代謝控制發(fā)酵

代謝控制發(fā)酵第1頁/共21頁代謝控制發(fā)酵的定義

它是利用遺傳學(xué)或其它生物、物理、化學(xué)方法，人為地在脫氧核糖核酸（DNA）的分子水平上，改變和控制微生物的生長代謝途徑，使有用的代謝產(chǎn)物大量生成、積累的發(fā)酵技術(shù)。最早在氨基酸發(fā)酵中得到成功應(yīng)用。第2頁/共21頁代謝調(diào)節(jié)機(jī)制微生物細(xì)胞的調(diào)節(jié)機(jī)制酶合成的調(diào)控（轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)節(jié)）誘導(dǎo)——促進(jìn)酶的合成阻遏——抑制酶的合成（包括終產(chǎn)物阻遏和分解代謝物阻遏）

第3頁/共21頁代謝調(diào)節(jié)機(jī)制酶活性的調(diào)控一定數(shù)量的酶通過其分子結(jié)構(gòu)的改變來調(diào)節(jié)催化反應(yīng)的速率?？刂茩C(jī)制：終產(chǎn)物抑制或激活；通過輔酶水平的活性調(diào)節(jié)；酶原的活化；潛在酶的活化細(xì)胞膜滲透性的控制根據(jù)酶在代謝調(diào)節(jié)中作用不同分為：調(diào)節(jié)酶（變構(gòu)酶、同功酶、多功能酶）、靜態(tài)酶和潛在酶。第4頁/共21頁代謝控制發(fā)酵的基本思想

切斷支路代謝選育營養(yǎng)缺陷型突變株原菌株由于發(fā)生基因突變，致使合成途徑中某一步驟發(fā)生缺陷，從而喪失了合成某些物質(zhì)的能力，必須在培養(yǎng)中外源補(bǔ)加該營養(yǎng)物質(zhì)才能生長的突變型菌株。最典型例子：高絲氨酸營養(yǎng)缺陷型或蘇氨酸營養(yǎng)缺陷型菌株達(dá)到賴氨酸的積累。第5頁/共21頁代謝控制發(fā)酵的基本思想選育滲漏缺陷突變株遺傳性障礙不完全的缺陷型。（注：這種突變只是其中某一種酶的活性降低，而不是完全喪失。不能合成過量的最終產(chǎn)物，故不會造成反饋抑制而影響中間代謝產(chǎn)物的積累。）第6頁/共21頁代謝控制發(fā)酵的基本思想

解除菌體自身的反饋調(diào)節(jié)選育抗類似物突變株（代謝拮抗物抗性突變株）形成途徑：變構(gòu)酶結(jié)構(gòu)基因突變；調(diào)節(jié)基因突變。酶活性的利用營養(yǎng)缺陷型回復(fù)突變株的應(yīng)用

調(diào)節(jié)酶的失活與否，可能直接表現(xiàn)為某種營養(yǎng)缺陷型?？梢圆捎没貜?fù)突變的方法，從回復(fù)突變株中獲得多途徑中的調(diào)節(jié)酶接觸反饋調(diào)節(jié)的調(diào)節(jié)突變株。第7頁/共21頁代謝控制發(fā)酵的基本思想

增加前體物的合成通過選育某些營養(yǎng)缺陷型或結(jié)構(gòu)類似物抗性突變株以及克隆某些關(guān)鍵酶的方法，增加目的產(chǎn)物的前體合成，有利于目的產(chǎn)物的大量積累。去除終產(chǎn)物特殊調(diào)節(jié)機(jī)制的利用：①多種產(chǎn)物控制機(jī)制的利用②平衡合成的利用③代謝互鎖的利用④優(yōu)先合成的變換。條件突變株的應(yīng)用選育不生成副產(chǎn)物的菌株選育生產(chǎn)代謝拮抗物質(zhì)的菌株

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微生物代謝控制發(fā)酵的措施應(yīng)用營養(yǎng)缺陷型菌株。選育抗反饋調(diào)節(jié)的突變株。

即已解除了反饋調(diào)節(jié)作用的突變株。因?yàn)榉答佉种坪妥瓒?，或兩者引起的自?dòng)調(diào)節(jié)作用已被削弱或解除，所以能合成較多的最終產(chǎn)物。選育細(xì)胞膜通透性突變株：使終產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)不能大量積累而引起反饋調(diào)節(jié)。利用營養(yǎng)缺陷型回復(fù)突變株或條件突變株的方法，解除終產(chǎn)物對關(guān)鍵酶的調(diào)節(jié)。應(yīng)用遺傳工程技術(shù)，創(chuàng)造理想的超微生物（構(gòu)建目的工程菌株）。發(fā)酵的環(huán)境條件的優(yōu)化。第9頁/共21頁發(fā)酵條件控制

當(dāng)菌株選育確定后，環(huán)境條件的合適與否是發(fā)酵成敗的重要因素。環(huán)境條件既影響微生物生長，又影響代謝速度和方向及產(chǎn)物的形成和積累。影響發(fā)酵過程的因素很多，如溫度、pH、通風(fēng)、攪拌、罐壓力、溶氧量等，必須適當(dāng)控制各種條件，掌握發(fā)酵動(dòng)態(tài)，是整個(gè)發(fā)酵過程順利進(jìn)行。例如谷氨酸棒桿菌發(fā)酵，可以通過控制發(fā)酵條件包括O2濃度、NH4濃度、pH、磷酸鹽濃度、生物素濃度等，轉(zhuǎn)換代謝方向，使其不生成Glu，而生成乳酸、a-KGA、琥珀酸、谷酰胺等產(chǎn)物。第10頁/共21頁氨基酸的代謝控制與發(fā)酵（以Lys生產(chǎn)為例）賴氨酸第11頁/共21頁氨基酸的代謝控制與發(fā)酵（以Lys生產(chǎn)為例）切斷或減弱支路代謝切斷支路代謝：選育和應(yīng)用營養(yǎng)缺陷型菌株，切斷丙氨酸、蘇氨酸和蛋氨酸的分支途徑以積累Lys。變換優(yōu)先合成：滲漏缺陷型的選育（高絲氨酸滲漏突變株）降低HD酶（高絲氨酸脫氫酶）活性：增強(qiáng)代謝流從優(yōu)先合成Met和Thr轉(zhuǎn)向合成Lys，Met和Thr

