免疫細(xì)胞標(biāo)志與功能檢測技術(shù)

免疫細(xì)胞標(biāo)志與功能檢測技術(shù)第1頁，共80頁，2023年，2月20日，星期三掌握：免疫細(xì)胞的分離;淋巴細(xì)胞功能檢測熟悉：免疫細(xì)胞表面標(biāo)志和功能檢測的臨床

應(yīng)用;淋巴細(xì)胞表面標(biāo)志及亞群分類；了解：其他免疫細(xì)胞功能檢測技術(shù)；檢測的

臨床應(yīng)用。第2頁，共80頁，2023年，2月20日，星期三一、免疫細(xì)胞的分離二、淋巴細(xì)胞標(biāo)志及亞群分類三、抗原提呈細(xì)胞的表面標(biāo)志四、淋巴細(xì)胞的功能檢測五、其他免疫細(xì)胞功能檢測技術(shù)六、免疫細(xì)胞表面標(biāo)志和功能檢測的臨床應(yīng)用第3頁，共80頁，2023年，2月20日，星期三第4頁，共80頁，2023年，2月20日，星期三一、外周血單個(gè)核細(xì)胞分離二、淋巴細(xì)胞的分離三、T、B細(xì)胞和T細(xì)胞亞群的分離四、不同分離方法的評價(jià)第一節(jié)免疫細(xì)胞的分離掌握第5頁，共80頁，2023年，2月20日，星期三外周血單個(gè)核細(xì)胞(perpheralbloodmononuclearcells,PBMC)：包括淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞。一、外周血單個(gè)核細(xì)胞分離掌握第6頁，共80頁，2023年，2月20日，星期三1.不同細(xì)胞密度不同2.不同細(xì)胞表面生物學(xué)特性不同3.不同細(xì)胞表面分化抗原不同細(xì)胞分離基本原理了解第7頁，共80頁，2023年，2月20日，星期三紅細(xì)胞和粒細(xì)胞密度為1.092-1.093單個(gè)核細(xì)胞密度為1.075-1.090

選擇比重為1.075-1.090介質(zhì)分離PBMC不同細(xì)胞密度不同熟悉第8頁，共80頁，2023年，2月20日，星期三對分離介質(zhì)的要求1.對細(xì)胞無毒2.基本等滲3.不溶于血漿等分離物質(zhì)4.有要求的比重2份6%聚蔗糖蒸餾水溶液+1份34%泛影葡胺比重為1.077±0.002熟悉第9頁，共80頁，2023年，2月20日，星期三聚蔗糖泛影葡胺--Ficoll分離液原理：單次差速密度梯度離心的分離法組成：2份6%聚蔗糖蒸餾水溶液+1份34%泛影葡胺生理鹽水溶液。比重：1.077±0.001(最佳)

掌握第10頁，共80頁，2023年，2月20日，星期三

1.077±0.001的分層液可將細(xì)胞分離紅細(xì)胞：1.093粒細(xì)胞：1.092單個(gè)核細(xì)胞1.076—1.090

第11頁，共80頁，2023年，2月20日，星期三第12頁，共80頁，2023年，2月20日，星期三

密度梯度離心(Ficoll)離心

細(xì)胞純度95%；細(xì)胞收率80%；淋巴細(xì)胞90%--95%

第13頁，共80頁，2023年，2月20日，星期三1.貼壁粘附法

2.吸附柱過濾法:

將PBMC加入葡聚糖凝膠SephadexG-10中，從柱上洗脫下來的主要是淋巴細(xì)胞。3.Percoll分離液法：經(jīng)聚乙烯吡咯烷酮（PVP)處理的硅膠顆粒。目的--去除單核細(xì)胞二、淋巴細(xì)胞分離掌握第14頁，共80頁，2023年，2月20日，星期三

死細(xì)胞、血小板

單核細(xì)胞

淋巴細(xì)胞

粒細(xì)胞紅細(xì)胞

Percoll：經(jīng)聚乙烯吡咯烷酮（PVP)處理的硅膠顆粒。第15頁，共80頁，2023年，2月20日，星期三(一)磁性微球分離法(二)熒光激活細(xì)胞分離儀分離法

三、T、B細(xì)胞和T細(xì)胞亞群的分離熟悉磁珠高分子材料第16頁，共80頁，2023年，2月20日，星期三磁珠大小可以選擇第17頁，共80頁，2023年，2月20日，星期三磁性微球分離法細(xì)胞分選過程第18頁，共80頁，2023年，2月20日，星期三

