第八章疾病與人類健康(基因治療)

概念美國的聯(lián)邦食品與藥品管理局(FDA)于1993年給出的定義是:“基于修飾活細(xì)胞遺傳物質(zhì)而進行的醫(yī)學(xué)干預(yù)。細(xì)胞可以體外修飾,隨后再注入患者體內(nèi)；或?qū)⒒蛑委煯a(chǎn)品直接注入患者體內(nèi),使細(xì)胞內(nèi)發(fā)生遺傳學(xué)改變。這種遺傳學(xué)操縱的目的：預(yù)防、治療、治愈、診斷或緩解人類疾病”第一頁，共30頁。1、體細(xì)胞基因治療(somaticgenetherapy)治療基因轉(zhuǎn)移到體細(xì)胞內(nèi)使之表達基因產(chǎn)物,以達到治療目的；只影響受試者本人,而與后代無關(guān)。2、生殖細(xì)胞基因治療(germlinegenetherapy)

將治療基因轉(zhuǎn)移到患者的生殖細(xì)胞或早期胚胎內(nèi)的一種基因療法；永久地改變后代的遺傳組成,其目的是要預(yù)防后代患特定的遺傳疾病。第二頁，共30頁。生殖細(xì)胞基因治療是體細(xì)胞基因治療的延伸與擴展；各國均禁止將生殖細(xì)胞基因治療用于臨床；我國于1993年制定了《人的體細(xì)胞治療和基因治療臨床研究質(zhì)控要點》，明確規(guī)定僅能進行體細(xì)胞基因治療。第三頁，共30頁。特點

