層析技術(shù) 醫(yī)學(xué)生物化學(xué)課件

層析技術(shù)概述層析法又稱色層分析法或色譜法(Chromatography),它是在1903-1906年由俄國植物學(xué)家M.Tswett首先系統(tǒng)提出來的。他將葉綠素的石油歴溶液通過CaCO3,管柱,并繼續(xù)以石油醚淋洗,由于CaCO3,對葉綠素中各種色素的吸附能力不同,色素被逐漸分離,在管柱中出現(xiàn)了不同顏色的譜帶或稱色譜圖(Chromatogram)。當(dāng)時這種方法并沒引起人們的足夠注意,直到1931年將該方法應(yīng)用到分離復(fù)雜的有機混合物,人們才發(fā)現(xiàn)了它的廣泛用途。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展以及生產(chǎn)實踐的需要,層析技術(shù)也得到了迅速的發(fā)展。層析法的最大特點是分離效率高,它能分離各種性質(zhì)極相類似的物質(zhì);而且它既可以用于少量物質(zhì)的分析鑒定,又可用于大量物質(zhì)的分離純化制備。因此,作為一種重要的分析、分離手段與方法,它廣泛地應(yīng)用于科學(xué)研究與工業(yè)生產(chǎn)上?，F(xiàn)在,它在石油、化工、醫(yī)藥衛(wèi)生、生物科學(xué)、環(huán)境科學(xué)、農(nóng)業(yè)科學(xué)等領(lǐng)域都發(fā)揮著十分重要的作用。層析的基本理論層析技術(shù)是利用混合物中各組分的物理化學(xué)性質(zhì)(分子的形狀和大小、分子極性、吸附力、分子親和力、分配系數(shù)等)的不同，使各組分以不同程度分布在固定相和流動相中，當(dāng)流動相流過固定相時，各組分以不同的速度移動，而達(dá)到分離的技術(shù)。層析技術(shù)操作簡便，樣品可多可少，既可用于實驗室的研究工作，又可用于工業(yè)生產(chǎn)，還可與其他分析儀器配合，組成各種自動分析儀器。一、層析的基本概念1.固定相固定相是層析的一個基質(zhì)。它可以是固體物質(zhì)(如吸附劑、凝膠、離子交換劑等),也可以是液體物質(zhì)(如固定在硅膠或纖維素上的溶液),這些基質(zhì)能與待分離的化合物進(jìn)行可逆的吸附、溶解、交換等作用。固定相對層析的效果起著關(guān)鍵的作用。2.流動相在層析過程中,推動固定相上待分離的物質(zhì)朝著一個方向移動的液體、氣體或超臨界體等,都稱為流動相。柱層析中一般稱為洗脫劑,薄層層析時稱為展層劑。它也是層析分離中的重要影響因素之3.分配系數(shù)及遷移率(或比移值)分配系數(shù)是指在一定的條件下,某種組分在固定相和流動相中含量(濃度)的比值,常用K來表示。分配系數(shù)是層析中分離純化物質(zhì)的主要依據(jù)。層析根據(jù)不同的標(biāo)準(zhǔn)可以分為多種類型:1.根據(jù)固定相基質(zhì)的形式分類根據(jù)固定相基質(zhì)的形式分類,層析可以分為紙層析、薄層層析和柱層析。(1)紙層析(paperchromatography)是指以濾紙作為基質(zhì)的層析。以濾紙作為液體的載體,點樣后,用流動相展開,以達(dá)到組分分離目的。(2)薄層層析(thinlayerchromatography)以一定顆粒度的不溶性物質(zhì),均勻涂鋪在薄板上。點樣后,用流動相展開,使組分達(dá)到分離的目的。(3)柱層析(columnchromatography)是指將固定相裝柱后,用洗脫液洗脫使樣品沿一個方向移動,以達(dá)到分離目的。紙層析和薄層層析主要適用于小分子物質(zhì)的快速檢測分析和少量分離制備,通常為次性使用,而柱層析是常用的層析形式,適用于樣品分析、分離。生物化學(xué)中常用的凝膠層析、離子交換層析、親和層析、高效液相色譜等都通常采用柱層析形式。二、層析法的分類2.根據(jù)流動相的形式分類根據(jù)流動相的形式分類,層析可以分為液相層析和氣相層析。氣相層析是指流動相為氣體的層析,而液相層析指流動相為液體的層析。氣相層析測定樣品時需要氣化,大大限制了其在生化領(lǐng)域的應(yīng)用,主要用于氨基酸、脂肪酸等小分子的分析鑒定。而液相層析是生物領(lǐng)域最常用的層析形式,適于生物樣品的分析、分離。二、層析法的分類3.根據(jù)分離的原理不同分類根據(jù)分離的原理不同分類,層析主要可以分為吸附層析、分配層析、凝膠過濾層析、離子交換層析、親和層析等。(1)吸附層析(adsorptionchromatography)是以吸附劑為固定相,根據(jù)待分離物與吸附劑之間吸附力不同而達(dá)到分離目的的一種層析技術(shù)。(2)分配層析(partitionchromatography)是根據(jù)在一個有兩相同時存在的溶劑系統(tǒng)中,不同物質(zhì)的分配系數(shù)不同而達(dá)到分離目的的一種層析技術(shù)。(3)凝膠過濾層析(gelchromatography)是以具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠顆粒作為固定相,根據(jù)物質(zhì)的分子大小不同進(jìn)行分離的一種層析技術(shù)。(4)離子交換層析(ionexchangerchromatography)是以離子交換劑為固定相根據(jù)物質(zhì)的帶電性質(zhì)不同進(jìn)行分離的一種層析技術(shù)(5)親和層析(affinitychromatography)是根據(jù)生物大分子和配體之間的特異性親和力(如酶和抑制劑、抗體和抗原、激素和受體等),將某種配體連接在載體上作為固定相,而對能與配體特異性結(jié)合的生物大分子進(jìn)行分離的一種層析技術(shù)。親和層析是分離生物大分子最為有效的層析技術(shù),具有很高的分辨率。二、層析法的分類吸附層析技術(shù)吸附層析技術(shù)吸附層析是利用吸附劑對不同物質(zhì)的吸附力不同而使混合物中的各組分分離的方法。吸附層析在各種層析技術(shù)中應(yīng)用最早，由于吸附劑來源豐富，價格低廉，易再生，裝置簡單，又具有一定的分辯率等優(yōu)點，故至今仍廣泛使用。例如：純水、醫(yī)藥用水和藥液的制備過程中，經(jīng)常用活性炭填充的吸附柱來吸附水和藥液中的一些雜質(zhì)，尤其是有色物質(zhì)。也可以用于氨基酸、肽、糖類、脂類、苷類等物質(zhì)的分離、鑒定。凡能夠?qū)⑵渌镔|(zhì)聚集到自己表面上的物質(zhì)，都稱為吸附劑。能聚集于吸附劑表面的物質(zhì)稱為被吸附物。在吸附層析中應(yīng)用的吸附劑一般為固體。固體內(nèi)部的分子所受的分子間的作用力是對稱的，而固體表面的分子所受的力是不對稱的。向內(nèi)的一面受內(nèi)部分子的作用力較大，而表面向外的一面所受的作用力較小，因而當(dāng)氣體分子或溶液中溶質(zhì)分子在運動過程中碰到固體表面時就會被吸引而停留在固體表面上。吸附劑與被吸附物分子之間的相互作用是由可逆的范德華力所引起的，故在一定的條件下，被吸附物可以離開吸附劑表面，這稱為解吸作用。吸附層析就是通過連續(xù)的吸附和解吸附完成的。本節(jié)主要介紹吸附柱層析。一、吸附柱層析將吸附劑填裝在玻璃或不銹鋼管中，構(gòu)成層析柱，層析時欲分離的樣品自柱頂加入，當(dāng)樣品溶液全部流入吸附層析柱后，再加入溶劑沖洗。沖洗的過程稱為洗脫，加入的溶劑稱為洗脫劑?；旌衔镏胁煌奈镔|(zhì)，由于吸附力與解吸附力不同，在柱內(nèi)的移動距離也不同。吸附力弱而解吸附力強的物質(zhì)，在柱內(nèi)移動距離較大，經(jīng)過一定時間后，較早從柱內(nèi)被洗脫下來，從而得到分離。反之，吸附力強而解吸附力弱的物質(zhì)，在柱內(nèi)移動距離小，較慢從柱內(nèi)被洗脫下來。例如有A、B、C三種組分，A組分與吸附劑吸附力最弱，C組分與吸附劑的吸附力最強，若將A、B、C三種組分上柱分離，則A組分最先流出層析柱，C組分最晚流出層析柱，B組分居中，洗脫曲線或?qū)游鰣D譜(

