微生物知識(shí)概況與污染菌庫(kù)建立(陳瑩)

主要內(nèi)容微生物知識(shí)概況什么是微生物？微生物學(xué)與人類的關(guān)系微生物的特點(diǎn)污染菌庫(kù)的建立收集→分離純化→保藏→鑒定→數(shù)據(jù)處理與應(yīng)用2/92第一頁(yè)，共91頁(yè)。內(nèi)容一：微生物知識(shí)概況一、什么是微生物？微生物的定義微生物的種類微生物的形態(tài)微生物的特點(diǎn)二、微生物學(xué)與人類的關(guān)系3/9214第二頁(yè)，共91頁(yè)。一、什么是微生物？

1、微生物的定義一切肉眼看不見或看不清的微小生物的總稱。它們都是一些體積微小，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的低等生物。4/92第三頁(yè)，共91頁(yè)。2、微生物的種類

按其結(jié)構(gòu)、化學(xué)組成及分化程度可分為:★原核類:僅有原始核質(zhì)，無核仁或核膜，細(xì)胞器很不完善。★真核類:細(xì)胞核的分化程度較高，有核膜、核仁和染色體，細(xì)胞器完整?！锓羌?xì)胞類:體積微小，能通過除菌過濾器。5/92第四頁(yè)，共91頁(yè)。2、微生物的種類支原體、衣原體、立克次氏體6/92第五頁(yè)，共91頁(yè)。3、微生物的形態(tài)3.1微生物的菌落形態(tài)7/9214第六頁(yè)，共91頁(yè)。四大類微生物菌落比較表類別細(xì)菌放線菌酵母菌霉菌培養(yǎng)基牛肉膏高氏一號(hào)馬鈴薯馬鈴薯菌落形狀小點(diǎn)狀，多為圓形，個(gè)別呈根狀，輻射狀圓形輻射狀多為原形疏松的絨毛狀、絮狀、蜘蛛網(wǎng)狀，有的無固定大小大小一般較小較小比細(xì)菌大而厚大顏色多樣（乳白、灰白、灰、紅、熒光等）正反面顏色相同多樣（灰白、白、紅、粉紅、藍(lán)、紫、橙等）正反面顏色不同多為乳白色多樣（白，灰藍(lán)、綠黑、粉紅等）正反面一般顏色不同表面狀態(tài)光滑或粗糙，濕潤(rùn)或干燥，較粘初期似細(xì)菌菌落，晚期為粉狀干燥表面濕潤(rùn)粘稠絨毛狀，粉狀，棉絮狀，蜘蛛網(wǎng)狀，菌絲疏松生長(zhǎng)速度一般較快慢較快快與基質(zhì)結(jié)合程度不牢牢固，不易挑取不牢較牢生長(zhǎng)范圍有限有限有限多為無限氣味往往有臭味有泥腥味常有酒香味往往有霉味7/92第七頁(yè)，共91頁(yè)。把細(xì)胞個(gè)體形態(tài)與菌落特征一塊比較：四大類微生物的比較89/92第八頁(yè)，共91頁(yè)。3.2

微生物的顯微形態(tài)類別形態(tài)舉例細(xì)菌球菌直徑為0.8-1.2μm，呈球形、類球形。雙球菌、鏈球菌、四聯(lián)球菌、八疊球菌、葡萄球菌等。桿菌一般長(zhǎng)2-5μm，寬0.5-1.0μm。各種桿菌的長(zhǎng)短寬窄不一。炭疽桿菌、結(jié)核桿菌、大腸桿菌等。螺形菌菌體呈彎曲狀，弧菌有數(shù)個(gè)彎曲，呈香蕉狀，螺菌有數(shù)個(gè)彎曲?；【吐菥Ｕ婢湍妇笮”燃?xì)菌大得多，為葡萄球菌的數(shù)倍至幾十倍，小的肉眼看不見，大的如木耳、蘑菇、靈芝。釀酒酵母菌、路德類酵母菌等。霉菌青霉菌、曲霉菌等。常見微生物顯微結(jié)構(gòu)比較表9/92第九頁(yè)，共91頁(yè)。葡萄球菌酵母菌(芽痕)棒狀桿菌大腸桿菌弧狀菌鏈球菌11/92第十頁(yè)，共91頁(yè)。青霉菌犁頭霉12/92第十一頁(yè)，共91頁(yè)。沙門菌銅綠假單孢菌生孢梭菌枯草芽孢桿菌13/92第十二頁(yè)，共91頁(yè)。4、微生物的特點(diǎn)個(gè)體小,面積大：小于0.1mm。肉眼不可見。分布廣,種類多（10萬多種）

