有機化合物和藥物結(jié)構(gòu)分析中的核磁共振技術(shù)

薛思佳柯少勇核磁共振（NMR）是一種用來研究物質(zhì)分子結(jié)構(gòu)及物理特性的光譜學方法，它經(jīng)歷了從1960年代的連續(xù)波（continuouswave,CW）技術(shù)到1970年代的脈沖傅里葉變換（pulsefouriertransform,PFT）以及超導(dǎo)核磁共振等幾個發(fā)展階段。尤其是近年來脈沖傅里葉變換以及超導(dǎo)核磁共振的引用，提高了核磁共振譜儀的靈敏度，使核磁共振技術(shù)在微量分析方面得到廣泛應(yīng)用。大型高速計算機的發(fā)展和應(yīng)用使二維和三維核磁共振技術(shù)得到長足的發(fā)展，成為科技人員不可缺少的結(jié)構(gòu)分析工具。早期NMR技術(shù)的應(yīng)用僅局限于物理學領(lǐng)域，主要用于測定原子核的磁矩等物理常數(shù)。1950年代，普羅克特（W.G.Proctor）等人發(fā)現(xiàn)處在不同化學環(huán)境的同種原子核具有不同的共振頻率，即化學位移。接著又發(fā)現(xiàn)相鄰自旋核會引起核磁共振譜的分裂，即自旋-自旋耦合。這一切開拓了NMR技術(shù)在化學領(lǐng)域中的應(yīng)用。1966年，瑞士科學家厄恩斯特（R.R.Ernst）發(fā)明了脈沖傅里葉變換NMR，將NMR儀器和技術(shù)推向一個嶄新的高度，并因此于1991年獲得諾貝爾化學獎。1990年代，超高場核磁共振譜儀的問世，極大地提高了檢測的靈敏度和分辨率，加之NMR與計算機科學的完美結(jié)合，二維和三維NMR、固體高分辨NMR、液相色譜-核磁共振聯(lián)用（LC/NMR）等新技術(shù)如雨后春筍般不斷涌現(xiàn)，使NMR成為理論嚴密、技術(shù)先進、結(jié)果可靠、獨立的物質(zhì)結(jié)構(gòu)分析方法，被廣泛應(yīng)用于藥物有機分子結(jié)構(gòu)確證、蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)研究、物質(zhì)科學的固體成像，以及臨床醫(yī)學疾病診斷等領(lǐng)域。NMR在藥物發(fā)現(xiàn)和藥物結(jié)構(gòu)分析中的應(yīng)用就本質(zhì)而言，核磁共振譜與紅外和紫外吸收光譜一樣，是由物質(zhì)與電磁波相互作用而產(chǎn)生的，屬于吸收光譜范疇。根據(jù)核磁共振譜圖上共振峰的位置、強度和精細結(jié)構(gòu)就可以研究物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)。藥物發(fā)現(xiàn)是合成新化合物、確認其結(jié)構(gòu)和發(fā)現(xiàn)生物活性的全過程。其中，新化合物主要來源于兩種途徑：一種是從天然產(chǎn)物中提取活性物質(zhì)，另一種是人工化學合成。不管由哪種方法獲得新化合物，接下來要做的首要工作就是確證該化合物的分子結(jié)構(gòu)。一般未知物的NMR解析步驟如下：（1）做出13C譜，確定碳的總數(shù)；（2）做出碳分類譜（DEPT），確認伯、仲、叔、季碳，確定碳的骨架單元；（3）做出13C-1H相關(guān)譜（HMQC），確認各碳上可能存在的氫；（4）做出1H-1H化學位移相關(guān)譜（TOCSY），找出各氫之間的鏈接及耦合關(guān)系，確定可能的結(jié)構(gòu)單元；（5）做出異核多鍵遠程相關(guān)譜（HMBC），將可能的結(jié)構(gòu)單元相連接；（6）做出空間效應(yīng)譜（nuclearoverhausedeffectspectroscopy，NOESY），充分考慮分子結(jié)構(gòu)的空間效應(yīng)，精確連接結(jié)構(gòu)單元；（7）對分子結(jié)構(gòu)進行全面確認。