分子生物學(xué)常用技術(shù)凝膠電泳技術(shù)雜交技術(shù)

分子生物學(xué)常用技術(shù)凝膠電泳技術(shù)雜交技術(shù)第1頁(yè)，共55頁(yè)，2023年，2月20日，星期四

凝膠電泳(Gelelectrophoresis)是分子克隆的中心技術(shù)之一。

1.瓊脂糖凝膠用于分離200~1000bp的片段；操作簡(jiǎn)單、快速，且分離范圍廣，分辨率高

2.聚丙烯酰胺凝膠用于分離5~500bp的片段；效果好、分辨率極高，相差1bp的DNA片斷就能分開，能容納相對(duì)大量的DNA

用于DNA測(cè)序；核苷酸多態(tài)性的分析3.1凝膠電泳技術(shù)第2頁(yè)，共55頁(yè)，2023年，2月20日，星期四第3頁(yè)，共55頁(yè)，2023年，2月20日，星期四3.1凝膠電泳技術(shù)

3.1.1瓊脂糖凝膠電泳的原理3.1.2瓊脂糖凝膠電泳的影響因素3.1.3瓊脂糖凝膠電泳的應(yīng)用第4頁(yè)，共55頁(yè)，2023年，2月20日，星期四

瓊脂糖Agarose主要從海洋植物瓊脂中提取來的，為一種聚合線性多糖分子。瓊脂糖溶液冷卻形成的瓊脂糖凝膠Agarosegel呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，具有分子篩效用，可作為DNA電泳介質(zhì)。瓊脂糖凝膠的孔徑取決于瓊脂糖的濃度。經(jīng)化學(xué)修飾后熔點(diǎn)降低的瓊脂糖叫低熔點(diǎn)瓊脂糖Lowmeltingpointagarose，其機(jī)械強(qiáng)度無(wú)明顯變化，但可被agarase水解。主要用于膠中DNA的直接酶促反應(yīng)。3.1.1瓊脂糖凝膠電泳的原理第5頁(yè)，共55頁(yè)，2023年，2月20日，星期四3.1.1瓊脂糖凝膠電泳的原理

核酸是帶均勻負(fù)電荷的生物大分子，在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)，不同大小和構(gòu)象的核酸分子的電荷密度大致相同，在自由泳動(dòng)時(shí)，各核酸分子的遷移率區(qū)別很小，難以分開。以適當(dāng)濃度的凝膠作為電泳支持介質(zhì)，其分子篩效應(yīng)使得大小和構(gòu)象不同的核酸分子泳動(dòng)率出現(xiàn)較大差異，達(dá)到分離的目的。此為分離、鑒定、純化核酸片段的標(biāo)準(zhǔn)方法。用低濃度的熒光嵌入染料溴化乙錠（EB）對(duì)DNA染色，在紫外光下激發(fā)紅色熒光，可直接確定DNA在凝膠中的位置。第6頁(yè)，共55頁(yè)，2023年，2月20日，星期四凝膠電泳原理-凝膠阻滯第7頁(yè)，共55頁(yè)，2023年，2月20日，星期四

在凝膠電泳后，用適量溴化乙錠(ethidiumbromide，簡(jiǎn)稱EB)染料對(duì)核酸分子進(jìn)行染色，EB能插入到DNA或RNA分子的相鄰堿基之間，并在300nm波長(zhǎng)的紫外光照射下激發(fā)出紅色熒光。在適當(dāng)?shù)娜旧珬l件下，熒光強(qiáng)度與DNA片段的數(shù)量成正比?？芍苯佑^察，即將電泳膠放置在紫外光下觀察記錄電泳圖像。檢測(cè)靈敏快捷，0.05μg的微量DNA可以清晰地檢測(cè)出來。把EB直接加到凝膠介質(zhì)中，染料便會(huì)與DNA分子結(jié)合，卻不能與凝膠相結(jié)合。這樣就只有DNA分子能吸收EB并發(fā)出熒光。但長(zhǎng)期不能被降解，污染環(huán)境。溴化乙錠（EB）為致癌劑，操作時(shí)應(yīng)戴手套，盡量減少臺(tái)面污染。第8頁(yè)，共55頁(yè)，2023年，2月20日，星期四凝膠電泳原理-EB染色第9頁(yè)，共55頁(yè)，2023年，2月20日，星期四核酸電泳的指示劑核酸電泳常用的指示劑有兩種：