Chromatogram)如圖所示。在洗脫過程中，柱內(nèi)不斷地發(fā)生解吸、吸附，再解吸、再吸附的過程。即被吸附的物質(zhì)被溶劑解吸而隨溶劑向下移動，又遇到新的吸附劑顆粒被再吸附，后面流下的溶劑又再解吸而使其下移動。經(jīng)過一段時間以后，該物質(zhì)會向下移動一定距離。此距離的長短與吸附劑對該物質(zhì)的吸附力以及溶劑對該物質(zhì)的解吸(溶解)能力有關(guān)。不同的物質(zhì)由于吸附力和解吸力不同，移動速度也不同。吸附力弱而解吸力強的物質(zhì)，移動速度就較快。經(jīng)過適當(dāng)?shù)臅r間以后，不同的物質(zhì)各自形成區(qū)帶，如果被分離的是有色物質(zhì)的話，就可以清楚地看到色帶(色層)。如果被吸附的物質(zhì)沒有顏色，可用適當(dāng)?shù)娘@色劑或紫外光觀察定位，也可用溶劑將被吸附物從吸附柱洗脫出來,再用適當(dāng)?shù)娘@色劑或紫外光檢測，以洗脫液體積對被洗脫物質(zhì)濃度作圖，可得到洗脫曲線。吸附柱層析成敗的關(guān)鍵是選擇合適的吸附劑、洗脫劑和操作方式。(一)吸附劑的選擇常用的吸附劑有極性的和非極性的兩種。羥基磷灰石、硅膠、氧化鋁和人造沸石屬前者，活性炭屬后者。在實踐中不論選擇哪種類型的吸附劑，都應(yīng)具備表面積大、顆粒均勻、吸附選擇性好、穩(wěn)定性強和成本低廉等性能。在選擇具體吸附劑時，主要是根據(jù)吸附劑本身和被吸附物質(zhì)的理化性質(zhì)進(jìn)行的。一般來說，極性強的吸附劑易吸附極性強的物質(zhì)，非極性的吸附劑易吸附非極性的物質(zhì)。但是為了便于解吸附，對于極性大的分離物，應(yīng)選擇極性小的吸附劑，反之亦然。理想的吸附劑必需經(jīng)過多次試驗才能獲得。羥基磷灰石羥基磷灰石[Ca5(PO4)3OH2，簡稱HA]的吸附容量高，穩(wěn)定性好(在T＜85℃，pH5.5-10.0均可使用)，因此在制備及純化蛋白質(zhì)、酶、核酸、病毒和其它生命物質(zhì)方面得到了廣泛的應(yīng)用。有時有些樣品如RNA、雙鏈DNA、單鏈DNA和雜合型雙鏈DNA-RNA等，經(jīng)過一次HA柱層析，就能達(dá)到有效的分離。HA的Ca2+基團(tuán)和生物分子表面的負(fù)電荷基團(tuán)的相互反應(yīng)，在用HA分離生物分子過程中起著重要作用。而HA的PO43-基團(tuán)與生物分子表面的正電荷基團(tuán)的相互反應(yīng)，則僅起著次要的作用。使用HA作為固定相基質(zhì)的注意事項：(1)HA系干粉時，要先在蒸餾水中浸泡，使其膨脹度(水化后所占有的體積)達(dá)到2-3mL/克后，再按1∶6體積加入緩沖液懸浮，以除去細(xì)小顆粒；(2)HA懸浮液須用旋渦振蕩器混合，若用磁棒或玻棒攪拌時，HA的晶體結(jié)構(gòu)會被破壞；(3)忌用檸檬酸緩沖液和pH＜5.5的緩沖液。當(dāng)用過的HA層析柱再生時，要先挖去頂部的一層HA，然后用一倍床體積的1mol/LNaCl溶液洗滌，接著用4倍床體積的平衡液洗滌平衡，如此處理后即可使用；(4)就操作容量來說，一般細(xì)顆粒HA比粗的大。而從分辨率比較，粗顆粒HA也沒有細(xì)的好。用細(xì)顆粒HA層析時，柱子直徑應(yīng)大些才能達(dá)到滿意的流速。2.硅膠是最常用的吸附劑，通常用SiO2.xH2O表示，是具有硅氧交聯(lián)結(jié)構(gòu)，表面有許多硅醇基的多孔性微粒。硅醇基可與極性化合物或不飽和化合物形成氫鍵而使硅膠具較強的吸附力。水能與硅膠表面羥基結(jié)合而使其失去活性，經(jīng)加熱可被除去的水稱自由水，若自由水含量達(dá)17%以上，則吸附力極低，此時，硅膠只能用于分配層析。若將硅膠在105-110℃加熱30min，吸附能力顯著增強，這一過程稱為活化。如果將硅膠加熱到500℃，硅醇基結(jié)構(gòu)會變成硅氧烷結(jié)構(gòu)，吸附能力顯著下降。硅膠具有微酸性，適用于分離酸性和中性物質(zhì)，如有機酸、氨基酸、甾體等。3.氧化鋁分酸性、堿性和中性三種，酸性氧化鋁(pH4-5)適合于分離酸性化合物，堿性氧化鋁(pH9-10)適合于分離堿性化合物，中性氧化鋁(pH7)適合于分生物堿、揮發(fā)油、萜類、甾體及在酸、堿中不穩(wěn)定的甙類、酯類等化合物。氧化鋁用前也需脫水活化，通常于400℃高溫下加熱6h，使氧化鋁的含水量在0%-3%之間，可得到Ⅰ級或Ⅱ級氧化鋁，但溫度過高也會破壞氧化鋁的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。4.大孔吸附樹脂和聚酰胺近年用于中藥活性成分的分離。(二)洗脫滌的選擇洗脫劑指的是溶解被吸附樣品和平衡固定相的溶劑。合適的洗脫劑應(yīng)符合下列條件：①純度較高；②穩(wěn)定性好；③能較完全洗脫所分離的成分；④黏度?。虎菀缀退枰某煞址珠_。洗脫劑可根據(jù)分離物中各成分的極性、溶解度和吸附劑的活性來選擇。一般蛋白質(zhì)或核酸被極性強的羥基磷灰石吸附后，要用含有鹽的緩沖液洗脫。而甾體或色素等化合物被極性較弱的硅膠吸附后，則可用有機溶劑洗脫。所用洗脫劑的濃度大小和極性強弱的選擇，需通過試驗確定。在實踐中，選擇洗脫劑的順序是由極性小到極性大(正向?qū)游?。當(dāng)把極性小的洗脫劑換成極性大的時，宜先將極性大的和極性小的洗脫劑混合使用，濃度則由低到高?？傊x用洗脫劑的原則是能較完全地洗脫所要分離的成分，并力求用量少、洗脫時間短。柱層析的設(shè)備主要有層析柱、部分收集器、磁力攪拌器和恒流泵。有條件時，配置一臺檢測儀和一臺記錄儀就構(gòu)成一個完整的層析系統(tǒng)。1.層析柱層析柱是下端有細(xì)口并帶有篩板的玻管。柱的直徑與長度之比，一般為1∶10-1∶40。采用極細(xì)吸附劑裝柱時，宜用比例大的層析柱。反之，則宜用比例小的層析柱。這樣有利于節(jié)省時間和提高分辨率。層析柱的床體積是由吸附劑的量和膨脹度決定的。(三)吸附層析的操作層析柱的基本裝置2.吸附劑的用量吸附劑的用量是根據(jù)其自身的操作容量和分離物中各成分的性質(zhì)決定的。當(dāng)操作容量高時，吸附劑用量少。一般吸附劑的用量為被分離樣品的30-50倍。若樣品中各成分的性質(zhì)相似難以分開時，則吸附劑用量應(yīng)增大，有時大于樣品的100倍。3.裝柱裝柱前要先將層析柱垂直固定在支架上。裝柱的方法分干裝法和濕裝法兩種。干裝法系直接加吸附劑到柱中，然后倒入溶劑。此法不易將氣泡排盡。而濕裝法系先加適量溶劑到柱內(nèi)，排走其中的空氣，然后把預(yù)先用溶劑浸泡好的吸附劑攪勻，隨即將此懸浮液連續(xù)傾入柱中，待其自然沉降至柱高的1/4-1/3時打開柱下端口，讓溶劑慢慢流出，使柱上端懸浮液徐徐下降至需要的高度。吸附劑表面要平整，應(yīng)使其一直浸沒在溶劑中，嚴(yán)防氣泡產(chǎn)生。這種裝柱法對各種基質(zhì)都適用。裝好的層析柱應(yīng)立即與洗脫劑連接，在一定的操作壓下(貯液器內(nèi)液面與層析柱出口之間的壓力差)，控制其流速，讓2-3倍柱體積的洗脫劑流過固定相，使其達(dá)到平衡，也使固定相高度恒定或離子強度與洗脫劑一致。此時層析柱中基質(zhì)應(yīng)合乎填裝均勻、松緊一致和沒有氣泡的標(biāo)準(zhǔn)。4.上樣和洗脫經(jīng)過平衡的層析柱，當(dāng)平衡液流到與固定相表面一致位置時，用滴管輕輕地把樣品溶液加到固定相表面，要盡量避免沖動基質(zhì)。加入樣品液的體積一般應(yīng)小于床體積的1/2(當(dāng)加入的樣品量相同時，體積越小越有利于提高分辨率)。待樣品液的液面流到固定相表面時，用滴管加入洗脫劑(其體積用液面距固定相表面的高度約5厘米計)，并在柱上端與裝有洗脫劑的貯液瓶連接開始冼脫。同時在柱下端與部分收集器接通，立即進(jìn)行分級收集(按體積或時間分管收集)。隨后將收集的每管溶液進(jìn)行濃度或活性測定。根據(jù)測定結(jié)果，即可繪制出洗脫曲線(以管號或洗脫體積為橫坐標(biāo)，以每管溶液中樣品的濃度或活性為縱坐標(biāo)，有合適的檢測器和記錄儀時，洗脫液流經(jīng)檢測器再收集，用記錄儀可自動繪制洗脫曲線。理想的洗脫曲線如下圖所示。圖中的A峰和B峰均呈對稱形，二者沒有重疊，這表明樣品液中的組分已完全分開。層析峰的面積(FEG)、峰高(BE)和半峰高寬度(HI)等參數(shù)是定性、定量洗脫物的依據(jù)。為了獲得滿意的分離結(jié)果，洗脫液的流速務(wù)必恰當(dāng)控制。如果太快，洗脫物在兩相中的平衡過程不完全；如果太慢，洗脫物會擴散。若峰與峰之間有重疊，宜降低洗脫劑的強度，若峰間距離過大，或某些成分不能洗脫時，宜加大洗脫劑的強度(極性)，成分復(fù)雜時，可采用洗脫劑由弱到強的梯度洗脫(方法見離子交換層析)。由層析柱分離出的樣品經(jīng)濃縮或凍干處理后，可進(jìn)行純度測定。如雜質(zhì)含量仍大時，應(yīng)該用其它方法繼續(xù)純化。分配層析技術(shù)分配層析分配層析是利用各組分的分配系數(shù)不同而予以分離的方法。分配系數(shù)(K)是指一種溶質(zhì)在兩種互不相溶的溶劑中溶解達(dá)到平衡時，該溶質(zhì)在兩相溶劑中的濃度比值：K=固定相中溶質(zhì)的濃度/流動相中溶質(zhì)的濃度分配系數(shù)與溶劑和溶質(zhì)的性質(zhì)有關(guān)，同時受溫度、壓力的影響。所以不同物質(zhì)的分配系數(shù)不同。而在恒溫恒壓條件下，某物質(zhì)在確定的層析系統(tǒng)中的分配系數(shù)為一常數(shù)。在分配層析中，通常用多孔性固體支持物如濾紙、硅膠等吸著一種溶劑作為固定相，另一種與固定相溶劑互不相溶的溶劑沿固定相流動構(gòu)成流動相，某溶質(zhì)在流動相的帶動下流經(jīng)固定相時，會在兩相間進(jìn)行連續(xù)的動態(tài)分配。當(dāng)樣品中含有多種分配系數(shù)各不相同的組分時，分配系數(shù)越小的組分，隨流動相遷移的越快。兩個組分的分配系數(shù)差別越大，在兩相中分配的次數(shù)越多，越容易被徹底分離。紙層析屬于典型的分配層析，且系統(tǒng)簡單，使用方便，在生物化學(xué)的發(fā)展中發(fā)揮過極其重要的作用。本節(jié)主要通過紙層析介紹分配層析的基本知識。此外，將硅膠、硅藻土等鋪在玻璃或金屬板上進(jìn)行層析可構(gòu)成薄層層析系統(tǒng)，由于薄層層析還可做吸附、離子交換等層析，將在本章第六節(jié)專門敘述，在硅藻土上吸附或化學(xué)鍵合一定的溶劑，裝到層析柱上，以氣體為流動相可構(gòu)成氣液分配層析，即氣相色譜系統(tǒng)，在硅膠等固體材料上吸附或化學(xué)鍵合一定的溶劑，裝到層析柱中，用一定的洗脫劑洗脫，可構(gòu)成液液分配層析，這種系統(tǒng)在高效液相色譜中應(yīng)用普遍。