：自然界中到處都有，如水、空氣、土壤等,土壤中的數(shù)量最多。代謝強(qiáng)，轉(zhuǎn)化快：發(fā)酵乳糖的細(xì)菌在1小時(shí)內(nèi)可分解其自重1000～10000倍的乳糖；產(chǎn)朊假絲酵母合成蛋白質(zhì)的能力比食用公牛強(qiáng)10萬倍。生長(zhǎng)旺，繁殖快：微生物有驚人的繁殖速度，大多數(shù)微生物幾十分鐘內(nèi)就可以繁殖一代。適應(yīng)性強(qiáng)，易變異（耐藥性產(chǎn)生的原因）14/92第十三頁(yè)，共91頁(yè)。二、微生物與人類的關(guān)系微生物無處不在，我們無時(shí)不生活在“微生物的海洋”中。15/92第十四頁(yè)，共91頁(yè)。二、微生物與人類的關(guān)系微生物在哪里?16/92第十五頁(yè)，共91頁(yè)。17/92第十六頁(yè)，共91頁(yè)。細(xì)菌數(shù)億/g土壤，土壤中的細(xì)菌總重量估計(jì)為：10034×1012

噸；每張紙幣帶細(xì)菌：900萬人體體表及體內(nèi)存在大量的微生物：皮膚表面：平均10萬個(gè)細(xì)菌/平方厘米；口腔：細(xì)菌種類超過500種；腸道：微生物總量達(dá)100萬億，糞便干重的1/3是細(xì)菌，每克糞便的細(xì)菌總數(shù)為：1000億個(gè)；每個(gè)噴嚏的飛沫含4500-150000個(gè)細(xì)菌，重感冒患者為8500萬。18/92第十七頁(yè)，共91頁(yè)。時(shí)時(shí)刻刻與微生物“共舞”

是禍？是

福？微生物既是人類的敵人，也是人類的朋友！1819/92第十八頁(yè)，共91頁(yè)。

微生物是自然界物質(zhì)循環(huán)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)；微生物是人類的朋友！

體內(nèi)的正常菌群是人及動(dòng)物健康的基本保證；幫助消化、提供必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、組成生理屏障

微生物可以為我們提供很多有用的物質(zhì)；醋、酶、各種藥物、疫苗、面包、奶酪、啤酒、醬油等

基因工程為代表的現(xiàn)代生物技術(shù)；1920/92第十九頁(yè)，共91頁(yè)。微生物是人類的敵人！鼠疫天花艾滋病狂犬病埃博拉病毒……天花病毒康熙愛德華·詹納2021/92第二十頁(yè)，共91頁(yè)。二、微生物與人類的關(guān)系可以說，微生物與人類關(guān)系的重要性，怎么強(qiáng)調(diào)都不過分.微生物是一把十分鋒利的雙刃劍，它們?cè)诮o人類帶來巨大利益的同時(shí)也帶來“殘忍”的破壞。它給人類帶來的利益不僅是享受，而且實(shí)際上涉及到人類的生存。22/92第二十一頁(yè)，共91頁(yè)。內(nèi)容二：污染菌庫(kù)的建立污染菌庫(kù)建立的目的和應(yīng)用污染菌庫(kù)建立的步驟23/92第二十二頁(yè)，共91頁(yè)。一、污染菌庫(kù)建立的目的和應(yīng)用