第19頁，共80頁，2023年，2月20日，星期三第20頁，共80頁，2023年，2月20日，星期三大小免疫磁珠分離細(xì)胞的特點(diǎn)比較

比較項(xiàng)目大磁珠小磁珠對細(xì)胞的影響對細(xì)胞造成機(jī)械壓力，影響其生物學(xué)活性，不利于分離后培養(yǎng)。對細(xì)胞溫和，不影響分離細(xì)胞的后續(xù)培養(yǎng)。對流式細(xì)胞儀的影響阻塞流式細(xì)胞儀的噴嘴，影響散射光?？芍苯由狭魇郊?xì)胞儀檢測，不影響散射光。分離條件要求技術(shù)簡單，分離可在試管中完成。需要很強(qiáng)的磁場來分離細(xì)胞。收率得率高。得率不高。純度純度低。純度高。分離時(shí)間分離速度快。分離速度慢。分離成本成本低。需要很強(qiáng)的磁場來分離，需要一次性分離柱，不能在普通試管第21頁，共80頁，2023年，2月20日，星期三免疫磁珠細(xì)胞分選裝置第22頁，共80頁，2023年，2月20日，星期三全自動細(xì)胞分選系統(tǒng)

第23頁，共80頁，2023年，2月20日，星期三

熒光激活細(xì)胞分離儀分離法

第24頁，共80頁，2023年，2月20日，星期三流式細(xì)胞分析儀第25頁，共80頁，2023年，2月20日，星期三四、不同細(xì)胞分離方法的綜合評價(jià)早期：根據(jù)不同免疫細(xì)胞的物理屬性和生物學(xué)屬性進(jìn)行分離近期：利用細(xì)胞表面標(biāo)志進(jìn)行分離了解第26頁，共80頁，2023年，2月20日，星期三1.分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，單次差速密度梯度離心法常用分層液是（）A明膠B右旋糖酐CFicoll分層液DPercoll分層液E葡聚糖2.Ficoll液單次密度梯度離心后外周血細(xì)胞分布由上至下依次為（）A單個(gè)核細(xì)胞、血小板和血漿、粒細(xì)胞、紅細(xì)胞B血小板和血漿、粒細(xì)胞、單個(gè)核細(xì)胞、紅細(xì)胞C血小板和血漿、單個(gè)核細(xì)胞、粒細(xì)胞、紅細(xì)胞D血小板和血漿、單個(gè)核細(xì)胞、紅細(xì)胞、粒細(xì)胞E血小板和血漿、紅細(xì)胞、單個(gè)核細(xì)胞、粒細(xì)胞用玻璃纖3.維或葡聚糖凝膠Sephadex-G10柱分離細(xì)胞時(shí)，從柱上洗脫下的細(xì)胞主要是()A．粒細(xì)胞B．淋巴細(xì)胞C．單核細(xì)胞D．T細(xì)胞E．B細(xì)胞

CCB第27頁，共80頁，2023年，2月20日，星期三4.采用Ficoll密度梯度分離法分離得到的細(xì)胞主要為（）A單核細(xì)胞和粒細(xì)胞B單核細(xì)胞C淋巴細(xì)胞D淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞E淋巴細(xì)胞和粒細(xì)胞

5.Percoll分離液的主要成分是()A．聚蔗糖B．泛影葡胺C．聚乙二醇D．聚乙烯吡咯烷酮E．經(jīng)聚乙烯吡咯烷酮處理的硅膠顆粒6.分離人外周血淋巴細(xì)胞分層液的最佳密度為()A.1.030B.1.035C.1.092D.1.020E.1.0777.Ficoll淋巴細(xì)胞分離液的主要成分是()A．聚蔗糖B．泛影葡胺C．聚乙二醇D．聚蔗糖+泛影葡胺E．聚蔗糖+聚乙二醇DEED第28頁，共80頁，2023年，2月20日，星期三第二節(jié)

淋巴細(xì)胞標(biāo)志及亞群分類第29頁，共80頁，2023年，2月20日，星期三細(xì)胞表面分化抗原(ClusterofdifferentiationCD)CD1a------CD350第30頁，共80頁，2023年，2月20日，星期三(一)CD3+CD4+CD8-輔助性T細(xì)胞(Th)

CD3+CD4+CD30-Th1CD3+CD4+CD30+Th2(二)CD3+CD4-CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)(三)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞CD4+CD25+Foxp3+