⑴溴酚藍(lán)

⑵二甲苯青，

溴酚藍(lán)（bromophenolblue,Bb）呈藍(lán)紫色；二甲苯晴（xylenecyanol,Xc）呈藍(lán)青色，它攜帶的電荷量比溴酚藍(lán)少，在凝膠中的的遷移率比溴酚藍(lán)慢。第10頁(yè)，共55頁(yè)，2023年，2月20日，星期四3.1.2瓊脂糖凝膠電泳的影響因素1．核酸的性質(zhì)

——DNA分子的大小，構(gòu)象2．凝膠孔徑的大小

——凝膠濃度3．電場(chǎng)強(qiáng)度和電場(chǎng)方向

——電極，電壓，電流4．緩沖液

——緩沖液組成和離子強(qiáng)度第11頁(yè)，共55頁(yè)，2023年，2月20日，星期四不同濃度瓊脂糖的凝膠最適分離范圍瓊脂糖濃度（％，W/V)DNA分子的有效分離范圍（kb)0.70.8-100.90.5-71.20.4-61.50.2-32.00.1-2第12頁(yè)，共55頁(yè)，2023年，2月20日，星期四水平式瓊脂糖凝膠電泳儀第13頁(yè)，共55頁(yè)，2023年，2月20日，星期四a．DNA分子遷移速率U與logN成反比（N為堿基對(duì)數(shù)目）。分子大小相等，電荷基本相等（DNA結(jié)構(gòu)重復(fù)性）。分子越大，遷移越慢。等量的空間結(jié)構(gòu)緊密的電泳快（超螺旋>線性DNA）。

b．瓊脂糖濃度：logU=logU0Kr

膠濃度，U為遷移率，U0

為DNA的自由電泳遷移率，為膠濃度，Kr為介質(zhì)阻滯系數(shù)。不同的凝膠濃度，分辨不同范圍的DNAAgarose：0.5%：1-30kb；0.7%：0.8-12kb1.2%：0.4-7kb；1.5%：0.2-3kb。

c．DNA構(gòu)象：一般遷移速率超螺旋環(huán)狀>線狀DNA>單鏈開環(huán)。當(dāng)條件變化時(shí)，情況會(huì)相反，還與瓊脂糖的濃度、電流強(qiáng)度、離子強(qiáng)度及EB含量有關(guān)。

