文檔革蘭氏染色

革蘭氏染色法是細(xì)菌學(xué)中廣泛使用的一種鑒別染色法，1884年由丹麥醫(yī)師Gram創(chuàng)立。

細(xì)菌先經(jīng)堿性染料結(jié)晶染色，而經(jīng)碘液媒染后，用酒精脫色，在一定條件下有的細(xì)菌此色不被脫去，有的可被脫去，因此可把細(xì)菌分為兩大類，前者叫做革蘭氏陽性菌（G+），后者為革蘭氏陰性菌（G—）。為觀察方便，脫色后再用一種紅色染料如堿性蕃紅等進行復(fù)染。陽性菌仍帶紫色，陰性菌則被染上紅色。有芽胞的桿菌和絕大多數(shù)和球菌，以及所有的放線菌和真菌都呈革蘭氏正反應(yīng)；弧菌，螺旋體和大多數(shù)致病性的無芽胞桿菌都呈現(xiàn)負(fù)反應(yīng)。

革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌在化學(xué)組成和生理性質(zhì)上有很多差別，染色反應(yīng)不一樣?，F(xiàn)在一般認(rèn)為革蘭氏陽性菌體內(nèi)含有特殊的核蛋白質(zhì)鎂鹽與多糖的復(fù)合物，它與碘和結(jié)晶紫的復(fù)合物結(jié)合很牢，不易脫色，陰性菌復(fù)合物結(jié)合程度底，吸附染料差，易脫色，這是染色反應(yīng)的主要依據(jù)。

另外，陽性菌菌體等電點較陰性菌為低，在相同PH條件下進行染色，陽性菌吸附堿性染料很多，因此不易脫去，陰性菌則相反。所以染色時的條件要嚴(yán)格控制。例如，在強堿的條件下進行染色，兩類菌吸附堿性染料都多，都可呈正反應(yīng)；PH很低時，則可都呈負(fù)反應(yīng)。此外，兩類菌的細(xì)胞壁等對結(jié)晶紫—碘復(fù)合物的通透性也不一致，陽性菌透性小，故不易被脫色，陰性菌透性大，易脫色。所以脫色時間，脫色方法也應(yīng)嚴(yán)格控制。

革蘭氏染色法一般包括初染、媒染、脫色、復(fù)染等四個步驟，具體操作方法是：

1）涂片固定。

2）草酸銨結(jié)晶紫染1分鐘。

3）自來水沖洗。

4）加碘液覆蓋涂面染1分鐘。

5）水洗，用吸水紙吸去水分。

6）加95%酒精數(shù)滴，并輕輕搖動進行脫色，30秒后水洗，吸去水分。

7）蕃紅梁色液（稀）染10秒鐘后，自來水沖洗。干燥，鏡檢。

染色的結(jié)果，革蘭氏正反應(yīng)菌體都呈紫色，負(fù)反應(yīng)菌體都呈紅色。一、常用染色液的配制⒈碘-碘化鉀（I2-KI）溶液能將淀粉染成藍(lán)紫色，蛋白質(zhì)染成黃色，也是植物組織化學(xué)測定的重要試劑。配方：碘化鉀2g；蒸餾水300ml；碘1g先將碘化鉀溶于少量蒸餾水中，待全溶解后再加碘，振蕩溶解后稀釋至300mL，保存在棕色玻璃瓶內(nèi)。用時可將其稀釋2-10倍，這樣染色不致過深，效果更佳。⒉蘇丹Ⅲ（sudanⅢ或Ⅳ）能使木栓化、角質(zhì)化的細(xì)胞壁及脂肪、揮發(fā)油、樹脂等染成紅色或淡紅色，是著名的脂肪染色劑。配方：（1）蘇丹III或蘇丹Ⅳ干粉0.1g；95％酒精10ml；過濾后再加入10ml甘油（2）先將0.1g蘇丹III或IV溶解在50ml丙酮中，再加入70%酒精50ml。（3）蘇丹III70%乙醇的飽和溶液。⒊1％醋酸洋紅（acetocarmine）酸性染料，適用于壓碎涂抹制片，能使染色體染成深紅色，細(xì)胞質(zhì)成淺紅色。配方：洋紅1g；45％醋酸100ml煮沸2h左右，并隨時注意補充加入蒸餾水到原含量，然后冷卻過濾，加入4％鐵明礬溶液1～2滴（不能多加，否則會發(fā)生沉淀），放入棕色瓶中備用。⒋改良苯芬品紅染色液（Carbolfuchsine）核染色劑。配制步驟：先配成三種原液，再配成染色液。原液A：3g堿性品紅溶于100ml70％酒精中。原液B：取原液A10ml加入到90ml5％石炭酸水溶液中。原液C：取原液B55ml，加入6ml冰醋酸和6ml福爾馬林（38％的甲醛）。（原液A和原液C可長期保存，原液B限兩周內(nèi)使用）染色液：取C液10～20ml，加45％冰醋酸80～90ml，再加山梨醇1~1.8g，配成10％～20％濃度的石炭酸品紅液，放置兩周后使用，效果顯著（若立即用，則著色能力差）。適用范圍：適用于植物組織壓片法和涂片法，染色體著色深，保存性好，使用2～3年不變質(zhì)。山梨醇為助滲劑，兼有穩(wěn)定染色液的作用，假如沒有山梨醇也能染色，但效果較差。⒌中性紅（neutralred）溶液用于染細(xì)胞中的液泡，可鑒定細(xì)胞死活。配方：中性紅0.1g；蒸餾水100ml使用時再稀釋10倍左右。⒍曙紅Y（伊紅，eosinY）酒精溶液常與蘇木精對染，能使細(xì)胞質(zhì)染成淺紅色，起襯染作用。配方：曙紅0.25g；95％酒清100ml也常用于95％酒精脫水時，加入少量曙紅溶液，其目的是在包埋、切片、展片、鏡檢時便于識別材料。