Tr1–IL-10Th3–TFG-β一、T細(xì)胞表面標(biāo)志及亞群熟悉第31頁，共80頁，2023年，2月20日，星期三CD4+Th細(xì)胞亞群分化的調(diào)節(jié)作用第32頁，共80頁，2023年，2月20日，星期三CD抗原CD2CD3CD4CD8CD25CD28CD40L特異性全部T細(xì)胞和部分NK細(xì)胞(E受體)

成熟T細(xì)胞(特征性標(biāo)志)輔助性T細(xì)胞(HIV受體)細(xì)胞毒性T細(xì)胞活化T細(xì)胞(IL-2R)T細(xì)胞活化T細(xì)胞

T細(xì)胞表面主要CD抗原及其特性第33頁，共80頁，2023年，2月20日，星期三mIg(鑒定B細(xì)胞的指標(biāo))Fc受體補(bǔ)體受體EB病毒受體CD分子:CD19小鼠紅細(xì)胞受體二、B細(xì)胞表面標(biāo)志熟悉分類:B1(CD19+CD5+)B2(CD19+CD5-)第34頁，共80頁，2023年，2月20日，星期三B-1細(xì)胞和B-2細(xì)胞的異同第35頁，共80頁，2023年，2月20日，星期三CD抗原CD21CD35CD40CD80/86CD19/CD5

特異性

EB病毒受體活化B細(xì)胞與CD40L結(jié)合活化B細(xì)胞與T細(xì)胞CD28結(jié)合，活化T細(xì)胞

B1雙陽；B2僅為CD19+

B細(xì)胞表面主要CD抗原及其特性第36頁，共80頁，2023年，2月20日，星期三CD3-CD56+CD16+三、NK細(xì)胞表面標(biāo)志（naturekillercell,NK)熟悉第37頁，共80頁，2023年，2月20日，星期三復(fù)習(xí)1.對細(xì)胞液分離的要求？2.從PBMC中得到淋巴細(xì)胞的方法？3.成熟T細(xì)胞表面主要標(biāo)志？4.B細(xì)胞根據(jù)什么主要標(biāo)志分為何種亞群？第38頁，共80頁，2023年，2月20日，星期三抗原提呈類細(xì)胞表面標(biāo)志第三節(jié)抗原提呈細(xì)胞的表面標(biāo)志CD1a,CD11c,CD83第39頁，共80頁，2023年，2月20日，星期三一、單核-吞噬細(xì)胞系統(tǒng)組織部位細(xì)胞名稱骨髓干細(xì)胞—單核母細(xì)胞—前單核細(xì)胞骨髓和血液單核細(xì)胞各種組織組織細(xì)胞（結(jié)締組織）,枯否細(xì)胞（肝）（巨噬細(xì)胞）破骨細(xì)胞（骨）、小膠質(zhì)細(xì)胞（神經(jīng)組織）、表面標(biāo)志:CD14熟悉第40頁，共80頁，2023年，2月20日，星期三二、樹突狀細(xì)胞（dendriticcell)抗原提呈能力最強(qiáng)DC的共同特征包括：①形態(tài)上呈樹突狀，胞質(zhì)內(nèi)存在特異性Birbeck顆粒狀結(jié)構(gòu)②表達(dá)CD1a、高水平MHC-Ⅱ類抗原和多種輔助分子③吞噬功能較低④可有效誘導(dǎo)巢居的靜息性幼稚T細(xì)胞發(fā)生增殖熟悉第41頁，共80頁，2023年，2月20日，星期三1.用抗人CD3單克隆抗體檢測T淋巴細(xì)胞，其結(jié)果代表（）AT淋巴細(xì)胞總數(shù)BTh細(xì)胞數(shù)CTs細(xì)胞數(shù)DCD4T細(xì)胞數(shù)ECD8T細(xì)胞數(shù)2.下列指標(biāo)可以評價(jià)AIDS病人的細(xì)胞免疫功能的是（）ACD2/CD3細(xì)胞比值BCD3/CD4細(xì)胞比值CCD3/CD8細(xì)胞比值DCD4/CD8細(xì)胞比值ECD2/CD4細(xì)胞比值3.能與SRBC結(jié)合形成E花環(huán)的細(xì)胞主要是()A．T細(xì)胞B．B細(xì)胞C．單核細(xì)胞D．粒細(xì)胞E．血小板

ADA第42頁，共80頁，2023年，2月20日，星期三4.B細(xì)胞重要表面標(biāo)志不包括（）A膜免疫球蛋白（SmIg）BEB病毒受體CE受體D補(bǔ)體受體D小鼠紅細(xì)胞受體5.