d．所加電壓：低電壓時(shí)，線狀DNA片段的遷移速率與所加電壓成正比。使分辨效果好，凝膠上所加電壓不應(yīng)超過5V/cm。

e．堿基組成與溫度：一般影響不大，4-30℃。

f．嵌入染料的存在：降低線性DNA遷移率，(不提倡加在電泳液中)。

g．電泳緩沖液（0.5×TBE）的組成及其離子強(qiáng)度影響DNA的遷移率，無(wú)離子存在時(shí)，核酸基本不泳動(dòng)，離子強(qiáng)度過大產(chǎn)熱厲害，熔化凝膠并導(dǎo)致DNA變性，一般采用1×TAE，0.5×TBE，1×TPE（均含EDTApH8.0）。影響DNA在瓊脂糖凝膠中遷移速率的因素第14頁(yè)，共55頁(yè)，2023年，2月20日，星期四3.1.3瓊脂糖凝膠電泳的應(yīng)用瓊脂糖凝膠電泳應(yīng)用——PCR產(chǎn)物檢測(cè)瓊脂糖凝膠電泳應(yīng)用——酶切產(chǎn)物電泳檢測(cè)瓊脂糖凝膠電泳應(yīng)用——RFLP分析瓊脂糖凝膠電泳應(yīng)用——核小體DNA分析瓊脂糖凝膠電泳應(yīng)用——凋亡細(xì)胞DNA分析瓊脂糖凝膠電泳應(yīng)用——凝膠阻滯分析瓊脂糖凝膠電泳應(yīng)用——凝膠足跡法分析瓊脂糖凝膠電泳應(yīng)用——DNA印跡電泳瓊脂糖凝膠電泳應(yīng)用——正交場(chǎng)脈沖電泳第15頁(yè)，共55頁(yè)，2023年，2月20日，星期四瓊脂糖凝膠電泳應(yīng)用——PCR產(chǎn)物檢測(cè)第16頁(yè)，共55頁(yè)，2023年，2月20日，星期四瓊脂糖凝膠電泳的應(yīng)用——酶切產(chǎn)物電泳檢測(cè)第17頁(yè)，共55頁(yè)，2023年，2月20日，星期四瓊脂糖凝膠電泳的應(yīng)用——RFLP分析第18頁(yè)，共55頁(yè)，2023年，2月20日，星期四瓊脂糖凝膠電泳的應(yīng)用——核小體DNA分析第19頁(yè)，共55頁(yè)，2023年，2月20日，星期四瓊脂糖凝膠電泳的應(yīng)用——凋亡細(xì)胞DNA第20頁(yè)，共55頁(yè)，2023年，2月20日，星期四瓊脂糖凝膠電泳的應(yīng)用——凝膠阻滯分析Gelretardationanalysis第21頁(yè)，共55頁(yè)，2023年，2月20日，星期四瓊脂糖凝膠電泳的應(yīng)用——凝膠足跡法分析第22頁(yè)，共55頁(yè)，2023年，2月20日，星期四瓊脂糖凝膠電泳的應(yīng)用——DNA印跡電泳第23頁(yè)，共55頁(yè)，2023年，2月20日，星期四瓊脂糖凝膠電泳的應(yīng)用——正交場(chǎng)脈沖電泳第24頁(yè)，共55頁(yè)，2023年，2月20日，星期四

基本過程同DNA電泳一樣，但應(yīng)明確一點(diǎn)的是，因?yàn)镽NA分子對(duì)RNA酶的作用非常敏感，因此必須用對(duì)RNA酶有抑制作用DEPC水來配置所有溶液，所有與RNA接觸的儀器和裝置都要嚴(yán)格處理以盡量減少RNA酶對(duì)樣品的降解；另外，因?yàn)镽NA分子有二、三級(jí)結(jié)構(gòu)可以影響其電泳結(jié)果，因此電泳時(shí)應(yīng)在變性劑存在下進(jìn)行，常用的變性劑為甲醛和戊二醛。RNA電泳第25頁(yè)，共55頁(yè)，2023年，2月20日，星期四RNA甲醛變性凝膠電泳圖像第26頁(yè)，共55頁(yè)，2023年，2月20日，星期四

在DNA復(fù)性過程中，如果把不同DNA單鏈分子放在同一溶液中，只要在DNA或DNA的單鏈分子之間有一定的堿基配對(duì)關(guān)系，就可以在不同的分子之間形成雜化雙鏈(heteroduplex)。

這種雜化雙鏈可以在不同的DNA與DNA之間形成，也可以在DNA和RNA分子間或者RNA與RNA分子間形成。這種現(xiàn)象稱為核酸分子雜交。

核酸分子雜交實(shí)質(zhì)是雙鏈DNA的變性和具有同源序列的兩條單鏈的復(fù)性過程。3.2.1核酸分子雜交基本原理

Nucleicacidhybridization第27頁(yè)，共55頁(yè)，2023年，2月20日，星期四核酸分子雜交基本原理第28頁(yè)，共55頁(yè)，2023年，2月20日，星期四第29頁(yè)，共55頁(yè)，2023年，2月20日，星期四DNA-DNA雜交雙鏈分子變性復(fù)性不同來源的DNA分子第30頁(yè)，共55頁(yè)，2023年，2月20日，星期四第31頁(yè)，共55頁(yè)，2023年，2月20日，星期四復(fù)性RNADNA第32頁(yè)，共55頁(yè)，2023年，2月20日，星期四