配制步驟：（1）將蘇木精溶于酒精中，瓶口用雙層紗布包扎，使其充分氧化（通常在室內(nèi)放置兩個月后方可使用）。（2）加入蒸餾水，塞緊瓶口，置冰箱中可長期保存。切片需先經(jīng)甲液媒染，并充分水洗后才能以乙液染色，染色后經(jīng)水稍洗再用另一瓶甲液分色至適度。

鐵礬蘇木精染液為細(xì)胞學(xué)上染細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)最好的染色劑，但要注意甲液與乙液在任何情況下決不能混合。⒖亞甲基藍(lán)染液常用于細(xì)菌、活體細(xì)胞等的染色。取0.1g亞甲基藍(lán)，溶于100ml蒸餾水中即成。⒗詹納斯綠B（JanusgreenB）染液將5.18gJanus綠溶于100ml蒸餾水，配成飽和水溶液。用時需稀釋。稀釋的倍數(shù)應(yīng)視材料不同而異。⒘硫堇染液取0.25克硫堇(也稱勞氏青蓮或勞氏紫)粉末，溶于100ml蒸餾水中，即可使用。使用此液時，需要用微堿性自來水封片或用1%NaHCO3水溶液封片，能成多色反應(yīng)。18.黑色素液水溶性黑素10g，蒸餾水100mL，甲醛(福爾馬林)0.5mL?？捎米髑v膜的背景染色。19.墨汁染色液國產(chǎn)繪圖墨汁40mL，甘油2mL，液體石炭酸2mL。先將墨汁用多層紗布過濾，加甘油混勻后，水浴加熱，再加石炭酸攪勻，冷卻后備用。用作莢膜的背景染色。20.呂氏(Loeffier)美藍(lán)染色液A液：美藍(lán)(methyleneblue,又名甲烯藍(lán))0.3g，95%乙醇30mL;B液：0.01%KOH100mL?；旌螦液和B液即成，用于細(xì)菌單染色，可長期保存。根據(jù)需要可配制成稀釋美藍(lán)液，按1∶10或1∶100稀釋均可。21.革蘭氏染色液(1)結(jié)晶紫(cristalviolet)液：結(jié)晶紫乙醇飽和液(結(jié)晶紫2g溶于20mL95%乙醇中)20mL，1%草酸銨水溶液80mL。將兩液混勻置24h后過濾即成。此液不易保存，如有沉淀出現(xiàn)，需重新配制。(2)蘆戈(Lugol)氏碘液：碘1g，KI2g，蒸餾水300mL。先將KI溶于少量蒸餾水中，然后加入碘使之完全溶解，再加蒸餾水至300mL，即成。配成后貯于棕色瓶內(nèi)備用，如變?yōu)闇\黃色能使用。(3)95%乙醇：用于脫色，脫色后可選用以下(4)或(5)的其中一項復(fù)染即可。(4)稀釋石炭酸復(fù)紅溶液：堿性復(fù)紅乙醇飽液(堿性復(fù)紅1g，95%乙醇10mL，5%石炭酸90mL)10mL，加蒸餾水90mL。(5)番紅溶液：番紅O(safranineO，又稱沙黃O)2.5g，95%乙醇100mL，溶解后可貯存于密閉的棕色瓶中，用時取20mL與80mL蒸餾水混勻即可。以上染色液配合使用，可區(qū)分出革蘭氏染色陽性(G+)或陰性(G-)細(xì)菌，前者藍(lán)紫色，后者淡紅色。22.齊氏(Ziehl)石炭酸復(fù)紅液：堿性復(fù)紅0.3g溶于95%乙醇10mL中為A液；0.01%KOH溶液100mL為B液?；旌螦、B液即成。23.姬姆薩(Giemsa)染液(1)貯存液：稱取姬姆薩粉0.5g，甘油33mL，甲醇33mL。先將姬姆薩粉研細(xì)，再逐滴加入甘油，繼續(xù)研磨，最后加入甲醇，在56℃放置1-24h后即可使用。