目的：

應(yīng)新版GMP要求，需對(duì)環(huán)境、原輔料及不同階段產(chǎn)品監(jiān)控或檢測(cè)到的微生物進(jìn)行鑒定，并建立污染菌種庫(kù)。便于對(duì)日常監(jiān)測(cè)中出現(xiàn)異常菌株與菌種庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，查找其來源，并針對(duì)菌種特性對(duì)相應(yīng)的監(jiān)控環(huán)境采取有效措施進(jìn)行消毒。124/92第二十三頁(yè)，共91頁(yè)。目的：長(zhǎng)期有規(guī)律地對(duì)環(huán)境、檢品中的微生物進(jìn)行監(jiān)控，了解環(huán)境中的微生物污染種類和變化趨勢(shì)，并作為質(zhì)量控制文件加以保存，對(duì)企業(yè)日常生產(chǎn)質(zhì)量管理和監(jiān)管機(jī)構(gòu)的監(jiān)督檢查都是有益的補(bǔ)充。225/92第二十四頁(yè)，共91頁(yè)。應(yīng)用：對(duì)實(shí)驗(yàn)室潔凈環(huán)境、各種檢品進(jìn)行監(jiān)控，構(gòu)建環(huán)境微生物分布圖，提高檢測(cè)結(jié)果公信力1建立實(shí)驗(yàn)室環(huán)境微生物信息庫(kù)、動(dòng)態(tài)監(jiān)控環(huán)境微生物的變化、建立環(huán)境微生物污染趨勢(shì)分析圖，預(yù)測(cè)微生物污染方向，從被動(dòng)的排查污染措施上升到主動(dòng)的預(yù)防、預(yù)警。26/92第二十五頁(yè)，共91頁(yè)。應(yīng)用：2增強(qiáng)藥品中微生物檢驗(yàn)?zāi)芰?，做到?shù)據(jù)可信，國(guó)際認(rèn)可，為執(zhí)法、仲裁提供依據(jù)在嚴(yán)格依據(jù)法定方法進(jìn)行檢驗(yàn)的同時(shí)，結(jié)合微生物鑒定技術(shù)平臺(tái)，對(duì)檢驗(yàn)過程和檢驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行雙重復(fù)核和監(jiān)控。通過對(duì)比監(jiān)測(cè)的微生物種群類別和樣品微生物種群情況，客觀準(zhǔn)確的評(píng)價(jià)檢驗(yàn)質(zhì)量，增加檢驗(yàn)報(bào)告的含金量。27/92第二十六頁(yè)，共91頁(yè)。應(yīng)用：3與國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)接軌，監(jiān)控藥品生產(chǎn)環(huán)境，構(gòu)建藥品生產(chǎn)微生物風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估體系美國(guó)FDA要求藥廠將微生物鑒定到“種”一級(jí)，并建議在微生物形態(tài)和生化反應(yīng)鑒定之外采用基因分型技術(shù)進(jìn)行分析，以便對(duì)生產(chǎn)環(huán)境的微生物污染進(jìn)行監(jiān)控。28/92第二十七頁(yè)，共91頁(yè)。二、污染菌庫(kù)建立步驟污染菌的收集3.2.1.污染菌庫(kù)數(shù)據(jù)的處理與應(yīng)用污染菌的分離純化4.菌種的保藏菌種的鑒定5.29/92第二十八頁(yè)，共91頁(yè)。一、污染菌的收集污染菌收集分類污染菌采集地點(diǎn)環(huán)境監(jiān)控污染菌收集化驗(yàn)室生產(chǎn)---有毒區(qū)生產(chǎn)---無毒區(qū)分包裝車間原輔料、不同階段樣品監(jiān)控污染菌收集成品組原輔料組生產(chǎn)---有毒區(qū)生產(chǎn)---無毒區(qū)30/92第二十九頁(yè)，共91頁(yè)。一、污染菌的收集31/92第三十頁(yè)，共91頁(yè)。二、污染菌的分離純化定義：樣品或環(huán)境監(jiān)控到的微生物有的呈混雜狀態(tài)存在，要獲得所需菌種，必須從中進(jìn)行分離，即將待分離樣品進(jìn)行一定的稀釋，并使微生物的細(xì)胞（或孢子）盡量以分散狀態(tài)存在，然后使其長(zhǎng)成一個(gè)個(gè)純種單菌落。目的：使樣品或環(huán)境中監(jiān)控到的微生物長(zhǎng)成單菌落后，便于后續(xù)的鑒定和保藏工作。32/92第三十一頁(yè)，共91頁(yè)。方法：稀釋涂板法、稀釋混合平板法、劃線分離

