生物化學(xué)酶促反應(yīng)動力學(xué)

關(guān)于生物化學(xué)酶促反應(yīng)動力學(xué)第一頁，共十九頁，編輯于2023年，星期二pH對酶活性的影響實驗原理只有當(dāng)酶蛋白處于一定的構(gòu)象及電荷狀態(tài)，才有利于酶和底物的結(jié)合和催化，使酶促反應(yīng)最強，因此酶反應(yīng)介質(zhì)的pH可影響酶分子。在某一pH時，酶的催化活性達到最大值，該pH稱為酶的最適pH。堿性磷酸酶的最適pH為8~12。本實驗采用磷酸苯二鈉法，在不同的pH值的甘氨酸緩沖液條件下，測定其活性，從而確定其最適pH。以磷酸苯二鈉為底物，被堿性磷酸酶水解后則產(chǎn)生游離酚和磷酸鹽。酚在堿性溶液中與氨基安替比林作用，經(jīng)鐵氰化鉀氧化可產(chǎn)生紅色的醌類衍生物。根據(jù)紅色深淺就可測出酶的活性，從而得出酶的最適pH。第二頁，共十九頁，編輯于2023年，星期二反應(yīng)式如下：第三頁，共十九頁，編輯于2023年，星期二實驗材料

甘氨酸緩沖液、0.04mol/L底物液、酶液、0.1mol/LpH10碳酸鹽緩沖液、0.5%鐵氰化鉀液、酚標(biāo)準(zhǔn)液、pH8.8Tris-乙酸緩沖液、堿液、0.3%4-氨基安替比林液、0.04mol/LNa2HPO4第四頁，共十九頁，編輯于2023年，星期二實驗方法1.取試管6支，編號，表操作管號123456各pH甘氨酸pH8.0pH9.0pH10.0pH11.0pH12.0------緩沖液（ml）1.01.01.01.01.0——蒸餾水（ml）——————————1.00.04mol/L底物液1.01.01.01.01.01.037℃水浴中保溫5min酶液（ml）0.10.10.10.10.1——pH8.8Tris-乙酸緩沖液——————————0.1第五頁，共十九頁，編輯于2023年，星期二2.加入酶液后，立即計時，混勻后，在37℃水浴中準(zhǔn)確保溫5min。3.保溫后，各管中立即加入堿性液1.0ml終止反應(yīng)。4.各管中分別加入0.3%4-氨基安替比林液1.0ml及0.5%鐵氰化鉀2.0ml充分混勻，使呈色完全。室溫放置10min，以6號管為空白,不比色,用+來表示顏色的深淺.第六頁，共十九頁，編輯于2023年，星期二溫度對酶活性的影響實驗原理

溫度對酶活性有顯著的影響。溫度低時，酶促反應(yīng)減弱或停止，溫度從較低逐漸升高時，反應(yīng)速度也隨之逐漸增加，當(dāng)溫度升高到某一定值時，酶促反應(yīng)達到最高峰，此溫度稱為酶的最適溫度。但酶是蛋白質(zhì)，其本身也因溫度升高而變性，超過最適溫度時，其活性反而降低。一般溫度升至80℃以上，酶活性幾乎全部喪失。應(yīng)指出，在進行體外實驗時，酶的最適溫度會隨著保溫時間長短而有所變化。

本實驗以堿性磷酸酶為例，在一定時間，觀察酶活性在不同溫度下的變化。第七頁，共十九頁，編輯于2023年，星期二實驗步驟1.取試管5支，編號，按表操作。1234空白0.1mol/LpH10的碳酸鹽緩沖液1.01.01.01.01.00.04mol/L底物液1.01.01.01.01.0預(yù)溫溫度放冰浴3min放37℃水浴3min放沸水浴3min酶液冰浴中預(yù)冷酶液0.1ml室溫下酶液0.1ml蒸餾水0.1ml保溫溫度放冰浴15min放冰浴15min后立即移至37℃水浴15min放37℃水浴15min放沸水浴15min后立即移至37℃水浴15min放37℃水浴15min第八頁，共十九頁，編輯于2023年，星期二2.各管保溫后，立即加入堿性試劑1.0ml以終止反應(yīng)。3.各管中分別加入0.3%4-氨基安替比林液1.0ml及0.5%鐵氰化鉀2.0ml充分混勻，室溫放置10min，以空白管校正零點，不比色,用+來表示顏色的深淺.第九頁，共十九頁，編輯于2023年，星期二底物濃度對酶活性的影響