紙層析(一)原理濾紙一般能吸收22%-25%的水，其中6%-7%的水是以氫鍵與濾紙纖維上的羥基結(jié)合，一般情況下較難脫去。紙上層析實際上是以濾紙纖維的結(jié)合水為固定相，而以有機溶劑(與水不相混溶或部分混溶)作為流動相。展開時，有機溶劑在濾紙上流動，樣品中各物質(zhì)在兩相之間不斷地進(jìn)行分配。由于各物質(zhì)有不同的分配系數(shù)，移動速度因此不同，從而達(dá)到分離的目的。溶質(zhì)在濾紙上移動的速率可用Rf值表示：Rf=a/b式中a：溶質(zhì)斑點中心的移動距離b：溶劑前沿移動的距離Rf值決定于被分離物質(zhì)在兩相間的分配系數(shù)以及兩相間的體積比。由于在同一實驗條件下，兩相體積比是一常數(shù)，所以Rf值決定于分配系數(shù)。不同物質(zhì)的分配系數(shù)不同，Rf值也不相同，由此可以根據(jù)Rf值的大小對物質(zhì)進(jìn)行定性分析。(二)影響Rf值的主要因素1.物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和極性物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和分子極性是影響Rf值的主要因素。極性較大的物質(zhì)，在水中的溶解度較大，其Rf值就較小，反之亦然。2.濾紙不同濾紙的厚薄程度和纖維松緊度各不相同，因此結(jié)合的水量不一樣，兩相的體積比也就不同。所以同一種物質(zhì)在不同型號的濾紙上進(jìn)行層析時，所得到的Rf值也不相同。此外，濾紙上所含的雜質(zhì)也會影響Rf值，必要時要進(jìn)行預(yù)處理，以去除雜質(zhì)的影響。例如：可用0.01-0.4mol/L的HCl處理濾紙，以除去濾紙上的金屬離子，然后再用水洗至中性。層析濾紙由高純度的棉花制成。要求質(zhì)地均一，厚薄一致，纖維松緊度適中，具有一定的機械強度，并具有一定的純度。國產(chǎn)新華濾紙、日本東洋濾紙等均經(jīng)常被采用。3.層析所用的溶劑同一物質(zhì)在不同的溶劑系統(tǒng)中進(jìn)行層析時，Rf值不同。所以溶劑的配制和使用必須嚴(yán)格，才能使Rf值的重現(xiàn)性好。在好的溶劑系統(tǒng)中被分離物質(zhì)的Rf值應(yīng)在0.05-0.85之間，樣品中被分離組分的Rf之差最好大于0.05。溶劑系統(tǒng)中的試劑若純度不夠，需經(jīng)過預(yù)處理后才能使用。處理的方法因溶劑的性質(zhì)而異。常用的處理方法有：酸、堿抽提，水洗滌，重蒸餾，脫水干燥等。舉例如下：(1)苯酚：重蒸餾，收集180℃的餾分。(2)乙酸：在冰醋酸中加入1%重鉻酸鉀，蒸餾，收集118℃的餾分。(3)正丁醇：先后用2.5mol/L硫酸溶液和5mol/L氫氧化鈉溶液洗滌，再用無水碳酸鉀脫水，用磨口蒸餾器蒸餾，收集117℃的餾分。4.pH值溶劑和樣品的pH值會影響物質(zhì)的解離，從而影響物質(zhì)的極性和溶解度，使Rf值改變。溶劑的酸堿度增大則流動相的含水量增高，使極性物質(zhì)的Rf值增加；反之則降低。為了避免或減少pH值對Rf值的影響，可將濾紙和溶劑用緩沖溶液處理，使之保持一定的pH值，通過調(diào)節(jié)溶劑或樣品溶液的pH值，使pH值保持恒定。5.溫度溫度能影響物質(zhì)在兩相中的溶解度，即影響分配系數(shù)；也影響濾紙纖維的水合作用，即影響固定相的體積；同時在多元溶劑系統(tǒng)中，溫度顯著地影響溶劑系統(tǒng)的含水量，即影響流動相的組分比例。所以溫度的改變使Rf值變化很大，為此，層析必須在恒溫條件下進(jìn)行。某些對溫度敏感的溶劑系統(tǒng)，最好不要配成飽和溶液。如水飽和的酚溶液，可改成酚∶水＝4∶1或5∶1等。6.展開方式同一物質(zhì)在其他層析條件完全相同的情況下，用不同的展開方式進(jìn)行層析時，所得到的Rf值不相同。用下行法展開時，Rf值較大；用上行法展開時，Rf值較??；用圓形濾紙層析時，由于內(nèi)圈較外圈小，限制了溶劑的流動，Rf值也較小。7.樣品溶液中雜質(zhì)樣品溶液中存在雜質(zhì)時，有時對Rf值有所影響。例如：氯化鈉的存在會影響氨基酸的Rf值。(三)操作方法1.樣品處理用作紙層析的樣品，應(yīng)盡可能除雜純化。調(diào)節(jié)到一定的pH值，濃度太低的可用真空濃縮提高濃度，濃度太高則需稀釋。2.點樣將濾紙裁成適當(dāng)大小，用鉛筆在距邊線2cm左右劃一直線(稱為原線)，線上每隔2-3cm劃一圓點(稱為原點)。然后用點樣器(定性分析可用普通毛細(xì)管，定量分析需用血球計數(shù)管或微量注射器)輕輕點在原點上。樣品點的直徑約0.3-0.5cm。點樣的量應(yīng)根據(jù)紙的長短以及樣品的性質(zhì)來決定，一般每一樣品的量為5-30μg。點樣一般采用少量多次，每點一次必須用冷風(fēng)吹干，然后再點第二次。每次點樣的位置應(yīng)完全重合，否則會出現(xiàn)斑點畸形現(xiàn)象。3.平衡點樣以后展開以前先將濾紙與層析缸用配好的溶液系統(tǒng)的蒸汽來飽和，這個過程稱之為“平衡”。若不經(jīng)平衡，濾紙和層析缸未被溶劑蒸汽飽和，在層析過程中，濾紙會從溶劑中吸收水分，溶劑也會從濾紙表面揮發(fā)，從而改變?nèi)軇┫到y(tǒng)的組成，嚴(yán)重時紙上會出現(xiàn)不同水平的溶劑前沿，嚴(yán)重影響層析效果。平衡一般在密閉的層析缸內(nèi)進(jìn)行。4.展開平衡結(jié)束后，將濾紙靠樣品點的一端浸入溶劑中，溶劑液面距原線距離約1cm，此時即開始展開。當(dāng)溶劑前沿到達(dá)濾紙另一端0.5-1cm處時，展開結(jié)束，取出濾紙，在溶劑前沿處做一標(biāo)記，晾干或用冷風(fēng)吹干。按溶劑在濾紙上流動的方向不同，展開有上行、下行和環(huán)行三種方式。(1)上行法：將濾紙點樣的一端向下浸入溶劑中，溶劑因毛細(xì)管引力的作用從下向上流動。上行法操作簡單，重現(xiàn)性好，是最常用的展開方法，但展開時間較長。(2)下行法：在層析缸上部有一盛展開劑的液槽，將濾紙點樣的一端朝上浸入槽中，溶劑主要靠重力作用自上而下流動。下行法展開速度快，但Rf值的重現(xiàn)性較差，斑點易擴散。(3)環(huán)行法：又稱水平法，樣品點于圓形濾紙距圓心1cm左右的環(huán)形線(原線)上。濾紙水平放置，溶劑由濾紙條引向圓心，然后不斷向四周水平方向流動。由于溶劑向圓周方向擴散，所以展開的圖譜呈弧形。用環(huán)行法展開時，最好使用無方向性的特制濾紙。如東洋51UH濾紙等。（4）雙向展開法：如果樣品組分較多，用一種溶劑系統(tǒng)（常為酸性）不能將各組分全部分開時，可將樣品點在方形濾紙的一角，用一種溶劑系統(tǒng)展開后吹干溶劑，將濾紙轉(zhuǎn)動90o后再用另一種溶劑系統(tǒng)（常為堿性）展開，這稱為“雙向展開法”。5.顯色為了顯示層析斑點位置，可根據(jù)物質(zhì)的性質(zhì)不同，采用顯色劑顯示或紫外光顯示。(1)顯色劑顯示：被分離物質(zhì)與顯色劑生成有顏色的化合物，顯示斑點位置。常用噴霧法、浸漬法或涂刷法。(2)紫外光顯示：有些物質(zhì)有紫外光吸收性質(zhì)，如核苷酸類物質(zhì)。有些物質(zhì)受紫外光照射會發(fā)出熒光，如維生素B1、B2等，所以可在紫外光照射下觀察到被分離物質(zhì)的斑點。6.定性分析層析后的斑點顯示出來后，計算出各斑點的Rf值，就可以對物質(zhì)進(jìn)行定性。7.定量分析對被分離的物質(zhì)進(jìn)行定量的方法很多，常用的有：(1)剪洗比色法：將斑點剪下，用適當(dāng)?shù)娜軇┫疵摵?，通過分光光度計進(jìn)行比色定量。(2)直接比色法：用特制的分光光度計直接測量濾紙上斑點顏色的濃度，畫出曲線，由曲線所包含的面積可求出待測物的含量。(3)面積測量法：實驗證明，圓形或橢圓形斑點的面積與物質(zhì)含量的對數(shù)成正比。所以，可用測量斑點面積的方法求得物質(zhì)的含量。凝膠層析法