NK細(xì)胞特有的表面抗原是()A.CD2B.CD16C.無特異的表面抗原D.CD23E.CD566.單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)細(xì)胞的表面標(biāo)志()A．CD2B．CD16C．CD14

D．CD16E．CD197.外周成熟的休止B細(xì)胞分如下亞群()A.CD4+細(xì)胞B.CD4-細(xì)胞C.CD8+細(xì)胞D.CD8-細(xì)胞E.B1細(xì)胞和B2細(xì)胞CCCE第43頁，共80頁，2023年，2月20日，星期三第四節(jié)

淋巴細(xì)胞功能檢測T細(xì)胞（負(fù)責(zé)細(xì)胞免疫功能）B細(xì)胞（執(zhí)行體液免疫功能）NK細(xì)胞（非特異性免疫作用）

第44頁，共80頁，2023年，2月20日，星期三一、T細(xì)胞功能檢測(一)T細(xì)胞增殖試驗(yàn)(二)抗原特異性T細(xì)胞增值試驗(yàn)(三)MHC-肽四聚體技術(shù)(四)T細(xì)胞分泌功能測定(五)T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒試驗(yàn)(六)體內(nèi)試驗(yàn)第45頁，共80頁，2023年，2月20日，星期三1.原理淋巴細(xì)胞DNA合成分化母細(xì)胞刺激物細(xì)胞變大細(xì)胞漿擴(kuò)大空泡核仁明顯核染色質(zhì)疏松（一）T淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)

---T細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)掌握第46頁，共80頁，2023年，2月20日，星期三T細(xì)胞外來物質(zhì)細(xì)胞內(nèi)大分子物質(zhì)的合成增加T細(xì)胞形態(tài)變化絲裂原：非抗原性刺激物

PHA、ConA、PWM抗原性刺激物：PPD(purifiedproteinderivative)同位素法形態(tài)法第47頁，共80頁，2023年，2月20日，星期三標(biāo)本：外周血單個(gè)核細(xì)胞37℃72h+取培養(yǎng)細(xì)胞涂片染色鏡檢觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變PHA無PHA刺激物：常用PHA（1）形態(tài)學(xué)檢查法第48頁，共80頁，2023年，2月20日，星期三未轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)化淋巴細(xì)胞的形態(tài)特征轉(zhuǎn)化的淋巴細(xì)胞未轉(zhuǎn)化的淋巴細(xì)胞淋巴母細(xì)胞過渡型細(xì)胞大小(直徑μm)12-2012-166-8核大小、染色質(zhì)增大、疏松增大、疏松不增大、密集核仁清晰、1-4個(gè)有或無無有絲分裂有或無無無胞質(zhì)、著色增多、嗜堿增多、嗜堿極少、天青色漿內(nèi)空泡有或無有或無無偽足有或無有或無無第49頁，共80頁，2023年，2月20日，星期三第50頁，共80頁，2023年，2月20日，星期三淋巴細(xì)胞標(biāo)志及功能檢測龔道科2002.4第51頁，共80頁，2023年，2月20日，星期三正常轉(zhuǎn)化率:60%-80%;

小于50%為降低第52頁，共80頁，2023年，2月20日，星期三優(yōu)點(diǎn)：形態(tài)學(xué)方法簡便易行，適于基層實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用。缺點(diǎn)：判斷結(jié)果易受主觀因素影響，重復(fù)性和準(zhǔn)確性差。

方法學(xué)評價(jià)：第53頁，共80頁，2023年，2月20日，星期三外周血單個(gè)核細(xì)胞37℃56h

+收集培養(yǎng)細(xì)胞液體閃爍器計(jì)數(shù)cpm加入3H-TdRPHA無PHA37℃16h（2）3H-TdR摻入法第54頁，共80頁，2023年，2月20日，星期三優(yōu)點(diǎn)：3H-TdR摻入法敏感性高，客觀強(qiáng)，重復(fù)性好。缺點(diǎn)：但需一定設(shè)備條件，同時(shí)還存在放射性核素污染問題。SI=刺激指數(shù)PHA刺激管cpm均值