對確定一個未知物的分子結(jié)構(gòu)來說，最重要的有兩個譜：碳分類譜（DEPT）和13C-1H相關(guān)譜（HMQC）。DEPT譜是一種不失真的最好的極化轉(zhuǎn)移增強與譜編輯技術(shù)，主要用于有機物結(jié)構(gòu)測定中增強碳譜的靈敏度，并對屬于伯、仲、叔和季碳的NMR信號進行分類，從而確定碳原子級數(shù)。DEPT譜包括三個子譜：DEPT-45、DEPT-90和DEPT-135譜。而HMQC譜是異核多量子化學位移相關(guān)譜，它實現(xiàn)了13C和與之相連的質(zhì)子的相關(guān)，即一鍵相關(guān)。有了以上兩個譜圖的重要信息，可以基本勾畫出一個未知物的結(jié)構(gòu)單元，再結(jié)合同核1H-1H化學位移相關(guān)譜（COSY）、異核多鍵遠程相關(guān)譜和空間效應(yīng)譜，就可全面準確地確證一個未知物的分子結(jié)構(gòu)。

隨著化學、化工、生化、制藥等研究領(lǐng)域的迅猛發(fā)展，人們越來越關(guān)注蛋白質(zhì)、天然及合成藥物或其他天然產(chǎn)物等復(fù)雜分子的結(jié)構(gòu)和構(gòu)型。從1970年代起國際上發(fā)展了自旋-自旋耦合質(zhì)子的二維NMR技術(shù)，即在同核1H-1H化學位移相關(guān)譜中，采用各種脈沖序列，在兩個獨立的時間域進行兩次傅里葉變換得到兩個獨立的垂直頻率坐標系的譜圖。二維NMR大大提高了譜分辨率，清楚準確地反映出各種復(fù)雜分子結(jié)構(gòu)中各種原子之間的鏈接、耦合及空間信息。二維核磁共振譜主要有三類譜圖：J分解譜（即自旋耦合分解譜）、化學位移相關(guān)譜和多量子躍遷譜。其中化學位移相關(guān)譜（又稱6-6譜）是二維核磁共振譜的核心，它表明共振信號的相關(guān)性。這其中共有三種位移相關(guān)譜：同核耦合、異核耦合和化學交換。在研究中可以通過相敏的1H-1H化學位移相關(guān)譜研究分子結(jié)構(gòu)中各種氫的相關(guān)性，再通過靈敏度增強的異核位移相關(guān)譜，1H-13C相關(guān)譜實驗以及帶有梯度場脈沖的1H-13C異核遠程相關(guān)實驗來研究分子結(jié)構(gòu)中碳與氫的互相鍵合與耦合關(guān)系，還可以通過空間效應(yīng)譜實驗來研究更為復(fù)雜的分子空間立體結(jié)構(gòu)。1H-1H化學位移相關(guān)譜是全相關(guān)譜，在該譜中，可發(fā)現(xiàn)所有同為相同自旋體系部分的質(zhì)子的交叉峰，這種技術(shù)的優(yōu)勢在于它可以在共振重疊的地方解釋譜圖，得到的信息在研究肽和蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)時十分重要。13C-1H異核多量子化學位移相關(guān)譜實驗和13C-1H異核多鍵遠程相關(guān)譜實驗也稱為反向（inverse）實驗，即通過采集1H的信號，顯示13C-1H之間的相關(guān)信號；與它們相反的正向?qū)嶒灧謩e是二維異核化學位移相關(guān)譜（XHCORR）和長程耦合的異核位移相關(guān)譜（COLOC），是通過采集13C信號顯示13C-1H之間的相關(guān)信號。