凝膠層析（gelchromatography）常出現(xiàn)多種名稱：如凝膠過濾、分子篩層析、排阻層析、凝膠滲透層析等。凝膠層析的定義：凝膠是一種具有多孔、網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的分子篩。利用這種凝膠分子篩對大小、形狀不同的分子進(jìn)行層析分離，稱凝膠層析。凝膠層析的應(yīng)用范圍：凝膠層析法適用于分離和提純蛋白質(zhì)、酶、多肽、激素、多糖、核酸類等物質(zhì)。分子大小彼此相差25%的樣品，只要通過單一凝膠床就可以完全將它們分開。利用凝膠的分子篩特性，可對這些物質(zhì)的溶液進(jìn)行脫鹽、濃縮、去熱源和脫色。凝膠層析的優(yōu)點凝膠層析具有設(shè)備簡單、操作方便、分離迅速及不影響分子生物學(xué)活性等優(yōu)點。目前已被廣泛應(yīng)用于各種生化產(chǎn)品的分離和純化。－、凝膠層析的基本原理凝膠層析的原理l分子大小不同混合物上柱；2洗脫開始，小分子擴散進(jìn)人凝膠顆粒內(nèi)，大分子被排阻于顆粒之外；3大小分子分開：4大分子行程較短，已洗脫出層析柱，小分子尚在進(jìn)行中凝膠是一類多孔性高分子聚合物，每個顆粒猶如一個篩子。當(dāng)樣品溶液通過凝膠柱時，相對分子質(zhì)量較大的物質(zhì)由于直徑大于凝膠網(wǎng)孔而只能沿著凝膠顆粒間的孔隙，隨著溶劑流動，因此流程較短，向前移動速度快而首先流出層析柱；反之，相對分子質(zhì)量較小的物質(zhì)由于直徑小于凝膠網(wǎng)孔，可自由地進(jìn)出凝膠顆粒的網(wǎng)孔，在向下移動過程中，它們從凝膠內(nèi)擴散到膠?？紫逗笤龠M(jìn)入另

