細(xì)菌的培養(yǎng)方法

實(shí)驗(yàn)三、細(xì)菌接種及分離培養(yǎng)；自然界及正常人體的細(xì)菌檢查

昆明學(xué)院醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室

當(dāng)前1頁(yè)，總共31頁(yè)。教學(xué)目標(biāo)1.熟悉常用的純種細(xì)菌的接種方法。2.掌握標(biāo)本中細(xì)菌的分離培養(yǎng)技術(shù)。3.了解細(xì)菌廣泛分布于自然界及正常人體，樹(shù)立“有菌觀念”。4.深刻認(rèn)識(shí)“無(wú)菌操作”對(duì)于微生物實(shí)驗(yàn)及醫(yī)藥學(xué)實(shí)踐的重要性。5．進(jìn)一步理解“正常菌群”的概念。當(dāng)前2頁(yè)，總共31頁(yè)。實(shí)驗(yàn)主要內(nèi)容1．錄相：細(xì)菌的培養(yǎng)方法2．操作：⑴空氣中細(xì)菌的檢查（沉降法血平板1塊/6人）⑵呼吸道細(xì)菌的檢查（咽拭子法培養(yǎng)血平板1塊/3人）⑶隨身物品的細(xì)菌檢查（手指消毒前后普通平板1塊/3人）⑷細(xì)菌的接種法（液體、半固體、固體1套/3人）材料：⑴大腸埃希菌培養(yǎng)物（1支/6人）⑵碘酒、75%酒精、棉簽等（1套/6人）當(dāng)前3頁(yè)，總共31頁(yè)。培養(yǎng)基的制備一、培養(yǎng)基（culturemedium）由人工方法配制而成的，專供微生物生長(zhǎng)繁殖使用的混合營(yíng)養(yǎng)物制品。當(dāng)前4頁(yè)，總共31頁(yè)。（一）培養(yǎng)基的類型及應(yīng)用1、按用途劃分1）基礎(chǔ)培養(yǎng)基

能滿足一般細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖的營(yíng)養(yǎng)需要，如肉湯（包括牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉等）。2）營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基

在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入葡萄糖、血液、血清、酵母浸膏等。當(dāng)前5頁(yè)，總共31頁(yè)。3）鑒別培養(yǎng)基4）選擇培養(yǎng)基

用于鑒別不同類型細(xì)菌的培養(yǎng)基。特定的化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生明顯的特征性變化，根據(jù)這種特征性變化，可將該種細(xì)菌與其他細(xì)菌區(qū)分開(kāi)來(lái)。

將某種細(xì)菌從混雜的細(xì)菌群體中分離出來(lái)的培養(yǎng)基。根據(jù)不同種類細(xì)菌的特殊營(yíng)養(yǎng)需求，在培養(yǎng)基中加入相應(yīng)的特殊營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)；或者加入某些化學(xué)物質(zhì)，抑制不需要的細(xì)菌生長(zhǎng)，有利于所需細(xì)菌的生長(zhǎng)。5）厭氧培養(yǎng)基當(dāng)前6頁(yè)，總共31頁(yè)。SS瓊脂培養(yǎng)基（Salmonella-Shigellaagar）

大腸埃希菌沙門菌志賀菌當(dāng)前7頁(yè)，總共31頁(yè)。2、根據(jù)物理狀態(tài)劃分

液體培養(yǎng)基：增菌固體培養(yǎng)基（瓊脂濃度為2－3％）：增菌，分離培養(yǎng)半固體培養(yǎng)基（瓊脂濃度為0.2-0.5%）：動(dòng)力檢查，保種液體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基半固體培養(yǎng)基當(dāng)前8頁(yè)，總共31頁(yè)。（二）細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖的條件1．充足的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)；2．適宜的溫度；3．合適的酸堿度（ph）；4．必要的氣體環(huán)境；當(dāng)前9頁(yè)，總共31頁(yè)。溫度嗜冷菌

(10-15℃)嗜溫菌（30-40℃）：絕大多數(shù)病原菌嗜熱菌（50-85℃）當(dāng)前10頁(yè)，總共31頁(yè)。

pH嗜中性菌（5to8）嗜酸性菌（below5.5）嗜堿性菌（above8.5）多數(shù)病原菌最適酸堿度為PH7.2-7.6霍亂弧菌耐堿PH8.4-9.2結(jié)核分支桿菌耐酸PH6.5-6.8當(dāng)前11頁(yè)，總共31頁(yè)。氣體環(huán)境氧和二氧化碳按細(xì)菌對(duì)氧的需求可分為四種類型：（1）專性需氧菌（obligateaerobe,O2>20%）（2）兼性厭氧菌（facultativeanaerobe,O2:Yesorno）（3）微需氧菌（microaerophilicbacterium,O2:2~10%）（4）專性厭氧菌（obligateanaerobe,O2:No）某些細(xì)菌如奈瑟菌在培養(yǎng)時(shí)需要提供5-10%二氧化碳；當(dāng)前12頁(yè)，總共31頁(yè)。二、細(xì)菌在培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)現(xiàn)象1．固體培養(yǎng)單個(gè)微生物在適宜的固體培養(yǎng)基表面生長(zhǎng)、繁殖到一定程度，可以形成肉眼可見(jiàn)的有一定形態(tài)結(jié)構(gòu)的細(xì)菌集團(tuán)，稱為菌落（colony）。菌落特征是鑒別細(xì)菌的重要依據(jù)之一。當(dāng)前13頁(yè)，總共31頁(yè)。2液體培養(yǎng)表面生長(zhǎng)