平板劃線分離法33/92第三十二頁(yè)，共91頁(yè)。各濃度做三個(gè)平皿挑選單菌落接種斜面稀釋涂板法

從土壤分離微生物操作過程34/92第三十三頁(yè)，共91頁(yè)。三、污染菌的保藏一、菌種保藏

（一）保藏目的及原理

（二）菌種保藏的方法

（三）菌種保藏注意事項(xiàng)

二35/92第三十四頁(yè)，共91頁(yè)。（一）菌種保藏目的及原理目的原理創(chuàng)造不利于菌種生長(zhǎng)的一切條件，

使其代謝處于休眠狀態(tài)。不生長(zhǎng)不死亡不污染不降低或不喪失其優(yōu)良性以盡量延長(zhǎng)使用時(shí)間3536/92第三十五頁(yè)，共91頁(yè)。低溫干燥無氧缺營(yíng)養(yǎng)不利

條件3637/92第三十六頁(yè)，共91頁(yè)。（二）菌種保藏的方法生活態(tài)休眠態(tài)培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)寄主傳代培養(yǎng)冷凍干燥斜面、平板液氮、低溫冰箱沙土管、冷凍真空干燥3738/92第三十七頁(yè)，共91頁(yè)。常用保藏法簡(jiǎn)介特點(diǎn)簡(jiǎn)便

保藏時(shí)間短

易污染及退化1.斜面低溫法

斜面菌種置4~6℃冰箱中（3~6個(gè)月）39/92第三十八頁(yè)，共91頁(yè)。40/92第三十九頁(yè)，共91頁(yè)。2.礦油保藏法無菌檢驗(yàn)？注入種管淹沒斜面約1cm礦油

處理滅菌：152kpa、30min

去水：40~50℃烘至無色透明口堵膠塞用時(shí)轉(zhuǎn)管再轉(zhuǎn)管方法簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)適用于不宜冷凍干燥的微生物（如產(chǎn)孢能力低的絲狀菌）的保存。某些細(xì)菌不宜采用此法進(jìn)行保存。特點(diǎn)41/92第四十頁(yè)，共91頁(yè)。42/92第四十一頁(yè)，共91頁(yè)。3.超低溫冷凍保藏要求長(zhǎng)期保藏的微生物菌種，一般都要求在