一凝膠顆粒，如此不斷地進(jìn)入與逸出，使流量增長，移動速率慢而最后流出層析柱。而中等大小的分子，它們也能在凝膠顆粒內(nèi)外分布，部分進(jìn)入顆粒，從而在大分子物質(zhì)與小分子物質(zhì)之間被洗脫。這樣，經(jīng)過層析柱，使混合物中的各物質(zhì)按其分子大小不同而被分離。Vt=Vo+Vi+VgVt=πR2h

V。簡稱為外水體積，Vo等于被完全排阻的大分子的洗脫體積?？梢杂靡粋€已知相對分子質(zhì)量遠(yuǎn)超過凝膠排阻極限的有色分子，如常用的藍(lán)色葡聚糖-2000溶液通過柱床，即可測出柱床的外水體積Vo。Vi簡稱內(nèi)水體積，可由g·Wr求得（g為干凝膠質(zhì)量，單位為g，Wr為凝膠吸水量，以mL／g表示）。Vi也可以從洗脫一種完全不受凝膠微孔排阻的小分子溶質(zhì)（如重鉻酸鉀）的洗脫體積Ve計算，即Ve＝Vo＋Vi對某物質(zhì)在凝膠柱內(nèi)洗脫體積Ve、Vo和Vi之間的關(guān)系可用下式表示：Ve＝Vo＋Kd.Vi式中Ve為脫體積，它包括自加入樣品時算起，到組分最大濃度出現(xiàn)時所流出的體積。Kd為每個溶質(zhì)分子在流動相和固定相之間的一個特定的分配系數(shù)，它只與被分離物質(zhì)分子大小和凝膠顆粒內(nèi)孔隙大小分布有關(guān)。Kd可通過實驗由Ve、Vo和Vi求得。

Ve＝Vo＋Kd.Vi可改寫為：（Ve-Vo）Kd=－－－－Vi當(dāng)Kd＝0時，Ve=Vo，說明這種溶質(zhì)相對分子質(zhì)量大，完全不能進(jìn)入凝膠顆粒微孔內(nèi)，被排阻于凝膠顆粒之外而最先洗脫下來；但實際上，約有1/5的內(nèi)水因溶劑化作用而呈水合狀態(tài)，妨礙小分子的自由擴散。故實際上Ve小分子＝Vo＋0.8Vi；當(dāng)0＜Kd＜l時，意味著溶質(zhì)分子只有部分向凝膠顆粒內(nèi)擴散，Kd愈大，進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)的程度愈大；Kd＝0.5時，其洗脫體積Ve＝Vo十0.5Vi。當(dāng)Kd＝1時，即Ve小分子＝Vo＋KdVi，說明這種溶質(zhì)的相對分子質(zhì)量小，完全向凝膠顆粒內(nèi)擴散，在洗脫過程中將最后流出柱外。不同型號葡聚糖凝膠柱床參數(shù)型號VtV0ViG-1020.81G-1531.11.5G-25522.5G-501045G-751357G-10017610G-20030920二、凝膠層析的特點1．凝膠層析操作簡便，所需設(shè)備簡單。有時只要有一根層析柱便可進(jìn)行工作。分離介質(zhì)—凝膠完全不需要像離子交換劑那樣復(fù)雜的再生過程便可重復(fù)使用。2．分離效果較好，重復(fù)性高。最突出的是樣品回收率高，接近100％。

4．應(yīng)用廣泛。適用于各種生化物質(zhì)，如肽類、激素、蛋白質(zhì)、多糖、核酸的分離純化、脫鹽、濃縮以及分析測定等。分離的分子量范圍也很寬，如SephadexG類為102～105d；Sepharose類為105～108d。3．分離條件緩和。凝膠骨架親水，分離過程又不涉及化學(xué)鍵的變化，所以對分離物的活性沒有不良影響。5．分辨率不高，分離操作較慢。由于凝膠層析是以物質(zhì)分子量的不同作為分離依據(jù)的，分子量的差異僅表現(xiàn)在流速的差異上，所以分離時流速必須嚴(yán)格把握。因而分離操作一般較慢。而且對于分子量相差不多的物質(zhì)難以達(dá)到很好的分離。此外，凝膠層析要求樣品粘度不宜太高。凝膠顆粒有時還有非特異吸附現(xiàn)象。三、常用凝膠的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)凝膠層析法常用的凝膠有天然凝膠（如瓊脂粉凝膠）和人工合成凝膠（如葡聚糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠）。1．葡聚糖凝膠葡聚糖凝膠（Sephadex）具有良好的化學(xué)穩(wěn)定性，是目前生化產(chǎn)品制備中最常用的凝膠。G類葡聚糖凝膠（Sephadex-G）的最基本骨架是葡聚糖，它是一種以右旋葡萄糖為殘基的多糖，分子間主要是α-1,6-糖苷鍵（約占95%），分枝為l，3-糖苷鍵（約占5%），以1-氯-2，3-環(huán)氧丙烷（見右式）Cl－CH2－CH－CH2為交聯(lián)劑將O鏈壯結(jié)構(gòu)連接為三維空間的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的高分子化合物（下圖）交聯(lián)葡聚糖凝膠的化學(xué)結(jié)構(gòu)葡聚糖凝膠網(wǎng)孔大小可通過調(diào)節(jié)交聯(lián)劑和葡聚糖的配比及反應(yīng)條件來控制。交聯(lián)度越大，網(wǎng)孔越小，吸水膨脹就越小。交聯(lián)度越小，網(wǎng)孔越大，吸水膨脹就越大。G類葡聚糖凝膠常用G-X代表，X數(shù)字既代表交聯(lián)度，也代表特水量。X數(shù)字越小，交聯(lián)度越大，網(wǎng)孔越小，適用于分離低分子質(zhì)量生化產(chǎn)品。X數(shù)字越大，交聯(lián)度越小，網(wǎng)孔越大，適用于分離高分子生化產(chǎn)品。X數(shù)字也代表凝膠的持水量，如G-25表示1g干膠持水2.5mL，G-100表示1g干膠持水10mL，依次類推。2．親脂性葡聚糖凝膠這種凝膠既親脂又親水，可在多種有機溶劑中膨脹。這種凝膠在pH＞2的不含氧化劑的溶液中穩(wěn)定。用低級醇為溶劑時，對芳香族、雜環(huán)族化合物仍有吸附作用。但用氯仿時則可去除對上述化合物的吸附作用，而對含羥基與羧基的化合物卻有吸附作用。國產(chǎn)SephadexLH－20可用于分子篩層析、吸附層析和分配層析。很適用于脂肪酸、甘油脂、類固醇、維生素、激素類生化產(chǎn)品的分離。洗脫劑可用單一有機溶劑如甲醇、氯仿等，也可用混合溶劑如氯仿與甲醇的混合液。3．葡聚糖凝膠離子交換劑在G類凝膠上引入一些酸性或堿性基團(tuán)后，則制得各種葡聚糖凝膠離子交換劑。如引入磺乙基（SE-Sephadex）、羧甲基（CM-Sephadex）及二乙胺基乙基（DEAE-SephadexA）等。葡聚糖凝膠離子交換劑具有離子交換和分子篩雙重作用。其結(jié)構(gòu)多孔、疏松、非特異性吸附很少，層析時流速易控制，特別適用于蛋白質(zhì)、酶、激素、多核苷酸等的分離純化，以及生化制劑的除熱原。4．聚丙烯酰胺凝膠聚丙烯酰胺凝膠也是一種人工合成凝膠，其商品名為生物凝膠P（Bio-gel-P），和交聯(lián)葡聚糖一樣，為顆粒狀干粉，在溶劑中能自動吸水溶脹成凝膠。其由單體丙烯酰胺和交聯(lián)劑甲叉雙丙烯酰胺通過自由基引發(fā)聚會形成聚丙烯酰胺凝膠。（見下圖）。只要控制單體用量和交聯(lián)劑的比例，就能得到不同型號的凝膠。聚丙烯酰胺凝膠的結(jié)構(gòu)在聚丙烯酰胺凝膠的合成過程中，單體和交聯(lián)劑的配比可以任意改變。以（T）代表100mL凝膠溶液中含有的單體和交聯(lián)劑總克數(shù)，稱為凝膠濃度。而其中交聯(lián)劑占單體和交聯(lián)劑總量的百分比稱為交聯(lián)度，以（C）表示，交聯(lián)度越大，網(wǎng)孔越小，交聯(lián)度越小，則網(wǎng)孔越大。聚丙烯酰胺凝膠全是由碳一碳骨架構(gòu)成，穩(wěn)定性較好，適合于做凝膠層析的載體。只有在極端pH條件下酰胺鍵才被水解為羧基，使凝膠帶有一定的離子交換基團(tuán)，故一般只在pH2～11的范圍內(nèi)使用。像Sephadex一樣，商品聚丙烯酰胺為顆粒狀的干粉，它有十分明顯形成塊狀并粘附在一起的傾向，在溶劑中能自動溶脹成膠。根據(jù)聚丙烯酰胺凝膠的溶脹性質(zhì)和分離范圍的不同，可分成10種類型。各種類型均以英文字母P和阿拉伯?dāng)?shù)字表示，從Bio-GelP-2至Bio-Ge1P-300。P后面的阿拉伯?dāng)?shù)字乘以1000即相當(dāng)于排阻限度（按球蛋白或肽計算）。目前，美國Bio-RadLaboratories生產(chǎn)并出售多種規(guī)格的Bio-GelP。5．瓊脂糖凝膠（Sepharose）瓊脂糖凝膠（agarosegel）可以分離葡聚糖凝膠和生物膠所不能分離的大分子，使凝膠層析的分離區(qū)間擴大到大分子和病毒顆粒，其最大范圍可達(dá)相對分子質(zhì)量108，但是由于瓊脂有強烈的吸附作用，給使用造成了困難，后來，從瓊脂中分離出兩個組分，一個組分為帶負(fù)電荷的瓊脂果膠，含有磺酸基和羧基；另一組分叫瓊脂糖，它不含有帶電基團(tuán)，其結(jié)構(gòu)是有β-D-吡喃半乳糖和3，6脫水-L-吡喃半乳糖相結(jié)合的鏈狀多糖。這種瓊脂糖被用來進(jìn)行凝膠層析，它既具有瓊脂凝膠相同的分離區(qū)間，又沒有吸附作用。但其穩(wěn)定性遠(yuǎn)不如葡聚糖凝膠和生物膠P，強酸強堿能引起結(jié)構(gòu)破壞。最好使用條件控制在pH4～9之間，溫度0～40℃，超出此范圍,可能被破壞。瓊脂糖凝膠是由瓊脂中分離出來的天然凝膠。它的商品名因生產(chǎn)廠家不同而異。瑞典的商品名稱為Sepharose，有3種型號，即Sepharose2B，4B和6B（同中國相同）。阿拉伯?dāng)?shù)字表示凝膠中干膠的百分含量。美國的為Bio－GA，有6個型號，即Bio-G0.5M，1.5M，5M，15M，50M和150M。阿拉伯?dāng)?shù)字乘以106表示排阻限度。。英國的稱為Sagavac，又分為Sagavac2F，4F，6F，8F，10F和2C，4C，6C，8C，10C。前面的阿拉伯?dāng)?shù)字表示凝膠中干膠的百分?jǐn)?shù)，F(xiàn)代表粉末狀，C代表顆粒狀。丹麥的稱為Gelarose，有5種類型，即2％，4％，6%，8％和10％。