技術(shù)路線的多樣性；學(xué)科的交叉性；高風(fēng)險性；高度的靶向性。第四頁，共30頁?；蛑委煱l(fā)展經(jīng)歷的3個階段第一階段：70年代－80末，準(zhǔn)備時期又被稱為“禁錮時期”第二階段：1989－1995年，狂熱時期FDA于1989年批準(zhǔn)基因治療正式臨床試驗第三階段：1996－現(xiàn)在，理性時期目前中國有“B型血友病治療”、“腦瘤自殺基因治療”和“Ad－P53”已通過國家藥審進入臨床試用第五頁，共30頁?；蛑委煹?Y原則安全性(safety)有效性(efficacy)穩(wěn)定性(stability)第六頁，共30頁。倫理原則1、最后選擇原則某種疾病在所有的療法均無效或微效時。2、安全原則安全不僅僅針對個體，更重要的是針對人類。3、知情同意原則基因治療尚處于實驗階段，必須讓患者認(rèn)識到基因治療可能的危害4、公正原則目前，基因治療只能用于治病救人5、保密原則患者的遺傳信息，尤其是基因缺陷不泄露給外界第七頁，共30頁?；蛑委熤写嬖诘募夹g(shù)難點①突變基因定位與定點修復(fù)技術(shù)未解決,不能去除或糾正異常基因。②目前的基因?qū)胂到y(tǒng)尚不成熟,存在結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定、影響基因組的功能以及治療基因難以到達靶細(xì)胞等隱患；③轉(zhuǎn)導(dǎo)的外源性基因在細(xì)胞內(nèi)表達難以控制,有一定的隨機性，有激活致癌基因或產(chǎn)生野生型病毒的潛在危害；④無法保障干預(yù)生殖細(xì)胞基因而不對后代產(chǎn)生醫(yī)源性的傷害。第八頁，共30頁。常用病毒載體系統(tǒng)反轉(zhuǎn)錄病毒腺病毒腺相關(guān)病毒單純皰疹病毒第九頁，共30頁。（1）反轉(zhuǎn)錄病毒載體RNA病毒,基因組大小在8～11kb之間；以基因組RNA為模板反轉(zhuǎn)錄出雙鏈DNA；雙鏈DNA能夠隨機整合到寄主細(xì)胞的染色體上,隨著寄主細(xì)胞的復(fù)制而復(fù)制。第十頁，共30頁。1981年，Wei等構(gòu)建了第1個反轉(zhuǎn)錄病毒載體；臨床上應(yīng)用最多的以小鼠白血病病毒為基本骨架構(gòu)建的反轉(zhuǎn)錄病毒載體。第十一頁，共30頁。優(yōu)點:宿主細(xì)胞廣泛,能夠感染不同生物種類的多種類型細(xì)胞;能高效的感染分裂細(xì)胞,感染率高達100%;能使外源基因整合到宿主細(xì)胞染色體上。不足之處：1)不能感染非分裂的細(xì)胞;2)可能產(chǎn)生具有復(fù)制能力的病毒;3)由于是隨機整合,可能引起“插入誘變”;4)包裝外源DNA能力有限,小于8kb;5)要求靶細(xì)胞表面要具有反轉(zhuǎn)錄病毒的相應(yīng)受體。第十二頁，共30頁。新進展1)慢病毒載體的研究和應(yīng)用（HIV-1)基因組中存在核定位信號序列,它能夠有效感染并整合到非分裂細(xì)胞和最終分化的細(xì)胞(除G0期)2)人泡沫病毒目前為止，尚未發(fā)現(xiàn)有疾病與人泡沫病毒相關(guān)第十三頁，共30頁。2）腺病毒載體線性雙鏈的DNA病毒,基因組為36kb；不整合到宿主細(xì)胞染色體上,而是以染色體外成分存在；上皮細(xì)胞、角膜和消化道上皮細(xì)胞具有天然的嗜性；與臨床疾病相關(guān)的腺病毒通常較溫和,很少危及生命。第十四頁，共30頁?；蚪M結(jié)構(gòu)優(yōu)點缺點第一代1.缺失E1/或和E3區(qū)，以便插入外源基因；2.克隆最大容量8.5kb；3.E1或/和E3區(qū)由輔助293細(xì)胞提供。1.產(chǎn)生野生型病毒率低；2.避免了E1對細(xì)胞的轉(zhuǎn)化作用；3.比較安全。1.重組病毒效率低；2.目的基因表達快速衰退；3.產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，低水平病毒蛋白表達誘發(fā)宿主免疫反應(yīng)。第二代1.缺失E1-E4；2.改造了293細(xì)胞，以包裝改進后重組病毒。1.載體容量↑（11kb）；2.細(xì)胞毒性、免疫原性↓1.未延長目的基因表達時間2.病毒滴度僅為第一代1/10-1/100。第三代刪除病毒全部E、L基因，只保留ITR和包裝信號，又稱微小Ad（MiniAd）。1.載體容量↑↑（28kb）；2.目的基因表達時間↑↑；3.細(xì)胞毒性、免疫原性↓。293細(xì)胞是由人胚腎細(xì)胞經(jīng)Ad5DNA片段轉(zhuǎn)染后發(fā)生轉(zhuǎn)化而形成的細(xì)胞，該基因組中整合有AdE1區(qū)的片段，可持續(xù)表達E1區(qū)蛋白。第十五頁，共30頁。優(yōu)點:1)人類是腺病毒的天然宿主,所以比較安全;2)該病毒在體外穩(wěn)定,易于制備與純化;3)宿主范圍廣,既可感染分裂細(xì)胞,又可感染非分裂細(xì)胞;4)可原位感染,特別是肺,可經(jīng)口服,噴霧,氣管內(nèi)滴注等多途徑進行治療;5)外源基因表達水平較高。第十六頁，共30頁。不足之處:1)它幾乎可以感染所有的細(xì)胞,因此缺乏特異性;2)不能整合到宿主染色體上,所以不能持續(xù)表達所需產(chǎn)物,表達時間短暫,需重復(fù)給予載體制劑治療;3)因可能刺激免疫反應(yīng),使反復(fù)治療的效果會逐漸降低。第十七頁，共30頁。（3）腺相關(guān)（腺伴隨)病毒載體

線性單鏈的DNA病毒,基因組在4.6kb;繁殖依賴于輔助病毒-腺病毒和皰疹病毒。生活周期有兩個不同的胞內(nèi)期:1)缺乏輔助病毒時,腺相關(guān)病毒感染宿主細(xì)胞,其基因組會整合到宿主細(xì)胞染色體上,形成潛伏感染狀態(tài);2)當(dāng)有輔助病毒感染同一個細(xì)胞時,腺相關(guān)病毒基因組DNA就會復(fù)制。第十八頁，共30頁。優(yōu)點:目前尚未發(fā)現(xiàn)該病毒在人體中致病,所以比較安全;感染宿主細(xì)胞廣泛,包括非分裂細(xì)胞和分裂細(xì)胞,特別是能夠感染神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞;能特異整合于人的第19號染色體長臂末端,減少了插入突變的可能性;外源基因表達穩(wěn)定,3個月至1.5年。第十九頁，共30頁。不足之處：難以大量生產(chǎn)復(fù)制需要輔助病毒包裝外源基因的能力有限,小于5kb臨床的應(yīng)用受到一定限制亟需建立穩(wěn)定表達rep和cap的細(xì)胞系，但rep表達的毒性可能是其困難所在第二十頁，共30頁。（4）單純皰疹病毒載體基因組長約152kb的雙鏈DNA病毒；不整合；對非分裂細(xì)胞具有天然的親和力；對神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞具有嗜向性。多用于帕金森或腦瘤等神經(jīng)性疾病的治療；用作基因轉(zhuǎn)移載體的單純皰疹病毒主要來源于I型單純皰疹病毒（HSV-1）。第二十一頁，共30頁。優(yōu)點:宿主范圍廣,包括大量哺乳動物和鳥類的分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞;載體易于操作;包裝外源基因的能力大,可插入長達50kb的外源基因。不足之處：野生型單純皰疹病毒對人類具有明顯的致病性,能夠從潛伏狀態(tài)激活,所以目前僅限于某些惡性腫瘤的臨床治療試驗。第二十二頁，共30頁。桿狀病毒侵入哺乳動物細(xì)胞:內(nèi)吞HBV肝靶向性基因治療載體用外源目的基因取代一個或多個HBV編碼基因:S/C/P/X;復(fù)制需要通過輔助病毒（包裝信號ε缺失）基因組的反式互補來實現(xiàn)。第二十三頁，共30頁。血友病的基因治療血友病B:人凝血因子IX:

Ad-FIX；AAV－h(huán)FIX；反轉(zhuǎn)錄病毒臨床試驗(復(fù)旦薛京倫）血友病A：人凝血因子VIII

?地中海貧血的基因治療?珠蛋白基因及其調(diào)控序列突變造血干細(xì)胞第二十四頁，共30頁。帕金森?。≒D）的基因治療酪氨酸羥化酶基因:L-酪氨酸轉(zhuǎn)換成L-dopa神經(jīng)營養(yǎng)因子基因早老性癡呆（AD)的基因治療?淀粉樣蛋白

?-amiloidprecursorprotein

APP神經(jīng)營養(yǎng)因子基因第二十五頁，共30頁。腫瘤基因治療的基本策略

1.癌基因表達的反義抑制策略

利用反義DNA、反義RNA、核酶(Ribozyme)技術(shù)，抑制癌基因的表達，可以抑制腫瘤。c-myc的反義核酸在淋巴瘤細(xì)胞中有抗增殖活性。以反向K-ras質(zhì)粒轉(zhuǎn)染小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株，抑制了K-ras的表達，并且抑制腫瘤在裸鼠體內(nèi)的生長,采用ras癌基因特異的核酶，用逆轉(zhuǎn)錄病毒導(dǎo)入膀胱癌EJ細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的致癌性和轉(zhuǎn)移性均降低了50％。第二十六頁，共30頁。腫瘤基因治療的基本策略

2抑癌基因克隆和表達策略

在目前已分離克隆的抑癌基因中，對RB、p53、nm23等在腫瘤治療方面的作用研究最為深入?；謴?fù)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、小細(xì)胞肺癌等腫瘤細(xì)胞中RB基因的表達對于這類腫瘤的治療具有一定的臨床價值；以野生型p53基因替換腫瘤細(xì)胞中突變的p53基因是p53基因治療最基本的應(yīng)用策略；恢復(fù)腫瘤細(xì)胞中nm23基因的表達對于防止腫瘤的轉(zhuǎn)移具有積極意義。第二十七頁，共30頁。腫瘤基因治療的基本策略

3.宿主免疫功能增強策略向腫瘤細(xì)胞和腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞(TIL)中導(dǎo)入細(xì)胞因子基因或腫瘤相關(guān)性抗原基因、B7共刺激分子基因等，可以增強宿主抗腫瘤免疫功能。目前用于臨床的細(xì)胞因子有IL-2、TNF-、IFN-、GM-CSF等。腫瘤細(xì)胞逃逸機體免疫反應(yīng)的原因之一是許多腫瘤細(xì)胞缺乏B7共刺激分子，將B7基因?qū)肽[瘤細(xì)胞中，再還輸小鼠體內(nèi)。無B7的小鼠1月后半數(shù)致死，導(dǎo)入B7的小鼠全部度過3月的實驗期。第二十八頁，共30頁。腫瘤基因治療的基本策略

4.腫瘤治療藥物前體的轉(zhuǎn)換策略

又稱自殺基因(suicidegene)療法。將自殺基因?qū)爰?xì)胞中，這些基因的產(chǎn)物可將無害的藥物前體轉(zhuǎn)變?yōu)橛卸镜漠a(chǎn)物，從而將細(xì)胞殺死。目前常用的自殺基因有單純皰疹病毒的胸苷激酶基因(HSVTK)和細(xì)菌的胞嘧啶脫氨酶基因(CD)。TK能將無毒的GCV轉(zhuǎn)化為有毒的三磷酸GCV，CD能催化5-氟胞嘧啶轉(zhuǎn)化為5－氟尿嘧啶。這些轉(zhuǎn)化產(chǎn)物