NK-104對人肝癌細胞凋亡及半胱氨酸蛋白酶3活性的影響

NK-104對人肝癌細胞凋亡及半胱氨酸蛋白酶 3活性的影響【摘要】 研究日本新近研制的第三代 3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶 A（3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-CoA ，HMG-CoA）還原酶抑制劑匹伐他汀（pitavastatin，NK-104）對人肝癌細胞凋亡及半胱氨酸蛋白酶3（caspase-3）活性的影響。方法:采用細胞培養(yǎng)技術(shù)，以肝癌細胞系HepG2為靶細胞，以不同濃度的藥物處理細胞48h后，利用WST-8法測定NK-104對細胞增殖的影響;利用熒光染料Hoechst33258染色，熒光顯微鏡觀察細胞核碎片;以流式細胞儀分析細胞周期的變化;采用半胱氨酸蛋白酶 3比色法檢測caspase-3活性。結(jié)果:NK-104（10μmol/L）對HepG2細胞有明顯抑制作用，可誘導HepG2細胞凋亡，并能增強caspase-3基因的活性。結(jié)論:NK-104能夠誘導HepG2細胞凋亡，其機制與caspase-3依賴性凋亡調(diào)節(jié)信號通路有關(guān)?！娟P(guān)鍵詞】 肝癌3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶 A（3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-CoA ，HMG-CoA）還原酶抑制劑，統(tǒng)稱為抑制素，是重要的脂類合成抑制劑， 主要在人體肝臟中代謝，臨床上廣泛應(yīng)用于治療高脂血癥［ 1］。最近研究發(fā)現(xiàn)，HMG-CoA還原酶抑制劑具有生物學多效性，與降血脂無關(guān)。有報道其在體外具有抗癌作用［ 2］、體內(nèi)與5氟尿嘧啶（fluorouracil ，5-Fu）共同作用能夠延長晚期肝癌患者的生存期［3］。匹伐他?。╬itavastatin，NK-104）是日本新近研制的第三代高效HMG-CoA還原酶抑制劑［4］。在血管內(nèi)皮細胞系NK-104通過磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（phosphoinositide3-kinase/proteinkinaseB ，PI3K-Akt）基因激活途徑對內(nèi)皮細胞的保護作用已有報道［5］，但其在肝癌細胞系的抗癌作用尚未見報道。本文在肝癌細胞系HepG2通過2-（2-甲氧基-4-硝基苯）-3-（4-硝基苯）-5-（2，4-二硫代苯）-2H-四氮唑單鈉鹽｛［2-2-methoxy-4-nitrophe-nyl）-3-（4-nitrophenyl）-5-（2，4-disulfophenyl）-2H-tetrazolium ，monosodiumsalt］，WST-8｝、熒光染料Hoechst33258染色、流式細胞儀和半胱氨酸蛋白酶 3比色法等檢測方法，研究 NK-104對人肝癌細胞凋亡及半胱氨酸蛋白酶 3（caspase-3）活性的影響，為NK-104在抗腫瘤中的作用機制提供實驗依據(jù)。材料和方法主要材料與儀器 NK-104，日本興和有限公司（日本名古屋）和日產(chǎn)化學工業(yè)公司（日本東京）產(chǎn)品;熒光染料Hoechst33258、甲羥戊酸（mevalonic acid，MEV）和碘化丙啶（propidiumiodide ，PI）染色液（PI100g/L，1%Triton100，9g/LNaCl），Sigma公司產(chǎn)品。流式細胞儀，20XXFCA，美國BD公司產(chǎn)品。實驗方法細胞培養(yǎng)人肝癌細胞株HepG2（美國ATCC公司產(chǎn)品）在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基、5%CO2、37℃條件下培養(yǎng)。實驗中，細胞種植于適當培養(yǎng)皿中，90%的細胞融合時，用磷酸鹽緩沖液洗凈后，加入適量含有 NK-104和MEV（1mmol/L）等藥物的培養(yǎng)液，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。WST-8方法利用WST-8試劑盒對細胞增殖進行測定。HepG2細胞（1×104個細胞/孔）接種于含100μl培養(yǎng)液的96孔培養(yǎng)板中，NK-104（～100μmol/L）治療48h后，分別加入WST-8試劑10μl（日本同仁化學研究所）培養(yǎng)2h后，選擇450nm波長，測定各孔的吸光度OD值。Hoechst33258染色細胞經(jīng)藥物刺激48h后，甲醇-冰乙酸（3∶1）細胞固定液4℃固定5min，磷酸鹽緩沖液稍洗后，點加Hoechst33258染色液，10min。用濾紙沾去多余液體，封片劑封片后熒光顯微鏡觀察細胞核碎片。流式細胞儀檢測凋亡峰 在室溫下將刺激48h后的細胞用冷磷酸鹽緩沖液洗滌2次，并在適當?shù)娜旧彌_液中吸取100μl的細胞（1×105）至試管中。加入200μlRNaseA，37℃水浴30min，再加800μlPI染色液混勻，4℃避光30min后，立即上機分析。