瓊脂糖凝膠做成珠狀后不再脫水干燥，否則不能再溶脹恢復(fù)原有形狀，因此商品大都以含水狀態(tài)供應(yīng)，并應(yīng)在濕態(tài)保存。一般懸浮在l0-3mo1/LEDTA和0.02%疊氮化鈉溶液中。百分?jǐn)?shù)表示干膠量。四、凝膠層析技術(shù)（一）凝膠的選擇與處理選擇適宜的凝膠是取得良好分離效果的最根本的保證。選取何種凝膠及其型號、粒度，一方面要考慮凝膠的性質(zhì)，包括凝膠的分離范圍（滲入限與排阻限）還有它的理化穩(wěn)定性、強度、非特異吸附性質(zhì)等；另一方面還要注意到分離目的和樣品的性質(zhì)。凝膠粒度的大小對分離效果有直接的影響?！銇碚f，細(xì)粒凝膠柱流速低，但洗脫峰窄，分辨率高，多用于精制分離或分析等。粗粒凝膠柱流速高，但洗脫峰平坦，分辨率低，多用于粗制分離，脫鹽等。下圖表示在同一流速下不同粒度的SephadexG-25柱的洗脫效果。凝膠粒度與洗脫效果的關(guān)系圖對生物樣品來說，經(jīng)常遇到的是兩種分離形式。一種是只將分子量極為懸殊的兩類物質(zhì)分開，如蛋白質(zhì)與鹽類，稱作類分離或組分離。另一類則是要將分子量相差不很大的大分子物質(zhì)加以分離，如分離血清球蛋白與白蛋白，這叫做分級分離。后者對實驗條件和操作要求都比較高。下面以最常用的葡聚糖凝膠類為例，分別加以討論。

1．類分離目的是分開樣品中分子量懸殊的“較大分子組”和“較小分子組”兩類物質(zhì)，并不要求分離分子量相近的組分。選擇凝膠時，應(yīng)使樣品中大分子組的分子量大于其排阻限，而小分子組的分子量小于滲入限。也就是說大分子的分配系數(shù)Kd=0，小分子的Kd＝1。這樣能取得最好的分離效果。例如從蛋白質(zhì)溶液中除去無機鹽。我們知道，蛋白質(zhì)的分子量都大于5000D，而無機鹽的分子量一般在幾十到幾百之間。所以常選用SephadexG-25凝膠作為分離固定相，因為它的分離范圍是1000～5000D。被分離的兩組物質(zhì)的分子量正好落在分離范圍的兩側(cè)。大分子組為全排阻，而小分子組為全滲入，其Kd值的差可達(dá)最大值1。對于分子量小于5000D的肽類進(jìn)行脫鹽操作則常選用SephadexG-15凝膠。2．分級分離目的是分開分子量不很懸殊的大分子物質(zhì)。選擇凝膠型號時必須使各種物質(zhì)的Kd值盡可能相差大一些。為此，首先決不能使它們的分子量都分布在凝膠分離范圍的一側(cè)，也就是Kd不要都接近于0或1，而要使組分的分子量盡可能分布在凝膠分離范圍的兩側(cè)，或接近兩側(cè)的位置。如果樣品中含有3個組分的話，最好一個接近全排阻，另一個接近全滲入，第三個為部分滲入，且分子量大于滲入限的3倍，并小于排阻限的1／3。因為分子量如與滲入限比較靠近，該組分分子在凝膠顆粒中運動所受的約束很小，不易與低分子組分分開。如分子量與排阻限比較靠近則不易與高分子組分分開。如用SephadexG-200分離血清蛋白質(zhì)的效果要比SephadexG-150為好。但也有人選用G-150，那是因為G-200強度太低不便操作的緣故（見下圖）。不同分離范圍的葡聚糖凝膠上，血清蛋白的層析圖凝膠顆粒大小一般分為粗、中、細(xì)和超細(xì)四類。顆粒越細(xì)，分離效果越好，因為它容易達(dá)到平衡，但流速慢。顆粒越粗，流速越快，會使區(qū)帶擴散，使洗脫峰變平變寬。在一般柱層析中，使用干顆粒直徑在70μm左右較合適。對于在水中保存的凝膠如瓊脂粉凝膠顆粒直徑應(yīng)在150μm左右。凝膠顆粒大小要均勻，這樣流速穩(wěn)定，效果較好。