雜交的雙方是待測(cè)核酸序列及探針。待測(cè)核酸序列可以是基因組DNA,細(xì)胞總RNA或克隆的基因片段等。將標(biāo)記的已知核酸片段作為探針(probe)，與待測(cè)樣本核酸進(jìn)行雜交反應(yīng)，即可觀察到樣本核酸中相應(yīng)的序列。二、探針的種類與標(biāo)記探針(probe)：一小段用同位素、生物素或熒光染料標(biāo)記其末端或全鏈的已知序列的多聚核苷酸，與固定在NC（硝酸纖維素濾膜）膜上的核苷酸結(jié)合，判斷是否有同源的核酸分子存在。探針的選擇與標(biāo)記是雜交技術(shù)成功與否的關(guān)鍵。(一)探針的種類基因探針根據(jù)標(biāo)記方法不同可粗分為放射性探針和非放射性探針兩大類，根據(jù)探針的核酸性質(zhì)不同又可分為DNA探針，RNA探針，cDNA探針等幾類，DNA探針還有單鏈和雙鏈之分。1.基因組DNA探針：DNA探針是最常用的核酸探針，指長(zhǎng)度在幾百堿基對(duì)以上的雙鏈DNA或單鏈DNA探針。第33頁(yè)，共55頁(yè)，2023年，2月20日，星期四

這類探針多為某一基因的全部或部分序列，或某一非編碼序列。這些DNA片段須是特異的，以細(xì)菌為例，要獲得某細(xì)菌特異的核酸探針，通常要采取建立細(xì)菌基因組DNA文庫(kù)的辦法，即將細(xì)菌DNA切成小片段后分別克隆得到包含基因組的全信息的克隆庫(kù)。然后用多種其它菌種的DNA作探針來篩選，產(chǎn)生雜交信號(hào)的克隆被剔除，最后剩下的不與任何其它細(xì)菌雜交的克隆則可能含有該細(xì)菌特異性DNA片段。將此重組質(zhì)粒標(biāo)記后作探針進(jìn)一步鑒定，亦可經(jīng)DNA序列分析鑒定其基因來源和功能。

DNA探針（包括cDNA探針）的主要優(yōu)點(diǎn)有下面三點(diǎn)：①這類探針多克隆在質(zhì)粒載體中，可以無(wú)限繁殖，取之不盡，制備方法簡(jiǎn)便。②DNA探針不易降解（相對(duì)RNA而言），一般能有效抑制DNA酶活性。③DNA探針的標(biāo)記方法較成熟，有多種方法可供選擇，如缺口平移，隨機(jī)引物法，PCR標(biāo)記法等，能用于同位素和非同位素標(biāo)記。第34頁(yè)，共55頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2.cDNA探針：

cDNA是指互補(bǔ)于mRNA的DNA分子。cDNA是由RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄酶催化產(chǎn)生的。利用mRNA反轉(zhuǎn)錄合cDNA，經(jīng)PCR擴(kuò)增可制備大量cDNA探針。比較理想的核酸探針，但不易獲得。3.RNA探針：是一類很有前途的核酸探針，由于RNA是單鏈分子，很少含有重復(fù)序列，所以它與靶序列的雜交反應(yīng)效率極高。來自從細(xì)胞中直接提取mRNA或利用DNA合成儀上合成小片段的RNA。

RNA探針具有DNA探針?biāo)荒鼙葦M的高雜交效率，但RNA探針也存在易于降解和標(biāo)記方法復(fù)雜等缺點(diǎn)。4.寡核苷酸探針:(人工設(shè)計(jì)，合成)