反向?qū)嶒炗捎谑遣杉哂凶罡?酌值（旋核比）的1H信號，因此靈敏度比正向?qū)嶒灨吆芏?。這種技術(shù)使得13C化學位移能夠與那些相隔2?3個鍵的質(zhì)子的化學位移相關(guān)?？臻g效應(yīng)譜主要反映了有機化合物結(jié)構(gòu)中核與核之間空間距離的關(guān)系，而與兩者間相距多少根化學鍵無關(guān)。其與同核1H-1H化學位移相關(guān)譜的重要區(qū)別在于交叉峰指出的是在空間上相互接近的質(zhì)子，即它給出的線索是通過空間，而不是通過鍵的相互作用，因此對確定有機化合物結(jié)構(gòu)、構(gòu)型和構(gòu)像以及生物大分子構(gòu)像（如蛋白質(zhì)分子在溶液中的二級結(jié)構(gòu)等）有著重要意義。在2002年，意大利科學家巴尼（E.Barni）等人利用二維核磁技術(shù)中的空間效應(yīng)譜（1H-1HNOESY）系統(tǒng)分析了苯并咪唑類衍生物的分子結(jié)構(gòu)。在該類化合物分子中位于環(huán)上不同位置的氫原子其所處的化學環(huán)境可能并不相同，在進行結(jié)構(gòu)鑒定時，使用簡單的一維核磁共振技術(shù)無法準確分辨它們，但使用二維NMR技術(shù)中的空間效應(yīng)譜就可以對該類化合物進行很好的結(jié)構(gòu)認證。利用二維NMR技術(shù)，結(jié)合計算機模擬，還可以測定生物大分子在溶液中的三維空間結(jié)構(gòu)，研究蛋白質(zhì)折疊機制及動力學過程、酶催化過程、蛋白質(zhì)和核酸的相互作用、藥物同受體的相互作用等。近年來，二維NMR還被用于研究系列定位突變體的結(jié)構(gòu)和功能變化三維NMR三維NMR譜與結(jié)構(gòu)生物學有機化學、藥物化學和生物化學的發(fā)展要求人們必須在三維空間上了解分子的結(jié)構(gòu)和性能，尤其是與生命過程有關(guān)的化學問題。如藥物分子的立體構(gòu)型與受體之間的相互作用，生化反應(yīng)過程的立體選擇性和分子的立體構(gòu)型之間的關(guān)系，各類天然有機化合物的立體構(gòu)型與它們表現(xiàn)出的生物活性之間的關(guān)系等，這類問題導(dǎo)致了三維NMR技術(shù)的產(chǎn)生與發(fā)展。三維NMR技術(shù)是二維NMR技術(shù)的發(fā)展，它主要用于測定生物大分子，尤其是蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)。通過肽把一個氨基酸殘基上的1H磁化矢量轉(zhuǎn)移到另一個氨基酸殘基，再用三維NMR方法進行序列歸屬。該方法的精確性可與晶體的X射線衍射成像相媲美，而其優(yōu)越性則在于測定的是溶液中的結(jié)構(gòu)，從而可以研究蛋白質(zhì)發(fā)揮功能的動力學過程。三維NMR技術(shù)也廣泛應(yīng)用于天然有機化合物（天然產(chǎn)物）絕對構(gòu)型的測定，從而為進一步測定其生物活性提供了一定的依據(jù)。高分辨NMR技術(shù)高分辨NMR技術(shù)包括交叉極化魔角旋轉(zhuǎn)（CP-MAS）和高分辨魔角旋轉(zhuǎn)（HR-MAS）技術(shù)。這兩項技術(shù)最適宜測定固體和具有部分流動性的固體。迄今為止，進行核磁共振譜測定時，通常要將樣品先制成溶液然后再進行測定。