、Thr合成減少，解除了Thr+Lys的協(xié)同反饋抑制。第12頁/共21頁氨基酸的代謝控制與發(fā)酵（以Lys生產(chǎn)為例）解除反饋抑制選育抗結(jié)構(gòu)類似物突變株解除AK酶的反饋調(diào)節(jié)通過誘變，使編碼AK酶（天冬氨酸激酶）的結(jié)構(gòu)基因發(fā)生突變，使AK酶對Lys及結(jié)構(gòu)類似物不敏感，即使蘇氨酸過量，該激酶也不與Lys或類似物結(jié)合。解除PS酶的代謝調(diào)節(jié)解除代謝互鎖：賴氨酸與亮氨酸的生物合成之間存在代謝互鎖，應(yīng)考慮選育亮氨酸缺陷型，抗亮氨酸結(jié)構(gòu)類似物突變株。第13頁/共21頁氨基酸的代謝控制與發(fā)酵（以Lys生產(chǎn)為例）去除終產(chǎn)物選育細(xì)胞膜通透性突變株，解除反饋調(diào)節(jié)。選育生物素缺陷型。生物素是脂肪酸合成中CoA的輔酶。選育生物素缺陷型阻斷生物素合成并限制外源供應(yīng)量，導(dǎo)致磷脂含量不足，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)不完整。選育油酸缺陷型。選育甘油缺陷型。選育溫度敏感性突變株。第14頁/共21頁氨基酸的代謝控制與發(fā)酵（以Lys生產(chǎn)為例）增加前體物的合成反饋抑制（調(diào)節(jié)）并不意味著完全阻止合成反應(yīng)，通過受控制反應(yīng)物的第五積累能拮抗性地克服這種抑制，關(guān)鍵酶AK所催化的底物Asp（天門冬氨酸），AK酶的反應(yīng)速度與底物Asp濃度間的關(guān)系呈S型，隨著Asp的增多，AK酶和Asp親和力協(xié)同性地增大。根據(jù)變構(gòu)酶S型動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，應(yīng)設(shè)法增加前體物質(zhì)Asp的濃度，以抵消變構(gòu)抑制劑的影響。可以選育丙氨酸缺陷型，抗Asp結(jié)構(gòu)類似物的突變株。第15頁/共21頁氨基酸的代謝控制與發(fā)酵（以Lys生產(chǎn)為例）選育溫度敏感突變株其突變位置發(fā)生在亮氨酸合成酶系，高絲氨酸脫氫酶或丙酮酸-L-氨基酸轉(zhuǎn)氨酶編碼的基因中，均有利于積累Lys缺陷型。第16頁/共21頁氨基酸的代謝控制與發(fā)酵（以Lys生產(chǎn)為例）利用細(xì)胞工程和基因工程技術(shù)構(gòu)建賴氨酸工程菌株細(xì)胞融合選育高產(chǎn)Lys菌株操作步驟如下：第17頁/共21頁0.3μg/mLPenicilian（31℃，90分鐘）Centrifugation收集菌體，高滲洗滌后，懸浮于高滲溶液中300μg/mLLysozyme（31.5℃靜止21h）ProtoplantA等量混合離心33%PEG6000+0.1MCaCl2處理，36℃，15min進(jìn)行融合，融合反應(yīng)液離心后，收集融合原生質(zhì)體懸浮于pH10.5高滲溶液中移植到（涂布）選擇固體瓊脂培養(yǎng)基上的高滲軟瓊脂層中31.5℃，培養(yǎng)14天記Fusant融合子產(chǎn)酸和遺傳標(biāo)穩(wěn)定性測定液體搖瓶10-15次AJ11794（生長快，耗糖速率高3倍，發(fā)酵時(shí)間縮短1/3，L-Lys產(chǎn)量維持不變）Glu產(chǎn)生菌

AJ11638DECr（德夸香素）

KMr（酮丙二酸）對數(shù)期細(xì)胞A蛋白胨1%、酵母1%NaCl0.5%、蔗糖0.5%PH7.031.5℃Lys產(chǎn)生菌AJ11082（低葡萄糖消耗速率）AECr、CLLr、MLr、FPs、L-Ala-

對數(shù)期細(xì)胞

BProtoplantB懸浮于高滲溶液（pH10.5,0.1MCaCl2）第18頁/共21頁氨基酸的代謝控制與發(fā)酵（以Lys生產(chǎn)為例）重組DNA技術(shù)選育高產(chǎn)Lys菌株

Renerend將E.coli的Lys生物合成途徑中Asp-β-半醛（ASA）脫氫酶，二氫吡啶2、6二羧酸（DDP或Ps）合成酶，PPP還原酶和二氨基庚二酸（DAP）脫羧酶的基因Asd,dapA,dapB,LysA從染色體上切下，分別連接到拷貝數(shù)