對照管cpm均值第55頁，共80頁，2023年，2月20日，星期三(3)MTT比色法

MTT（噻唑鹽）在活細(xì)胞內(nèi)被線粒體琥珀酸脫氫酶還原成藍(lán)黑色(甲臢）物質(zhì)，與細(xì)胞增殖呈正相關(guān)。第56頁，共80頁，2023年，2月20日，星期三方法學(xué)評價(jià)：優(yōu)點(diǎn)：操作簡便，無放射性污染缺點(diǎn)：敏感性不及放射性核素法

第57頁，共80頁，2023年，2月20日，星期三

感染性疾病，T細(xì)胞會形成對病原微生物的免疫記憶，在體外分離到T細(xì)胞后，培養(yǎng)增殖T細(xì)胞的同時(shí)加入相應(yīng)病原的特異抗原進(jìn)行刺激，激活該細(xì)胞的記憶，有記憶的細(xì)胞會分泌γ-干擾素，通過檢測γ-干擾素的量可以反映T細(xì)胞情況。（二）抗原特異性T細(xì)胞增值試驗(yàn)了解第58頁，共80頁，2023年，2月20日，星期三

通過TCR與MHC-肽的特異性相互作用，來檢測抗原特異的T細(xì)胞，了解機(jī)體的免疫狀況。（三）MHC-肽四聚體技術(shù)了解第59頁，共80頁，2023年，2月20日，星期三

免疫學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)及分子生物學(xué)技術(shù)分別檢測細(xì)胞因子含量、生物學(xué)活性或基因表達(dá)水平。（四）T細(xì)胞分泌功能測定了解第60頁，共80頁，2023年，2月20日，星期三1.原理靶細(xì)胞抗原T細(xì)胞

觀察殺傷活力致敏CTL靶細(xì)胞（五）T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒試驗(yàn)熟悉第61頁，共80頁，2023年，2月20日，星期三形態(tài)學(xué)方法：淋巴細(xì)胞+腫瘤細(xì)胞計(jì)數(shù)殘留腫瘤細(xì)胞同位素法：淋巴細(xì)胞（CTL）+含51Cr的腫瘤細(xì)胞腫瘤細(xì)胞破壞51Cr釋放γ計(jì)數(shù)儀測定51Cr放射活性意義：判斷腫瘤患者CTL殺傷腫瘤細(xì)胞的能力

2.方法第62頁，共80頁，2023年，2月20日，星期三(一)特異性抗原皮膚試驗(yàn)(OT)(二)PHA皮膚試驗(yàn)(六)體內(nèi)試驗(yàn)了解第63頁，共80頁，2023年，2月20日，星期三溶血空斑試驗(yàn)酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)二、B細(xì)胞功能檢測了解第64頁，共80頁，2023年，2月20日，星期三SRBC取出脾細(xì)胞，加入SRBC及補(bǔ)體4天37℃0.7%瓊脂溶液37℃

溶血溶血空斑試驗(yàn)1.原理第65頁，共80頁，2023年，2月20日，星期三一個(gè)溶血空斑表示一個(gè)抗體形成細(xì)胞。溶血空斑的大小表示抗體形成的量。第66頁，共80頁，2023年，2月20日，星期三測定藥物或手術(shù)對體液免疫功能的影響評價(jià)免疫治療或免疫重建后機(jī)體體液免疫狀態(tài)

臨床應(yīng)用與評價(jià)第67頁，共80頁，2023年，2月20日，星期三染色計(jì)數(shù)離心取上清測LDH形態(tài)學(xué)法酶釋放法放射性核素釋放法溶解靶胞細(xì)常用靶細(xì)胞:人K562細(xì)胞株鼠YAC-1

三、NK細(xì)胞活性測定熟悉

測放射活性第68頁，共80頁，2023年，2月20日，星期三方法及原理：靶細(xì)胞效應(yīng)細(xì)胞

靶細(xì)胞死亡可被臺盼蘭染色形態(tài)法釋放胞內(nèi)酶酶釋法乳酸脫氫酶堿性磷酸酶簡便易于操作

受主觀因素響大無法計(jì)數(shù)輕微損傷的細(xì)胞經(jīng)濟(jì)、快速、簡便敏感度低本底較高第69頁，共80頁，2023年，2月20日，星期三

一、中性粒細(xì)胞功能檢測技術(shù)

二、巨噬細(xì)胞功能檢測技術(shù)第五節(jié)其他免疫細(xì)胞功能檢測技術(shù)了解第70頁，共80頁，2023年，2月20日，星期三

趨化

吞噬

胞內(nèi)殺滅作用

吞噬細(xì)胞的功能熟悉第71頁，共80頁，2023年，2月20日，星期三

趨化功能檢測吞噬