固體樣品的核磁共振譜分辨率很差，這是由于固體分子不能自由運動，13C核在外磁場中有各種取向，造成吸收峰很寬（各向異性寬峰）的緣故。針對固體化學位移的各向異性以及自旋晶格馳豫時間很長的缺點，采用交叉極化魔角旋轉(zhuǎn)技術(shù)，通過使樣品在旋轉(zhuǎn)軸與磁場方向夾角為54.7。的方向上高速旋轉(zhuǎn)以及交叉極化等方法，使上述不足之處得以順利解決。高分辨魔角旋轉(zhuǎn)技術(shù)可以對一些具有部分流動性的物質(zhì)進行結(jié)構(gòu)研究。當樣品具有一定的流動性時，雖能平均掉相當一部分固體性質(zhì)所造成的各向異性，但仍不能達到像液體樣品那樣的高分辨率。此時，應(yīng)用高分辨魔角旋轉(zhuǎn)可以平均掉剩余線寬而使譜線變窄，從而獲得接近液體樣品的線寬。這些方法在活體樣品和生物組織的結(jié)構(gòu)研究中具有獨特的優(yōu)勢，同時也被廣泛應(yīng)用于材料科學、礦物分析、表面吸附、聚合體陶瓷以及組合化學等研究領(lǐng)域。美國布魯克公司核磁應(yīng)用部曾分別利用400兆赫和800兆赫場強的核磁共振儀對狗的血樣進行了比校分析。理論上后者測試結(jié)果的分辨率應(yīng)遠遠高于前者的，但由于在用400兆赫場強的儀器測試時運用了高分辨魔角旋轉(zhuǎn)技術(shù)，而在800兆赫場強的儀器測試中仍然使用常規(guī)技術(shù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用了高分辨魔角旋轉(zhuǎn)技術(shù)的實驗結(jié)果比高場強核磁共振儀的測試結(jié)果分辨率更高。該項研究表明高分辨核磁共振技術(shù)在流體樣品和生物組織結(jié)構(gòu)研究中確實具有獨特的優(yōu)勢。磁共振成像與疾病診斷自從1973年勞特伯（P.C.Lauterbur）在世界上首次發(fā)表關(guān)于實現(xiàn)磁共振成像（MRI）的論文以來，這個跨物理學、無線電電子學、計算機技術(shù)以及應(yīng)用數(shù)學的邊緣學科，無論是發(fā)展規(guī)模還是發(fā)展速度，都處于核磁共振領(lǐng)域的首位。隨著二維、三維NMR的發(fā)展，人們很快認識到NMR成像對研究人和動物解剖具有巨大潛力。由于水含量和馳豫時間的差異，利用適當?shù)腘MR脈沖序列就可以區(qū)別不同的生物組織，獲得有明顯差異的正常和病理組織的圖像。作為臨床許多疾病的診斷工具，其安全性和準確性遠優(yōu)于其他成像技術(shù)，如計算機軸向體層攝影（CT）。而最讓人興奮的是基于順磁去氧紅細胞的磁敏感效應(yīng)來研究局部大腦功能?？茖W家們應(yīng)用NMR連續(xù)監(jiān)測大腦運動中樞部位的圖像變化，以確定該區(qū)域的功能，從而為研究人腦深層次的思維活動開辟了一片新天地，給腦功能研究帶來了福音。核磁共振成像的方法很多，主要有自旋密度成像、化學位移成像及弛豫時間T1和T2加權(quán)成像。近年來，快速成像技術(shù)已基本解決。迄今已出現(xiàn)的幾十種快速成像技術(shù)中，最快的可以平均50毫秒成一幅圖像的速率不斷掃描人體，克服了長期以來由于速率太慢而無法直接掃描人體心臟及研究某些動態(tài)過程的困難。最近擴散（diffusion）成像及灌注（perfusion）成像的理論與應(yīng)用研究又成為新的熱門領(lǐng)域?？梢韵嘈牛S著NMR和計算機科學的理論與技術(shù)不斷發(fā)展并日趨成熟，NMR無論在廣度和深度方面必將出現(xiàn)新的飛躍性進展，并一定會在有