-60～-80℃以下進(jìn)行保藏。在超低溫冷藏柜中保藏菌種的一般方法是：

1．離心收獲對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期至后期的微生物細(xì)胞

2．用新鮮培養(yǎng)基重新懸浮所收獲的細(xì)胞；

3．加入等體積的20％甘油或10％二甲亞砜；

4．混勻后分裝入冷凍指管或安瓿中，于-70℃超低溫冰箱中保藏。

43/92第四十二頁(yè)，共91頁(yè)。如果待保藏菌種生長(zhǎng)在斜面上，則可用含10％甘油的新配制液體培養(yǎng)基洗滌收獲。若干細(xì)菌和真菌菌種可通過此保藏方法保藏5年而活力不受影響。44/92第四十三頁(yè)，共91頁(yè)。4.磁珠保藏法45/92第四十四頁(yè)，共91頁(yè)。5.液氮冷凍保藏法液氮超低溫保藏法是近幾年才發(fā)展起來的，此法國(guó)外已較普遍采用，是適用范圍最廣的微生物保藏法。原理:用液氮能長(zhǎng)期保存菌種。這是因?yàn)橐旱臏囟瓤蛇_(dá)－196℃，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于其新陳代謝作用停止的溫度（－130℃），所以此時(shí)菌種的代謝活動(dòng)已基本停止，化學(xué)作用亦隨之消失。46/92第四十五頁(yè)，共91頁(yè)。常用保藏方法比較47/92第四十六頁(yè)，共91頁(yè)。（三）菌種保藏的注意事項(xiàng)1．菌種在保藏前所處的狀態(tài)一般以稍低于生長(zhǎng)最適溫度培養(yǎng)至孢子成熟的菌種進(jìn)行保存，效果較好。2．菌種保藏所用的基質(zhì)碳源、砂土、保護(hù)劑3．操作過程對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的損害凍結(jié)速度48/92第四十七頁(yè)，共91頁(yè)。四、菌種的鑒定49/92第四十八頁(yè)，共91頁(yè)。1、菌種鑒定技術(shù)對(duì)細(xì)菌各種生物學(xué)性狀進(jìn)行分類，選用多項(xiàng)生理、生化指標(biāo)逐一進(jìn)行比較，通過查表或計(jì)算機(jī)分析各菌間相似度，完成細(xì)菌分類。細(xì)胞形狀、菌落形態(tài)、G氏染色等形態(tài)學(xué)特征初步判定。遺傳特征：核酸序列

蛋白質(zhì)比較

核酸堿基組成50/92第四十九頁(yè)，共91頁(yè)。51/92第五十頁(yè)，共91頁(yè)。用于鑒定的形態(tài)學(xué)特征52/92第五十一頁(yè)，共91頁(yè)。用于鑒定的生理生化特征53/92第五十二頁(yè)，共91頁(yè)。用于鑒定的遺傳學(xué)特征細(xì)菌酵母菌霉菌54/92第五十三頁(yè)，共91頁(yè)。2、細(xì)菌的鑒定55/92第五十四頁(yè)，共91頁(yè)。分離純化得到單菌落菌落形態(tài)檢驗(yàn)DNA提取構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹分子生物學(xué)鑒定通用引物擴(kuò)增細(xì)菌16SrDNA

