礎生物學研究中，和在眾多的應用領域，如診斷，生物技術，法醫(yī)生物學，生物系統(tǒng)學中，DNA序列知識已成為不可缺少的知識。具有現(xiàn)代的DNA測序技術的快速測序速度已經(jīng)有助于達到測序完整的DNA序列，或多種類型的基因組測序和生命物種，包括人類基因組和其他許多動物，植物和微生物物種的完整DNA序列。測序目的：確定重組DNA的方向與結構對突變進行定位和鑒定比較研究Nextgenerationsequencing日本大阪大學產(chǎn)業(yè)科學研究所的傳合知二教授和谷口正輝副教授的研究小組利用電測方法，成功識別構成DNA（脫氧核糖核酸）的核酸堿基的一個分子。這一方法與目前的DNA測序檢測原理完全不同，具有超高速、無標記和低成本的優(yōu)點，在量體定制個人醫(yī)療、精確搜查罪犯、超高速檢驗病毒等領域具有極高應用價值。相關論文發(fā)表在《自然納米技術》雜志網(wǎng)絡版上。依據(jù)個人遺傳信息開發(fā)醫(yī)療藥品、根據(jù)精確的DNA檢測迅速抓捕罪犯、超高速高精度檢查流感病毒，這些都要求開發(fā)出快速低成本的DNA測序法。實現(xiàn)下一代DNA測序的基本原理是在納米空洞中配置納米電極，用電測方法測量一個DNA的核酸堿基排列。但是電測識別一個分子的技術開發(fā)極其困難，尚未有驗證該原理的實例。研究小組利用納米加工技術整理電極間距為1納米的電極，這種方法能在納米電極間以0.01納米的精度進行控制。隨后將核酸堿基的一個分子夾在電極之間，通電后經(jīng)過測定發(fā)現(xiàn)有三個核酸堿基分子顯示異常電流值，證明通過電測可識別一個分子單位的核酸堿基分子種類。這種電測方法是下一代DNA測序基本原理在世界上首次驗證成功。研究人員將納米電極放入溶解在水溶液中的構成DNA要素的4個核酸堿基分子，即腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶。在測定電極間的電流時間變化時發(fā)現(xiàn)，除腺嘌呤之外的3個核酸堿基分子各有不同的電流值，根據(jù)電流值的不同，可識別出不同的核酸堿基分子。在兩個核酸堿基分子等量混合時進行測定，可觀測到兩個核酸堿基分子的特征性電流峰值，驗證了可根據(jù)電流值識別相應的核酸堿基分子。GenemanipulationViralvectorsrelatedtechnologyLentivirusAAVphagedisplay病毒載體是一種常見的分子生物學工具，可將遺傳物質(zhì)帶入細胞，原理是利用病毒具有傳送其基因組進入其他細胞，進行感染的分子機制?？砂l(fā)生于完整活體或是細胞培養(yǎng)中?？蓱糜诨A研究、基因療法或疫苗?？晒├玫牟《究煞譃槟孓D錄病毒、慢病毒與腺病毒。Transgenicanimal將外源重組基因轉染并整合到動物受體細胞基因組中，從而形成在體內(nèi)表達外源基因的動物，稱為轉基因動物。轉基因動物表達系統(tǒng)，包括外源基因、表達載體和受體細胞等，基因組的轉移則是細胞核移植和動物克隆技術，人工合成與設計基因、全基因乃至基因組的轉基因技術是合成生物學。遺傳的基本物質(zhì)是DNA，基因則是位于染色體上有遺傳效應的DNA片段，對于儲存在生物全套染色體中的全部遺傳信息，可稱其為基因組。由于不同種類、不同個體的生物基因組成是不同的，因此對動物個體來說，非自身的基因成分屬于外源基因，如果把外源基因整合或?qū)雱游锶旧w基因中，那么這個外源基因就被稱為轉基因(transgene)(即轉移來的基因)，這種動物就是轉基因動物（transgenicanimals）。