寡核苷酸探針具有一些獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)：①由于鏈短，其序列復(fù)雜度低，分子量小，所以和等量靶位點(diǎn)完全雜交的時(shí)間比克隆探針短。②寡核苷酸探針可識(shí)別靶序列內(nèi)1個(gè)堿基的變化，這是因?yàn)槎烫结樦袎A基的錯(cuò)配能大幅度地降低雜交體的Tm值。③一次可大量合成寡核苷酸探針（1～10mg），使得這種探針價(jià)格低廉。第35頁(yè)，共55頁(yè)，2023年，2月20日，星期四（二）探針的標(biāo)記方法核酸探針的制備是分子雜交技術(shù)的關(guān)鍵。最早采用的也是目前最常用的核酸探針標(biāo)記方法是放射性同位素標(biāo)記。常用的放射性同位素有32P和35S。前者能量高，信號(hào)強(qiáng)，最常用。放射性同位素標(biāo)記探針雖然敏感度高，但卻存在輻射危害和半衰期限制（32P半衰期為14.3天，35S半衰期為87.1天，125I的半衰期為60天），3H的半衰期長(zhǎng)達(dá)12.3年，但它所釋放β放射線能量太低（0.018Mev），只能用于組織原位雜交。

1.

放射性核素的標(biāo)記（1）切口平移法：該技術(shù)由Kelly等于1970年創(chuàng)立。是目前最常用的一種脫氧核糖核酸的探針標(biāo)記法。是利用大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ的多種酶促活性將標(biāo)記的dNTP摻入到新形成的DNA鏈中去，從而合成高比活的均勻標(biāo)記的DNA探針。線狀、超螺旋及帶缺口的雙鏈DNA勻可作為模板。首先，極微量的DNaseⅠ在Mg2+的存在下，在DNA鏈上隨機(jī)形成單鏈切口。利用大腸桿菌DNA聚合酶的5`→3′核酸外切酶活性在切口處將從舊鏈5`—末端逐步切除。同時(shí)，在DNA聚合酶Ⅰ的5`→3′聚合酶活性的催化下，第36頁(yè)，共55頁(yè)，2023年，2月20日，星期四

順序?qū)NTP連接到切口的3`末端—OH上，以互補(bǔ)的DNA單鏈的模板合成新的DNA單鏈。如果在反應(yīng)液中含有一種或多種標(biāo)記的核苷酸（如32P—dCTP），則這些標(biāo)記的核苷酸將替代原來的核苷酸殘基，從而形成高放射性活性的DNA探針。（2）隨機(jī)引物法(randompriming)所謂隨機(jī)引物法是含有各種可能排列順序的寡聚核苷酸片段的混合物，因此它可以與任意核酸序列雜交，起到聚合酶反應(yīng)引物的作用。將待標(biāo)記的DNA探針片段變性后與隨機(jī)引物一起雜交，然后以此雜交的寡核苷酸為引物，在Klenow片段的催化下，合成與探針DNA互補(bǔ)的新DNA鏈。當(dāng)在反應(yīng)液中含有[α-32P]-dNTP時(shí)，即形成放射性核素標(biāo)記的DNA探針。5`3`第37頁(yè)，共55頁(yè)，2023年，2月20日，星期四（3）末端標(biāo)記法：該法需要DNA分子末端帶有羥基，而人工合成寡核苷酸的5`端本身即為羥基。如果要標(biāo)記的DNA分子的5`端為磷酸基團(tuán)，必須用堿性磷酸酶催化切除5`末端的磷酸基團(tuán)，然后才能標(biāo)記。其原理利用多核苷酸激酶將[r-32P]ATP分子上r位磷酸基轉(zhuǎn)移至寡核苷酸鏈的5`末端，也可在3`端標(biāo)記。2.

非放射性的標(biāo)記法按標(biāo)記方法不同，可分為兩類：一種是預(yù)先已連接在NTP或dNTP上，因此可象放射性核素標(biāo)記的核苷酸一樣用酶促聚合方法摻入到核酸探針上，如生物素、地高辛等。另一類是直接與核酸進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)而連接在核酸上，即化學(xué)標(biāo)記法。（1）生物素標(biāo)記探針：生物素可與dUTP共價(jià)結(jié)合，用其標(biāo)記的dUTP可代替dTTP摻入DNA探針，該探針能與抗生物素蛋白特異結(jié)合，而抗生物素蛋白上結(jié)合堿性磷酸酶可使反應(yīng)中的底物顯色，從而指示探針?biāo)谖恢谩９饷羯锼貥?biāo)記核酸，方法簡(jiǎn)單，靈敏度也可達(dá)到pg水平，可用于外源基因的檢測(cè)。（2）地高辛配基標(biāo)記探針：用地高辛標(biāo)記過的dUTP可代替dTTP摻入DNA探針，可與酶或熒光色素結(jié)合的地高辛配基抗體直接檢測(cè)，或間接使用免疫熒光法進(jìn)行檢測(cè)。