沉淀生長(zhǎng)

混濁生長(zhǎng)

當(dāng)前14頁(yè)，總共31頁(yè)。3半固體培養(yǎng)常用于檢查細(xì)菌動(dòng)力無(wú)動(dòng)力有動(dòng)力當(dāng)前15頁(yè)，總共31頁(yè)。本次試驗(yàn)的操作：空氣中細(xì)菌的檢查（沉降法，血平板）呼吸道細(xì)菌的檢查（咽拭子或咳碟培養(yǎng)，血平板）隨身物品細(xì)菌檢查（普通平板）細(xì)菌的接種法：液體、半固體、固體培養(yǎng)基當(dāng)前16頁(yè)，總共31頁(yè)?？諝庵屑?xì)菌的檢查檢查空氣中細(xì)菌的方法很多，沉降法是其中的一種。它是利用含有細(xì)菌的塵?；驓馊苣z粒因重力作用而自然下降于培養(yǎng)基表面，通過(guò)細(xì)菌培養(yǎng)，計(jì)數(shù)其菌落數(shù)，而粗略地進(jìn)行評(píng)估。當(dāng)前17頁(yè)，總共31頁(yè)。

操作：將血平板打開(kāi)蓋，放到教室的四個(gè)角上，靜止15分鐘后，合上蓋后送37℃孵箱培養(yǎng)。沉降法簡(jiǎn)單易行，缺點(diǎn)是不夠準(zhǔn)確。但它客觀地反映了空氣污染的程度和衛(wèi)生通風(fēng)狀況，對(duì)手術(shù)室、食品業(yè)等有重要的參考意義，是判斷空氣污染的指標(biāo)之一。當(dāng)前18頁(yè)，總共31頁(yè)。

據(jù)推算，每100cm2培養(yǎng)基在空氣中暴露5分鐘，其表面接受自然沉降的細(xì)菌數(shù)約相當(dāng)于10升空氣中所含的細(xì)菌量。

所以：

每m3空氣中活菌數(shù)=（100cm2培養(yǎng)基上菌落平均數(shù)/30）x1000。當(dāng)前19頁(yè)，總共31頁(yè)。

鼻咽喉及口腔是人體與外界相通的腔道，常常有不同種類的細(xì)菌存在。這些細(xì)菌常是條件致病菌，在一般情況下并不致病，但是當(dāng)機(jī)體的抵抗下降時(shí)，可引起疾病而對(duì)機(jī)體造成危害。由于寄居人體的關(guān)系，這些細(xì)菌對(duì)營(yíng)養(yǎng)的要求較高，所以常用含血的培養(yǎng)基進(jìn)行分離。

鼻咽喉及口腔中細(xì)菌的檢查

—咳碟試驗(yàn)當(dāng)前20頁(yè)，總共31頁(yè)。方法：（1塊／3人）打開(kāi)血平板，將平板置于口腔前約15cm處，對(duì)準(zhǔn)培養(yǎng)基表面用力咳嗽3～4次，然后蓋好平板蓋，放置于37℃孵箱內(nèi)培養(yǎng)24小時(shí)觀察結(jié)果。當(dāng)前21頁(yè)，總共31頁(yè)。在人體的皮膚表面有多種細(xì)菌存在，用水洗手或用肥皂洗手，可以除去皮膚上的污垢和灰塵，從而減少手上細(xì)菌的數(shù)量，但并不能有效的殺死細(xì)菌。而日常醫(yī)療、試驗(yàn)工作中常用的化學(xué)消毒劑如碘酒、酒精等有很好的殺菌作用，它們不僅對(duì)細(xì)菌的繁殖體，對(duì)芽孢也有一定的殺滅效果，所以在臨床醫(yī)療中廣泛應(yīng)用。正常人體皮膚及隨身物品的細(xì)菌檢查當(dāng)前22頁(yè)，總共31頁(yè)。1、將平板底部用mark筆劃線分成均勻的8個(gè)區(qū)，分別標(biāo)記為①②③④⑤⑥⑦⑧。2、用右手的食指在①區(qū)上輕輕按一下，然后用肥皂在流水下將手洗干凈，用無(wú)菌棉簽拭干右手食指皮膚上的水，再輕輕在②區(qū)培養(yǎng)基上按一下。3、用左手食指輕輕在③區(qū)按一下，然后用棉簽蘸碘酒消毒左手食指皮膚，待干后輕輕在④區(qū)按一下。4、任取隨身物品在⑤⑥⑦⑧區(qū)各按一下。5、蓋好平板，送37℃孵箱培育24小時(shí)后觀察結(jié)果。操作與注意事項(xiàng)（1塊／3人）當(dāng)前23頁(yè)，總共31頁(yè)。注意事項(xiàng)：用手指或物品按培養(yǎng)基時(shí)，接觸面可稍微大一些，但切勿用力，否則，易將培養(yǎng)基壓破，影響結(jié)果的判斷。如果不慎壓破，可在臨近未破處重新按一下。當(dāng)前24頁(yè)，總共31頁(yè)。三線法分離接種當(dāng)前25頁(yè)，總共31頁(yè)。

細(xì)菌的分離接種瓊脂平板劃線分離接種法（固體培養(yǎng)基）三線法穿刺接種法（半固體培養(yǎng)基）液體培養(yǎng)基接種法

接種時(shí)要注意無(wú)菌操作，避免污染，防止細(xì)菌外溢污染環(huán)境。