序列16SrDNA序列分析鑒定結(jié)論樣品接收革蘭氏染色形態(tài)鑒定生理生化鑒定細(xì)菌鑒定儀細(xì)菌的鑒定流程圖

56/92第五十五頁(yè)，共91頁(yè)。形態(tài)學(xué)--革蘭氏染色

細(xì)菌學(xué)上最常用的鑒別染色法。該染色法能將細(xì)菌分為G+菌和G-菌。原理：由這兩類菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)和成分的不同所決定的。G-菌的細(xì)胞壁較多易被乙醇溶解的類脂質(zhì)、肽聚糖層較薄、交聯(lián)度低，故用乙醇或丙酮脫色時(shí)溶解了類脂質(zhì)，增加了細(xì)胞壁的通透性，使初染的結(jié)晶紫和碘的復(fù)合物易于滲出，結(jié)果細(xì)菌就被脫色，再經(jīng)蕃紅復(fù)染后就成紅色。G+菌細(xì)胞壁中肽聚糖層厚且交聯(lián)度高，類脂質(zhì)含量少，經(jīng)脫色劑處理后反而使肽聚糖層的孔徑縮小，通透性降低，因此細(xì)菌仍保留初染時(shí)的顏色。57/92第五十六頁(yè)，共91頁(yè)。G+菌和G-菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)和成分比較類型革蘭氏陽性菌革蘭氏陰性菌強(qiáng)度較堅(jiān)韌較疏松厚度厚，20～80nm薄，5～10nm肽聚糖層數(shù)多，15~50層，每層厚1nm少，1～3層肽聚糖含量多，可占胞壁干重50～80%少，占胞壁干重10～20%磷壁酸+-外膜-+結(jié)構(gòu)三維空間（立體結(jié)構(gòu)）二維空間（平面結(jié)構(gòu)）58/92第五十七頁(yè)，共91頁(yè)。革蘭氏染色步驟59/92第五十八頁(yè)，共91頁(yè)。革蘭氏陰性菌革蘭氏陽性菌60/92第五十九頁(yè)，共91頁(yè)。革蘭氏陽性球菌：產(chǎn)品樣本、水、環(huán)境監(jiān)測(cè)中發(fā)現(xiàn)的大多數(shù)陽性球菌來自人，有些可能來源于天然來源的原料。藥品生產(chǎn)中包括無菌工藝，最常見的污染物是革蘭氏陽性球菌，有葡萄球菌屬、微球菌屬、鏈球菌屬。人源污染的細(xì)菌經(jīng)常與不規(guī)范的無菌行為和操作、裸露的皮膚或頭發(fā)(人類脫落)有關(guān)。常見革蘭氏菌污染來源61/92第六十頁(yè)，共91頁(yè)。革蘭氏陽性桿菌污染物通常來自于環(huán)境，特別是土壤或塵埃，也會(huì)來自原料，如聚乙二醇(PEG)。生物工藝最常見的革蘭氏陽性桿菌污染，是芽孢桿菌屬和類芽孢桿菌屬，它們產(chǎn)生的內(nèi)生芽孢對(duì)環(huán)境壓力有高耐受性。芽孢桿菌屬污染與缺乏無菌操作意識(shí)，材料和表面的消毒不徹底，無效SIP循環(huán)，違反無菌原則，以及污染的原料有關(guān)。常見革蘭氏菌污染來源62/92第六十一頁(yè)，共91頁(yè)。

革蘭氏陰性桿菌污染通常來自水源、土壤、植被、原料。革蘭氏陰性桿菌包括大腸桿菌屬，假單胞菌屬，伯霍爾德桿菌屬，勞爾氏菌屬、狹長(zhǎng)平胞屬等。事實(shí)上，水和液體系統(tǒng)中通常發(fā)現(xiàn)存在這些屬的微生物污染。所以，在生物工藝操作樣品中通常不會(huì)發(fā)現(xiàn)革蘭氏陰性桿菌。產(chǎn)品污染革蘭氏陰性桿菌經(jīng)常與積水、設(shè)備的清潔維護(hù)保養(yǎng)護(hù)操作不徹底相關(guān)。革蘭氏陰性菌污染的主要問題之一是內(nèi)毒素常見革蘭氏菌污染來源63/92第六十二頁(yè)，共91頁(yè)。革蘭氏陰性球菌在醫(yī)學(xué)上是與人類有關(guān)的。它們包括引起性傳播疾病(淋病奈瑟氏菌、腦膜炎奈瑟氏菌)和呼吸道感染(卡他莫拉菌)的微生物。這類的污染很少出現(xiàn)在生物工藝中。如果結(jié)果顯示有革蘭氏陰性球菌污染，很有可能是檢驗(yàn)錯(cuò)誤。常見革蘭氏菌污染來源64/92第六十三頁(yè)，共91頁(yè)。革蘭氏陰性螺旋菌在制藥用水系統(tǒng)或潔凈室環(huán)境很少發(fā)現(xiàn)。這些細(xì)菌與排泄物污染有關(guān),包括被污染的水源。當(dāng)檢測(cè)到該類菌時(shí)，應(yīng)該全面調(diào)查找到它的潛在來源。常見革蘭氏菌污染來源65/92第六十四頁(yè)，共91頁(yè)。分離純化得到單菌落菌落形態(tài)檢驗(yàn)DNA提取構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹分子生物學(xué)鑒定通用引物擴(kuò)增細(xì)菌16SrDNA