葡聚糖凝膠和生物膠多以干粉形式保存，使用前需用水或洗脫緩沖液充分溶賬。在室溫下讓其充分溶賬脹達(dá)到平衡，通常需要較長時間。較快的做法是將干膠往水里加，邊加邊攪，以防凝膠結(jié)塊，然后放到沸水浴中加熱接近100℃，幾個小時就可以使其溶脹，還可起到除去顆粒內(nèi)部氣泡和殺菌作用。（二）裝柱一般選用細(xì)長的拄作凝膠過濾。進(jìn)行脫鹽時，柱高50cm比較合適；分級分離時，100cm就足夠了。一般是在柱內(nèi)先裝入約1/3高度的水或緩沖液，然后將溶脹好的凝膠在攪拌成稀漿的情況下慢慢倒入柱內(nèi)，使其自然沉降。如此連續(xù)操作，可以得到一個均勻的柱床。柱裝得不好往往造成洗脫區(qū)帶加寬，甚至使一些本來可以分開的區(qū)帶重疊。如裝柱時的操作壓力太大，會使凝膠床壓得太實，從而降低流速。層析柱

（a）自制簡易層祈柱（1．玻璃管；2.橡皮塞；3．尼龍網(wǎng)）；（b）普通商品柱；（c）雙底板層析柱（1.洗脫液進(jìn)出口；2.多孔底板；3．柱床；4．恒溫水進(jìn)口；5．恒溫水出口；6．可調(diào)節(jié)的塞子）層析系統(tǒng)連接示意圖1．密封橡皮塞；2．恒壓管，3，恒壓瓶；4，層析流出液，5．可調(diào)蜾旋夾；6.自動收集器；7.核酸一蛋白質(zhì)檢測儀BS－100自動部分收集器安裝圈1．反全閥；2換管臂；3滴管；4，5換管臂固定螺絲；6.豎桿；7.豎桿囤定螓絲；8報警板；9.試管；10．收集盤；11.時間選揮旋鈕；12.時間選擇固定螺釘；13．自動開關(guān)；14、指示燈；15.電源開關(guān)；16．換向開關(guān)（逆、順）；17．手動開關(guān)新柱裝好后，要用洗脫緩沖液平衡，一般用3～5倍體積的緩沖液在恒壓下流過柱床。新裝好的柱要檢驗其均勻性－可用帶色的高分子物質(zhì)如藍(lán)色葡聚糖-2000配成2mg/mL的溶液過柱，觀察色帶是否均勻下降。也可以對光檢查，看其是否均勻或有無氣泡存在。（三）加樣由于凝膠層析的稀釋作用，似乎樣品濃度應(yīng)盡可能大才好，但樣品濃度過大往往導(dǎo)致粘度增大，而使層析分辨率下降（下圖）。一般要求樣品粘度小于0.01Pa·s（帕斯卡秒），這樣才不致于對分離造成明顯影響。對蛋白質(zhì)類樣品濃度以不大于4％為宜。如果樣品渾濁，應(yīng)先過濾或離心除去顆粒后上柱。分析用量一般為每100mL床體積加樣品1～2mL，制備用量一般為每100mL床體積加樣品20～30mL，這樣可使樣品的洗脫體積小于樣品各組分之間的分離體積，獲得較滿意的分離效果。樣品黏度對洗脫曲線的影響（1）加葡萄糖2000，使終濃度為5%，相對粘度11.8;（2）加葡萄糖2000，使終濃度為2.5%，相對粘度4.2;（3）加葡萄糖2000，使終濃度為1%.樣品與柱床體積比例懸殊時分離效果好，但過少的樣品量不但會造成設(shè)備和器材的浪費，降低工作效率，還會造成樣品稀釋。樣品上柱是凝膠層析中最關(guān)鍵的一步。理想的樣品色帶應(yīng)是狹窄且平直的巨型色譜帶。為了做到這一點，應(yīng)盡量減少加樣時樣品的稀釋以及樣品的非平流流經(jīng)凝膠層析床體。反之將造成色譜帶擴散、紊亂，嚴(yán)重影響分離效果。

加樣時應(yīng)盡量減少樣品的稀釋，及凝膠床面的攪動。這一點在分級分離時尤為重要，應(yīng)嚴(yán)格按一定的操作程序進(jìn)行，通常有下列三種方法：1．直接將樣品加到層析床表面2．利用兩種液體比重不同而分層的原理，將高比重樣品加入床表面低比重的洗脫液之中，樣品就慢慢均勻地下沉于床表面，再打開出口，使樣品滲入層析。3.可用微量泵控制（四）洗脫為了防止柱床體積的變化，造成流速降低及重復(fù)性下降。整個洗脫過程中始終保持一定的操作壓，并不超限是很必要的。流速不宜過快且要穩(wěn)定。冼脫液的成分也不應(yīng)改變，以防凝膠顆粒的漲縮引起柱床體積變化或流速改變。在許多情況下可以用水作洗脫劑，但為了防止非特異吸附，避免一些蛋白質(zhì)在純水中難以溶解（析出沉淀），以及蛋白質(zhì)穩(wěn)定性等問題的發(fā)生，常采用緩沖鹽

溶液進(jìn)行洗脫。離子濃度至少0.02mol/L方可獲得較好的結(jié)果，因為凝膠含有少量羧基，會吸附少量陽離子而排斥少量陰離子。洗脫用鹽等介質(zhì)應(yīng)比較容易除去才好，通常，氨水、醋酸、甲酸銨等易發(fā)揮的物質(zhì)用得較多。對一些吸附較強的物質(zhì)也可采用水和有機溶劑（如水-甲醇，水-丙酮等）的混合物進(jìn)行洗脫。洗脫劑的流速對分離效果也有很大影響，下圖顯示了同一凝膠柱在不同流速下的洗脫曲線。可見較快的流速下得到的冼脫峰也寬。流速低洗脫峰窄而高。也就是說，流速較低，分辨率較高，樣品稀釋較輕。流速對洗脫曲線的影響凝膠層析拄洗脫的三部分示意圖洗脫時的流速與操作壓有關(guān)，與凝膠的型號和粒度也有關(guān)，在同樣的操作壓下洗脫時往往編號小的葡聚糖凝膠，以及顆粒粗的凝膠流速大；編號大的，粒度細(xì)的流速慢。對于某種凝膠來說，在一定范圍內(nèi)，操作壓加大，流速加快。對強度較大的凝膠，如SephadexG-10～50，在相當(dāng)大的柱壓范圍內(nèi)流速（Ⅴ）與操作壓（F）成正比，與柱長（L）成反比：Ⅴ=KΔP／L而對于強度差的凝膠，符合以上公式壓力范圍很小。進(jìn)一步加大壓力時，由于凝膠顆粒變形流速反而降低．常見的幾種葡聚糖凝膠柱床承受壓力與洗脫流速的關(guān)系見下圖。幾種葡聚糖凝膠拄床承受壓力圖各種層析柱裝置的操作壓（或靜水壓）（a），（b）操作壓等于柱或貯液器內(nèi)液面和出水接管末端的高度差；（c），（d）壓力的大小是由恒壓瓶內(nèi)空氣入口管的底部至出口接管末端的高度計算。向下（c）或向上（d）移動出水管無關(guān)緊要欲達(dá)到流速恒定的目的，可自制恒壓加液裝置（下圖），更可靠的是使用微量恒流泵。凝膠層析恒壓加液裝置

（五）凝膠的再生和保養(yǎng)在洗脫過程中，所有組分一般都可被洗脫下來，所以裝好柱后，可反復(fù)使用，無需特殊的再生處理。但多次使用后，凝膠顆?？赡苤饾u沉積壓緊，流速變慢。這時只需將凝膠自柱內(nèi)倒出，重新填裝。或使用反沖法，使凝膠松散沖起，然后自然沉降，形成新的柱床，這樣流速會有所改善。葡萄糖凝膠和瓊脂糖凝膠都是碳水化合物，能被微生物（如細(xì)菌和霉菌）分解。聚丙烯酰胺凝膠本身不被微生物作用，但微生物還是能在此凝膠液中和凝膠床上生長，這樣會破壞凝膠的特性，影響分離效果。為防止細(xì)菌生長和發(fā)酵，可用0.02％疊氮化鈉、0.05%三氯叔丁醇（僅在弱酸有效，也適用于其他離子交換劑）或0.002％洗必泰、0.01％醋酸苯汞（在弱堿中有效，也適用于其他陰離子交換劑）以及0.1mol／L氫氧化鈉溶液等作防腐劑。層析前再用水或平衡液將防腐劑洗去。