半胱氨酸蛋白酶3比色法經(jīng)藥物治療48h后收集細胞，采用半胱氨酸蛋白酶3比色法試劑盒按照廠家說明進行測定（Medical&BiologicalLaboratoriesCo.，LTD，Japan）。統(tǒng)計學方法數(shù)據(jù)均以x±s表示，采用SPSS統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，采用t檢驗。結(jié)果NK-104對HepG2細胞增殖的抑制作用 為了確定NK-104在人肝癌細胞HepG2中的治療濃度，采用WST-8方法對細胞的增殖作用進行測定。與對照組相比，NK-104在10和100μmol/L時，對HepG2細胞生長均有明顯的抑制作用。100μmol/L時，近50%的細胞死亡（P<）。見圖1。圖1不同濃度NK-104對HepG2生長的抑制作用（略）Figure1GrowthinhibitionofHepG2cellsbyNK-104**P<，vscontrolgroup.NK-104誘導細胞凋亡的形態(tài)變化 對照組細胞界限清晰，胞漿豐富，細胞核呈彌散、均勻熒光分布，經(jīng) 10～100μmol/LNK-104處理后，HepG2發(fā)生細胞凋亡，細胞核或細胞質(zhì)內(nèi)可見濃染致密的藍色熒光顆粒及明顯核形態(tài)變化。 見圖2。NK-104對HepG2細胞周期的影響 與對照組相比，NK-104治療組可明顯誘導HepG2的細胞凋亡，出現(xiàn)相當比例的 DNA含量小于二倍體的亞 G1凋亡峰24%），不同周期細胞的比例也發(fā)生變化，與MEV共同作用后可消除NK-104的這種誘導作用。見圖3。NK-104對caspase-3活性的影響與對照組相比，NK-104可明顯誘導caspase-3活性（P< ），同樣加入MEV能夠消除NK-104的這種誘導作用。見圖4。圖2NK-104處理48h后HepG2細胞核的形態(tài)變化（Hoechst33258染色，×400）（略）Figure2NuclearmorphologyoftheHepG2cellstreatedbyNK-104for48hours（Hoeschst33258staining ，×400）A:Control ，normalnuclearstructure;B:NK-10410 μmol/L;C:NK-104100μmol/L; ●:Cytoplasmicchange; ■:Nuclearfragmentation.圖3NK-104治療HepG2細胞后細胞周期分布變化（略）Figure3CellcycleanalysisofHepG2cellstreatedbyNK-104（PercentageofSubG1cells ）**P<，vscontrolgroup.A:Control;B:NK-10410

μmol/L;C:NK-104+MEV.圖4NK-104對caspase-3活性的影響（略）Figure4NK-104inducedactivityofcaspase-3**P<，vscontrolgroup.TheHepG2cellswereexposedtoNK-104（10μmol/L）alone，orNK-104（10μmol/L）plusMEV（1mmol/L）for48hours.Thecaspase-3activitywasmeasuredwithacolorimetricproteaseassay.討論目前認為惡性腫瘤是一種多基因異常的疾病，其發(fā)生的分子基礎(chǔ)是原癌基因的激活或抑癌基因的突變失活或缺失， 導致某些細胞分化不良、凋亡受阻和增殖失控而形成腫瘤。原發(fā)性肝癌約 55%發(fā)生在中國［6］。肝癌細胞的凋亡在肝癌的發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)歸 及治療等方面均有重要的意義。 HMG-CoA還原酶抑制劑，是重要的脂類合成抑制劑，臨床上廣泛應(yīng)用于治療高脂血癥。最近研究表明，HMG-CoA還原酶抑制劑具有抗感染、降低炎性細胞因子水平及抗癌等生物學多效性作用。Otsuki等［7］報道1～30μmol/L的西米伐他?。╯imvastatin）具有預防癌癥的作用。Sutter等［8］研究認為1～10μmol/L的弗魯伐他汀（fluvastatin）通過誘導Huh7細胞凋亡而抑制肝癌細胞的增殖。Denoyelle等［9］認為25μg/L的賽里伐他汀（cerivas-tatin）對MDA-MB-231人乳腺癌細胞通過抑制細胞核因子κB活性起到重要的抗轉(zhuǎn)移作用。HepG2細胞具有典型肝癌細胞的一系列惡性特征，是研究和評價防治肝癌藥物的較理想的細胞模型。NK-104是日本新近研制的第三代HMG-CoA還原酶抑制劑，具有副作用小、高效和強力的藥代動力學特點［4］。我們的研究結(jié)果表明，NK-104對HepG2細胞增殖有明顯抑制作用，其最大抑制率可達50%左右，使HepG2細胞呈現(xiàn)典型的凋亡形態(tài)學特征，核質(zhì)濃集，有凋亡小體。提示NK-104能在一定程度上抑制肝癌細胞的增殖。流式細胞術(shù)具有檢測的細胞數(shù)量大、反映群體細胞的凋亡狀態(tài)比較準確等優(yōu)點［10］。