序列16SrDNA序列分析鑒定結(jié)論樣品接收革蘭氏染色形態(tài)鑒定生理生化鑒定細(xì)菌鑒定儀細(xì)菌的鑒定流程圖

66/92第六十五頁(yè)，共91頁(yè)。生理生化--半自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀（ATBNew）檢測(cè)項(xiàng)目：可鑒定由環(huán)境、原料及制成品分離出的菌種和藥敏試驗(yàn)（包括：腸桿菌、非發(fā)酵G-桿菌、葡萄球菌、鏈球菌、酵母菌、厭氧菌）。可鑒定770種細(xì)菌和分析近80種抗生素藥敏實(shí)驗(yàn)。67/92第六十六頁(yè)，共91頁(yè)。分離純化得到單菌落菌落形態(tài)檢驗(yàn)DNA提取構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹分子生物學(xué)鑒定通用引物擴(kuò)增細(xì)菌16SrDNA

序列16SrDNA序列分析鑒定結(jié)論樣品接收革蘭氏染色形態(tài)鑒定生化鑒定ATB細(xì)菌鑒定儀鑒定細(xì)菌的鑒定流程圖

68/92第六十七頁(yè)，共91頁(yè)。分子生物學(xué)--具體流程基因組的制備PCR克隆16sRNA陽性克隆鑒定，測(cè)序同源性分析，系統(tǒng)進(jìn)化樹建立69/92第六十八頁(yè)，共91頁(yè)。系統(tǒng)發(fā)育樹根據(jù)同源性分析結(jié)果和系統(tǒng)發(fā)生樹來判定該菌株為Cellulophaga屬細(xì)菌,命名Cellulophagasp.QY201。6970/92第六十九頁(yè)，共91頁(yè)。3、真菌的鑒定71/92第七十頁(yè)，共91頁(yè)。真菌的鑒定流程圖分離純化得到真菌樣品的單菌落真菌菌落形態(tài)觀察真菌DNA的提取構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹分子生物學(xué)評(píng)價(jià)通用引物擴(kuò)增真菌ITS序列ITS序列在GenBank中進(jìn)行Blast分析鑒定結(jié)論72/92第七十一頁(yè)，共91頁(yè)。真菌形態(tài)觀察

通常把真菌分為酵母菌和絲狀真菌(霉菌)。霉菌由粗大、有隔或無隔分支狀菌絲構(gòu)成，菌絲分為基質(zhì)菌絲和氣生菌絲。氣生菌絲特化結(jié)構(gòu)上產(chǎn)生多種無性、有性孢子。孢子著生部位、排列方式以及孢子形態(tài)是真菌鑒定的重要依據(jù)。7273/92第七十二頁(yè)，共91頁(yè)。

酵母菌是微小的單細(xì)胞真菌。可能在非專業(yè)人員看來，平皿上的酵母菌落像細(xì)菌。然而，在顯微鏡下，這些細(xì)胞大得多，看起來像葡萄干，因此可以很容易地區(qū)別于細(xì)菌。生物工藝中典型的酵母污染是生物工藝中的人員、植物和原材料。常見酵母菌污染來源74/92第七十三頁(yè)，共91頁(yè)。霉菌是多細(xì)胞真菌，其產(chǎn)生的細(xì)絲稱為菌絲。因此其學(xué)名為“絲狀真菌”。這類微生物在土壤、塵埃(粉塵)和植被中非常常見。霉菌污染是這些微生物在生殖周期中會(huì)產(chǎn)生的孢子。因此霉菌污染很容易傳播。另一個(gè)問題是大多數(shù)物種產(chǎn)生的真菌毒素對(duì)人類有害。常見霉菌污染來源75/92第七十四頁(yè)，共91頁(yè)。黑曲霉可引起燒傷病人皮膚感染或真菌性肺部感染3.2