實驗原理1913年，Michaelis和Menten提出了酶促反應(yīng)速度和底物濃度的關(guān)系式，即米氏方程。

V＝Vm×[S]/(Km+[S])式中：

V為反應(yīng)初速度

Vm為最大反應(yīng)速度

[S]為底物濃度

Km為米氏常數(shù)Km值是酶的一個特征性常數(shù)，可近似表示酶與底物的親和力。

雙倒數(shù)作圖法是用實驗方法測定Km值的最常用的方法。第十頁，共十九頁，編輯于2023年，星期二雙倒數(shù)作圖法。

1Km11

=

+

V

Vmax[S]Vmax取米氏方程式的倒數(shù)形式：1/Vmax斜率=Km/Vmax-1/Km米氏常數(shù)Km的測定

實驗時選擇不同的[S]，測定相對應(yīng)的V。求出兩者的倒數(shù)，以1/V對1/[S]作圖，則得到一個斜率為Km/Vm的直線。將直線外推與橫軸相交，其橫軸截矩為：－1/[S]＝1/Km，由此求出Km值。該法比較簡便。本實驗即以AKP為例，測定不同底物濃度對酶活性的影響，按雙倒數(shù)方程式作圖，計算出Km值。第十一頁，共十九頁，編輯于2023年，星期二實驗方法1.取干凈試管10支，編號，按表操作（注：刪除掉1、3、5、7試管）管號123456789100.04mol/L底物液0.050.10.20.30.40.81.01.2----------pH10的碳酸鹽緩沖液0.70.70.70.70.70.70.70.70.70.7蒸餾水(ml)1.151.11.00.90.80.40.2-----1.21.237℃水浴保溫5min酶液（ml）0.10.10.10.10.10.10.10.10.10.1第十二頁，共十九頁，編輯于2023年，星期二

底物濃度對酶活性影響實驗的操作酚標(biāo)準(zhǔn)液------------------------------------------------------0.1最終底物液(不加)12468162020------------加入酶后立即計時，各管混勻后均在37℃水浴中準(zhǔn)確保溫15min，保溫后立即加人堿性溶液以終止反應(yīng)堿性溶液1.01.01.01.01.01.01.01.01.01.00.3%4-氨基安替比林液1.01.01.01.01.01.01.01.01.01.00.5%鐵氰化鉀2.02.02.02.02.02.02.02.02.02.0第十三頁，共十九頁，編輯于2023年，星期二各管充分混勻，放置十分鐘，以第九管為對照，于波長510nm處比色，測定各管的吸光率，并計算出各管的酶活性。（注：9號試管為空白，10號為標(biāo)準(zhǔn)）2.作圖（1）以酶活性單位代表各管中該酶反應(yīng)速度（V）為縱坐標(biāo)，為以底物濃度（[S])橫坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上描出各點并連接之，觀察該圖形的形狀。（2）以酶活性單位的倒數(shù)代表該酶反應(yīng)速度的倒數(shù)（1/V）為縱坐標(biāo)，以底物濃度的倒數(shù)（1/[S]）為橫坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上描出各點并連接之，求出該酶的Km。第十四頁，共十九頁，編輯于2023年，星期二抑制劑對酶促反應(yīng)速度的影響實驗原理

能降低酶活性，甚至使酶完全喪失活性的物質(zhì)，被稱為酶的抑制劑。酶的抑制分為可逆性與不可逆性抑制兩大類。不可逆性抑制劑與酶生成共價結(jié)合的復(fù)合物，或以其他結(jié)合方式生成結(jié)合牢固且難于再解離的復(fù)合物。可逆性抑制劑如一般與酶的底物的化學(xué)結(jié)構(gòu)相似的物質(zhì)（競爭性抑制劑），可與酶的活性中心結(jié)合，從而使酶與其底物結(jié)合的比例減少，降低酶促反應(yīng)速度，但當(dāng)加大底物濃度時，可逆轉(zhuǎn)其抑制。

本實驗以無機磷酸鹽及茶堿作為堿性磷酸酶的競爭性抑制劑進行實驗，所得數(shù)據(jù)仍按雙倒數(shù)方程作圖，從而觀察此類抑制的動力學(xué)特點。第十五頁，共十九頁，編輯于2023年，星期二實驗方法1.取干凈試管10支，編號，按表操作（注：刪除掉1、3、5、7試管）管號123456789100.04mol/L底物液0.050.10.20.30.40.81.01.2----------0.04mol/LNa2HPO40.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.1mol/LpH10的碳酸鹽緩沖液0.60.60.60.60.60.60.60.60.60.6蒸餾水1.151.11.00.90.80.40.2-----1.21.2第十六頁，共十九頁，編輯于2023年，星期二管號1234567891037℃保溫5min酶液0.10.10.10.10.10.10.10.10.10.1酶標(biāo)準(zhǔn)液一一一一一一一一一一最終底物液(不加)12468162024一一加入酶液后，立即計時，混勻后37℃水浴中準(zhǔn)確保溫15min，保溫后，立即加入堿性溶液以終止反應(yīng)堿性溶液1.01.01.01.01.01.01.01.01.01.00.3%4-氨基安替比林液1.01.01.01.01.01.01.01.01.01.00.5%鐵氰化鉀2.02.02.02.02.02.02.02.02.02.0第十七頁，共十九頁，編輯于2023年，星期二

充分混勻，室溫放10min，以空白為對照，于波長510nm處比色，記錄各管吸光率，并計算各