第38頁(yè)，共55頁(yè)，2023年，2月20日，星期四克隆DNA序列檢測(cè)菌落噬菌斑原位雜交法雜交探針的標(biāo)記：ABC熒光標(biāo)記GCTTGAGCAGTAACCTG熒光胺Biotin生物素Avidin生物素結(jié)合蛋白烷烴連接臂第39頁(yè)，共55頁(yè)，2023年，2月20日，星期四克隆DNA序列檢測(cè)菌落噬菌斑原位雜交法雜交探針的標(biāo)記：ABC顯色酶標(biāo)記GCTTGAGCAGTAACCTG顯色酶Biotin生物素Avidin生物素結(jié)合蛋白烷烴連接臂生色底物顏色產(chǎn)物第40頁(yè)，共55頁(yè)，2023年，2月20日，星期四克隆DNA序列檢測(cè)菌落噬菌斑原位雜交法雜交探針的標(biāo)記：地高辛系統(tǒng)標(biāo)記dUTP-連接臂-甾醇半抗原digoxigeninDIG抗體-顯色酶交聯(lián)復(fù)合物第41頁(yè)，共55頁(yè)，2023年，2月20日，星期四（3）辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記探針：將HRP與聚乙烯亞胺結(jié)合，然后與DNA結(jié)合，產(chǎn)生酶標(biāo)記的探針，雜交后利用酶促反應(yīng)使底物顯色即可指示探針位置。

三、核酸分子雜交技術(shù)(類型：液相雜交和固相雜交。)液相雜交指使變性的待測(cè)核酸單鏈與標(biāo)記的探針在溶液中保溫，使之形成雜交復(fù)合物。反應(yīng)結(jié)束后，用羥磷灰石法或酶解法將未被雜交的單鏈和雜交雙鏈分開，然后計(jì)算雜交分子中的探針量，就可推算出被測(cè)的核酸量。固相雜交（solid-phasehybridization）是將變性的DNA固定于固體基質(zhì)（硝酸纖維素膜或尼龍濾膜）上，再與探針進(jìn)行雜交，故也稱為膜上印跡雜交。印跡方法：1)可直接將核酸樣品點(diǎn)樣于固相支持物上，稱為斑點(diǎn)及狹縫印跡雜交(dot/slotblothybridization);2)毛細(xì)轉(zhuǎn)移:本方法由Southern發(fā)明,故稱為:Southern(blothybridization)印跡。毛細(xì)管轉(zhuǎn)移方法的優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)單,不需要用其它儀器。缺點(diǎn)是轉(zhuǎn)移時(shí)間較長(zhǎng),轉(zhuǎn)移后雜交信號(hào)較弱。3)利用電場(chǎng)作用的電轉(zhuǎn)移法；4)利用真空抽濾作用的真空轉(zhuǎn)移法。第42頁(yè)，共55頁(yè)，2023年，2月20日，星期四

液相核酸分子雜交第43頁(yè)，共55頁(yè)，2023年，2月20日，星期四第44頁(yè)，共55頁(yè)，2023年，2月20日，星期四

第45頁(yè)，共55頁(yè)，2023年，2月20日，星期四（一）Southern轉(zhuǎn)移印跡雜交法

第46頁(yè)，共55頁(yè)，2023年，2月20日，星期四分子雜交實(shí)驗(yàn)①②③目錄第47頁(yè)，共55頁(yè)，2023年，2月20日，星期四目錄雞的β肌球蛋白的克隆和檢出第48頁(yè)，共55頁(yè)，2023年，2月20日，星期四DNA印跡雜交第49頁(yè)，共55頁(yè)，2023年，2月20日，星