NK-104作用于HepG2細胞后，通過流式細胞儀分析，與對照組相比，可見凋亡細胞出現(xiàn)在直方圖亞二倍體峰位置，并與細胞主峰 G0/G1分界清楚，可定量凋亡占整個細胞群百分比。本研究結(jié)果表明，NK-104可明顯誘導HepG2細胞凋亡。細胞凋亡的核心成分是半胱氨酸蛋白酶家族（caspase），其中研究最多，功能相對較明確的為caspase-3。caspase-3是哺乳動物細胞凋亡的關(guān)鍵蛋白酶之一，為凋亡的效應(yīng)分子，被稱為凋亡的“執(zhí)行者”［11～13］。激活的caspase-3可裂解相應(yīng)的胞核內(nèi)底物DNA修復酶（polyADP-ribosepolymerase，PARP），使PARP失去對DNA的修復功能，導致細胞轉(zhuǎn)向凋亡［14］。本研究表明，10μmol/LNK-104能夠增強caspase-3的活性，加入MEV能夠消除NK-104的這種誘導作用。這一研究結(jié)果表明，NK-104誘導HepG2細胞凋亡與激活caspase-3依賴性凋亡調(diào)節(jié)信號通路有關(guān)?！緟⒖嘉墨I】1Goldstein JL，BrownMS.Regulation ofthemevalonatepathway.Nature.1990;343:425-430.2BellostS，PaolettiR.CorsiniA.Safeofstatins:focusonclinicalpharmacokineticsanddruginteractions.Circulation.20XX;109Suppl）Ⅲ:50-57.3ChanKK，OzaAM，Siu LL.Thestatins asanticancer agents. ClinCancerRes.20XX;9:10-19.4KajinamiK，TakekoshiN，SaitoY.Pitavastatin:effica-cyandsafetyprofilesofanovelsyntheticHMG-CoAreductaseinhibitor.CardiovascDrugRev.20XX ，21（3）:199-215.5WangJ，TokoroT，MatsuiK，etal.PitavastatinatlowdoseactivatesendothelialnitricoxidesynthasethroughPI3K-AkTpathwayinendothelialcells.LifeSci.20XX;76 （19）:2257-2268.6ChenJG，SongXM.Anevaluation onincident casesofliver cancerinChina.ZhongguoZhongLiu. 20XX;14（1）:28-31.ChinesewithabstractinEnglish. 陳建國， 宋新明. 中國肝癌發(fā)病水平的估算及分析 . 中國腫瘤.20XX;14（1）:28-31.7OtsukiT，SakaguchiH，HatayamaT，et al. Effects ofanHMG-CoAreductaseinhibitor ，simvastatin ，onhumanmyelomacells.OncolRep.20XX;11:1053-1058.8SutterAP ，MasserK，HopfinerM ，etal.Cellcyclearrestandapoptosisinductioninhepatocellularcarcino-macellsbyHMG-CoAreductaseinhibitors.Synergisticantiproliferativeactionwithligandsoftheperipheralbenzodiazepinereceptor.JHepatol.20XX;43 （5）:808-816.9DenoyelleC，VasseM，Korner M，et al. Cerivastatin ，aninhibitorofHMG-CoAreductase，inhibitsthesigna-lingpathwaysinvolvedintheinvasivenessandmetastaticpropertiesofhighlyinvasivebreastcancercelllines:aninvitrostudy.Carcinogenesis.20XX;22 （8）:11-1148.10Nilsson C，KagedalK，JohanssonU，etal. Analysis ofcytosolicandlysosomal pHinapoptotic cells byflow cytometry. MethodsCell Sci.20XX;25:185-194.11ChenYC，ShenSC，LeeWR，etal.EmodininducesapoptosisinhumanpromyeloleukemicHL-60cellsacpaniedbyactivationofcaspase3cascadebutinde-pendentofreactiveoxygenspeciesproduction.BiochemPharmacol.20XX;64（12）:1713-1724.12ZhouXL，ZhengSS