微生物的顯微形態(tài)76/92第七十五頁(yè)，共91頁(yè)。曲霉青霉7677/92第七十六頁(yè)，共91頁(yè)。分生孢子梗青霉：分生孢子梗7778/92第七十七頁(yè)，共91頁(yè)。足細(xì)胞曲霉：分生孢子頭79/92第七十八頁(yè)，共91頁(yè)。根霉：孢子囊、匍匐枝和假根7980/92第七十九頁(yè)，共91頁(yè)。犁頭霉：接合孢子81/92第八十頁(yè)，共91頁(yè)。

酵母菌是單細(xì)胞構(gòu)造，個(gè)體形態(tài)多為卵圓形、圓柱形，但有時(shí)某些酵母菌可形成假菌絲。酵母菌無性繁殖以出芽方式生殖。酵母菌：出芽釀酒酵母白色念珠菌（假絲酵母）8182/92第八十一頁(yè)，共91頁(yè)。真菌的鑒定流程圖分離純化得到真菌樣品的單菌落真菌菌落形態(tài)觀察真菌DNA的提取構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹分子生物學(xué)評(píng)價(jià)通用引物擴(kuò)增真菌ITS序列ITS序列在GenBank中進(jìn)行Blast分析鑒定結(jié)論83/92第八十二頁(yè)，共91頁(yè)。分子生物學(xué)在真菌鑒定中的應(yīng)用現(xiàn)行國(guó)標(biāo)僅能夠?qū)η箤?，青霉屬，鐮刀菌屬等少?shù)幾個(gè)種屬的霉菌進(jìn)行鑒定。我國(guó)的食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中，對(duì)于青霉菌的鑒定需要在分離純化后培養(yǎng)12-14天，再對(duì)其孢子及菌絲進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。真菌孢子易于在空氣中飄散，難以殺滅，對(duì)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境和檢驗(yàn)人員安全具有潛在污染風(fēng)險(xiǎn)。分子生物學(xué)鑒定技術(shù)不需要使用選擇性培養(yǎng)基，純化后即可進(jìn)行菌種鑒定。對(duì)真菌的菌絲體和孢子均能夠進(jìn)行DNA的提取，避免霉菌產(chǎn)生的大量孢子對(duì)實(shí)驗(yàn)室工作環(huán)境帶來的潛在污染危害。84/92第八十三頁(yè)，共91頁(yè)。五、污染菌庫(kù)數(shù)據(jù)的處理與應(yīng)用

目的：

建立環(huán)境微生物污染趨勢(shì)分析圖，預(yù)測(cè)微生物污染方向，從被動(dòng)的排查污染措施上升到主動(dòng)的預(yù)防、預(yù)警。并將污染信息與歷史污染物比對(duì)，回顧調(diào)查，幫助質(zhì)量體系的改進(jìn)。85/92第八十四頁(yè)，共91頁(yè)。企業(yè)自查政府監(jiān)管微生物樣本的采集微生物菌株鑒定企業(yè)環(huán)境控制及污染溯源能力新型監(jiān)管模式的建立構(gòu)建微生物分布圖建立菌種信息庫(kù)

A類企業(yè)：分子水平B類企業(yè)：生化水平C類企業(yè)：鏡檢、API水平

作用：企業(yè)微生物污染的監(jiān)督、管理和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估新模式的建立86/92第八十五頁(yè)，共91頁(yè)。五、污染菌庫(kù)數(shù)據(jù)的處理與應(yīng)用環(huán)境監(jiān)測(cè)計(jì)劃收集、分離、鑒別污染菌數(shù)據(jù)分析與應(yīng)用87/92第八十六頁(yè)，共91頁(yè)。沉降菌監(jiān)測(cè)頻次及測(cè)試