凝膠用過后，有幾種保存方法：濕態(tài)保存：在水相中加防腐劑，或水洗到中性，高壓滅菌封存（或低溫存放）；半收縮保存：水洗后濾干，加70％乙醇使膠收縮，再浸泡于70％乙醇中保存；干燥保存：水洗后濾干，依次用50％、70％、90％、95％乙醇脫水，再用乙醚洗去乙醇，干燥(或60～80℃烘干）后保存。加乙醇時，切忌一上來就用濃乙醇處理，以防結(jié)塊。紫外檢測儀及記錄儀紫外檢測儀是生物大分子液相色譜中常用的檢測儀器，可用于連續(xù)測量液體流的紫外吸收，用與其相連接的記錄儀記錄下吸光值的變化情況，廣泛應(yīng)用于生物大分子的分離純化。一.北京新技術(shù)所生產(chǎn)的紫外檢測儀及記錄儀的使用：1．儀器的連接：紫外檢測儀出廠時安裝280nm濾光片，使用前應(yīng)確認(rèn)波長轉(zhuǎn)換開關(guān)在280nm處。用信號線將紫外檢測儀和記錄儀連接，分別開啟電源。層析柱出口的導(dǎo)管接到檢測儀的進(jìn)樣口（下口），檢測儀的出樣口（上口）與樣品收集裝置連接。2．紫外檢測儀的預(yù)熱：將檢測儀量程旋鈕至T檔位置，預(yù)熱約1h。3．記錄儀的調(diào)整：（1）檢測儀的輸出電壓為100mV，所以記錄儀的量程放在100mV；（2）按下輸入鍵，記錄儀輸入短路，用zero旋鈕調(diào)節(jié)0mV，彈起zero鍵，與檢測儀輸出連接。注意在測定過程中保持記錄儀和檢測儀的連接狀態(tài)，不能再調(diào)zero旋鈕；（3）調(diào)整紙速2cm/h，開始記錄時放下記錄筆，按下開始鍵。4．檢測儀的調(diào)整：(1)當(dāng)緩沖液流入吸收池后，將靈敏度旋鈕撥到T，調(diào)節(jié)透過率旋鈕，使輸出信號在90—95mV之間；5．實驗完畢將記錄筆抬起，按下記錄儀紙速快鍵，使記錄圖譜走出，小心取下圖譜，勿將記錄紙錯位，切記將紙速還原。(2)將靈敏度旋鈕調(diào)節(jié)到所用的A檔（使吸收峰的高度適中），調(diào)節(jié)吸光值旋鈕，使輸出在5mV左右，即可進(jìn)行吸光值測定。在測定過程中各調(diào)節(jié)旋鈕不要再動，測定完畢將量程旋鈕調(diào)回T檔位置。二.Amersham生產(chǎn)的紫外檢測儀及記錄儀的使用：1．儀器的連接和預(yù)熱：同上2．記錄儀的調(diào)整：(1)記錄儀的量程放在10mV；(2)按下zero鍵，調(diào)節(jié)adjust旋鈕使記錄筆至記錄紙的右端，注意實驗記錄時zero鍵必須處于彈起位置；(3)調(diào)整紙速0.5mm/min，開始記錄時按下penup-down鍵放下記錄筆，按下rec.off-on鍵開始記錄。（2）將靈敏度旋鈕撥到SHORT，用記錄儀的調(diào)零旋鈕調(diào)零；（3）將靈敏度旋鈕撥到2，用zero旋鈕調(diào)整記錄儀基線，將靈敏度旋鈕撥到合適的靈敏度范圍，用zero旋鈕微調(diào)記錄儀基線4．實驗完畢將記錄筆抬起，按下feed▼鍵，使記錄圖譜走出，小心取下圖譜，勿將記錄紙錯位。（1）當(dāng)緩沖液流入吸收池后，將AU/%T開關(guān)撥到AU3．檢測儀的調(diào)整：五.V。和Vi的測算層析用凝膠柱在使用前一般都應(yīng)了解其V。和Vi的大小。對分析用柱尤其是這樣。穩(wěn)定的凝膠拄床，V。通常占柱床總體積Vt的30％左右。V。太大則說明柱床沒有達(dá)到穩(wěn)定。對于相同型號凝膠所裝的凝膠柱來說，粗顆粒者的V。往往比細(xì)粒者為大。1．V。及Vi的測算

（1）重量法已知：Vt＝V0十Vi十Vg＝π/4·d2hVi=g·Wr式中g(shù)為干膠重量，Wr為“得水率”，即每克干膠之吸液量。所以：V。=Vt－（Vi十Vg）但這種算法不夠準(zhǔn)確，主要原因是Vg難以計算，它和凝膠的水化程度有關(guān)。一般粗略地將其估算為1cm3／g干膠。（2）過柱法已知物質(zhì)的洗脫體積Ve＝Vo十KdVi如用全滲入（Kd＝1）或全排阻（Kd＝0）的物質(zhì)過柱，測量其洗脫體積，便可計算出該凝膠柱的V。值及Vi值。實驗室中最常用的是藍(lán)色葡聚糖（Kd＝0）及重鉻酸鉀（Kd＝1），硫酸銨（Kd＝l）等。

2．Kd及Kav的測算當(dāng)測得某物質(zhì)的Ve,并不知道該凝膠柱的柱床總體積Vt，內(nèi)水體積Vi及外水體積Vo時，根據(jù)以下公式不難算出分配系數(shù)Kd和Kav值。Kd與Kav，，甚至Ve被認(rèn)為是一種組分（物質(zhì)）對于某一個凝膠柱的特征常數(shù)。在判斷高組分的分離情況，測定分子量以及預(yù)測放大柱床后的洗脫體積方面是很有用的。3．分辨率凝膠層析中，兩物質(zhì)（A和B）的分辨率（R）定義為：式中WA、WB分別為兩物質(zhì)洗脫峰的體積。也就是說，分辨率與洗脫體積的差值成正比，而與兩物質(zhì)的洗脫峰寬度成反比（下圖）。

洗脫分辨率圖當(dāng)R值＞1，兩物質(zhì)完全分開。小于l時則不能完全分離。提高分辨率的方法只有增大ΔVe或減小兩物質(zhì)洗脫峰的體積。因為VeA＝Vo十KdA·ViVeB＝Vo十KdB·ViΔVe＝Vi（KdB—KdA）＝ΔKdVi由于ΔKd是常數(shù)，只有增大Vi才能使ΔVe增加。這就是為什么在進(jìn)行組分分離時要求較大柱床體積的原因。減少（WA+WB）的方法有濃縮樣品（但粘度不能太大）；選用小粒度凝膠、流速適當(dāng)減慢等。六.葡聚糖凝膠離子交換劑使用方法新購進(jìn)的陽離子交換劑（如CM-SephadexC-25）為Na型，陰離子凝膠交換劑（如DEAE-SephadexA-25）為Cl-型，使用前要按一般離子交換劑的使用方法進(jìn)行轉(zhuǎn)型處理。1g陰離子交換劑約用100mL,0.5mo1/LNaoH溶液浸泡20min后減壓過濾，充分洗滌，再用等量0.5mol／LHCL處理，洗至中和備用。陽離子交換劑lg約用100mL0.5mol／LHCL浸泡20min后過濾，充分洗滌，再用等量0.5mo1／LNaOH溶液處理20min，洗至中性備用。將以上處理好的葡聚糖凝膠離子交換劑，用20～30倍量與層析時所用的同種緩沖液浸泡（但濃度要高，如0.1～0.5mol／L），再用同種酸或堿調(diào)節(jié)至所需要pH值，放置1h后，待pH值不變即可減壓過濾。凝膠離子交換劑保存時，需先轉(zhuǎn)成鹽型。其他使用方法均同G-類葡聚糖凝膠。再次用緩沖溶液充分浸泡、洗滌，除去氣泡后即可上柱。