轉基因動物是指將特定的外源基因?qū)珓游锸芫鸦蚺咛?，使之穩(wěn)定整合于動物的染色體基因組并能遺傳給后代的一類動物。TetON/tetOFFsystemCre/LoxsystemCre-LoxP重組酶系統(tǒng)在新型基因打靶中獲得廣泛應用，是條件性基因打靶、誘導性基因打靶、時空特異性基因打靶策略的技術核心。基于Cre-LoxP的基因打靶要分兩步來進行。首先要在胚胎干細胞的基因組中引入LoxP序列，這一步可以通過打靶載體的設計和對同源重組子的篩選來實現(xiàn)。下一步通過Cre介導的重組來實現(xiàn)靶基因的遺傳修飾或改變。Cre-LoxP系統(tǒng)既可以在細胞水平上用Cre重組酶表達質(zhì)粒轉染中靶細胞，通過識別LoxP位點將抗性標記基因切除，又可以在個體水平上將重組雜合子小鼠與Cre轉基因小鼠雜交，篩選子代小鼠就可得到刪除外源標記基因的條件性敲除小鼠?；蛘邔re基因置于可誘導的啟動子控制下，通過誘導表達Cre重組酶而將LoxP位點之間的基因切除（誘導性基因敲除），實現(xiàn)特定基因在特定時間或者組織中的失活。RNAinterferenceRNA干擾（RNAinterference,RNAi）是指在進化過程中高度保守的、由雙鏈RNA（double-strandedRNA，dsRNA）誘發(fā)的、同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象。基因沉默，主要有轉錄前水平的基因沉默(TGS)和轉錄后水平的基因沉默(PTGS)兩類:TGS是指由于DNA修飾或染色體異染色質(zhì)化等原因使基因不能正常轉錄;PTGS是啟動了細胞質(zhì)內(nèi)靶mRNA序列特異性的降解機制。有時轉基因會同時導致TGS和PTGS。由于使用RNAi技術可以特異性剔除或關閉特定基因的表達，（長度超過三十的dsRNA會引起干擾素毒性）所以該技術已被廣泛用于探索基因功能和傳染性疾病及惡性腫瘤的治療領域。1.高效性2、特異性⒊位置效應⒋競爭效應⒌可傳播性AntisenseRNA反義RNA，根據(jù)反義RNA的作用機制可將其分為3類：Ⅰ類反義RNA直接作用于靶mRNA的SD序列和（或）部分編碼區(qū)，直接抑制翻譯，或與靶mRNA結合形成雙鏈RNA，從而易被RNA酶Ⅲ降解；Ⅱ類反義RNA與mRNA的非編碼區(qū)結合，引起mRNA構象變化，抑制翻譯；Ⅲ類反義RNA則直接抑制靶mRNA的轉錄。反義RNA是指與mRNA互補的RNA分子，也包括與其它RNA互補的RNA分子。由于核糖體不能翻譯雙鏈的RNA，所以反義RNA與mRNA特異性的互補結合,即抑制了該mRNA的翻譯。通過反義RNA控制mRNA的翻譯是原核生物基因表達調(diào)控的一種方式，最早是在E.coli的產(chǎn)腸桿菌素的ColE1質(zhì)粒中發(fā)現(xiàn)的，許多實驗證明在真核生物中也存在反義RNA。近幾年來通過人工合成反義RNA的基因,并將其導入細胞內(nèi)轉錄成反義RNA，即能抑制某特定基因的表達，阻斷該基因的功能，有助于了解該基因?qū)毎L和分化的作用。同時也暗示了該方法對腫瘤實施基因治療的可能性。功能在原核生物中反義RNA具有多種功能，例如調(diào)控質(zhì)粒的復制及其接合轉移，抑制某些轉位因子的轉位，對某些噬菌體溶菌-溶源狀態(tài)的控制等。下文僅舉數(shù)例。Knock-do