(2)應(yīng)用液(臨用時配制)：取1mL貯存液加19mLpH7.4磷酸緩沖液即成。也可以貯存液∶甲醇=1∶4的比例配制成染色液。24.1%瑞氏(Wright's)染色液稱取瑞氏染色粉6g，放研缽內(nèi)磨細(xì)，不斷滴加甲醇(共600mL)并繼續(xù)研磨使溶解。經(jīng)過濾后染液須貯存一年以上才可使用，保存時間愈久，則染色色澤愈佳。二、常用試劑的配制(一)顯微鏡鏡頭清潔劑將乙醚和乙醇按7∶3混合，裝入滴瓶備用。用于擦拭顯微鏡鏡頭上油跡和污垢等（注意瓶口必須塞緊，以免揮發(fā)）。(二)固定液1.福爾馬林-乙酸-酒精固定液（FAA，又稱萬能固定劑）福爾馬林（38％甲醛）5ml＋冰乙酸5ml＋70％酒精90ml，可用于固定植物的一般組織，但不適用于單細(xì)胞及絲狀藻類。幼嫩材料用50％酒精代替70％酒精，可防止材料收縮；還可加入5ml甘油（丙三醇）以防蒸發(fā)和材料變硬。FAA可兼作保存劑。2.福爾馬林-丙酸-酒精固定液（FPA）福爾馬林5ml＋丙酸5ml＋70％酒精90ml，用于固定一般的植物材料，通常固定24h，效果比FAA好，并可長期保存。3.福爾馬林-丙酸-氯仿固定液（卡諾固定液）配方一：無水酒精3份＋冰乙酸1份。配方二：無水酒精6份＋冰乙酸1份＋氯仿3份。是研究植物細(xì)胞分裂和染色的優(yōu)良固定液，材料固定后，用95％和85％的酒精浸洗，清洗2-3次，也可轉(zhuǎn)入70％酒精中保存?zhèn)溆谩?.甘油-酒精軟化劑甘油1份＋50％或70％酒精1份，適用于木材的軟化，將木質(zhì)化根、莖等材料排除空氣后浸入軟化液中，時間至少一周或更長一些，也可將材料保存于其中備用。5.鉻酸-乙酸固定液根據(jù)固定對象的不同，可分強、中、弱3種不同的配方：弱液配方：10％鉻酸2.5ml＋10％乙酸5.0ml＋蒸餾水92.5ml。中液配方：10％鉻酸7ml+10％乙酸10ml＋蒸餾水83ml。強液配方：10％鉻酸10ml+10％乙酸30ml＋蒸餾水60m1。弱液用于固定較柔嫩的材料，例如藻類、真菌類、苔藥植物和蕨類的原葉體等，固定時間較短，一般為數(shù)小時，最長可固定12-24h，但藻類和蕨類的原葉體可縮短到幾分鐘到1h。中液用作固定根尖、莖尖、小的子房和胚珠等，固定時間12-24h或更長。強液適用于木質(zhì)的根、莖和堅韌的葉子、成熟的子房等。為了易于滲透，可在中液和強液中另加入2％的麥芽糖或尿素。固定時間12-24h或更長。(三)離析液1.鉻酸-硝酸離析液鉻酸為三氧化鉻的水溶液：(1)10ml鉻酸；(2)10ml濃硝酸。

將上述兩液等量混合均勻后再使用。適于對導(dǎo)管、管胞、纖維等木質(zhì)化的組織進行解離時使用。2.鹽酸-酒精固定離析液將濃鹽酸、95％酒精等量混合備用，一般用于離析根尖細(xì)胞。(四)解離液常用于根尖等細(xì)胞的涂片，它能使細(xì)胞壁中層（果膠質(zhì)）溶解，而使細(xì)胞分開。1．鹽酸酒精配方:95%酒精1份，濃鹽酸1份。二者混合即成。2．鹽酸溶液（1）1mol／L鹽酸配方：濃鹽酸（比重1.19）82.5ml用蒸餾水定容1000ml（2）0.2mol／L鹽酸配方：濃鹽酸（比重1.19）16.5ml用蒸餾水定容1000m1鹽酸水解時間對染色效果影響很大，水解時間短，易著色但較難壓片；水解時間長，染色慢而色淡；超過20min或水解溫度過高，往往染色極淡，或染不上色。各種材料最合適的時間有差別，一般來說，大染色體材料水解時間可較長，小染色體