原生質體融合育種

原生質體融合育種第1頁，共60頁，2023年，2月20日，星期四本節(jié)重點原生質體融合親本及其遺傳標記的選擇原生質體制備原生質體融合檢出融合體的方法第2頁，共60頁，2023年，2月20日，星期四本節(jié)難點融合體和重組體的檢出及鑒別的方法提高重組效率的方法第3頁，共60頁，2023年，2月20日，星期四第1節(jié)微生物雜交育種概念：雜交育種通過微生物雜交將不同菌株的遺傳物質進行交換、重組，使不同菌株的優(yōu)良特性集中于一個重組體中。第4頁，共60頁，2023年，2月20日，星期四雜交甲

生長快、產量低乙生長慢、產量高生長快、產量高第5頁，共60頁，2023年，2月20日，星期四應用

面包酵母:對麥芽糖及葡萄糖的發(fā)酵力強，產生CO2多，生長快；

酒精酵母:產酒率高，而對麥芽糖、葡萄糖的發(fā)酵力弱

雜交:就得到了既能生產酒精，又能將其殘余菌體用作面包廠和家用發(fā)面酵母的優(yōu)良菌種。第6頁，共60頁，2023年，2月20日，星期四雜交育種的優(yōu)點：可將兩個或多個優(yōu)良性狀集中在一個個體上。由于雜交育種選用了已知性狀的供體菌和受體菌作為親本，因此，不論在方向性還是自覺性方面，均比誘變育種前進了一大步。利用雜交育種往往還可以消除某一菌株在經過長期誘變處理后所出現(xiàn)的產量上升緩慢的現(xiàn)象。雜交育種有助于總結遺傳物質的轉移和傳遞規(guī)律，豐富和促進遺傳學理論的發(fā)展。第7頁，共60頁，2023年，2月20日，星期四雜交育種缺陷：只能利用已有的基因組，并不能產生新的基因；雜交進程緩慢，過程繁瑣，育種時間長；只能進行本物種或親緣關系較近的物種雜交，不能克服遠源雜交不親和的障礙。

第8頁，共60頁，2023年，2月20日，星期四微生物雜交的方式原核：接合原生質體融合真核：有性雜交準性雜交原生質體融合第9頁，共60頁，2023年，2月20日，星期四第2節(jié)原生質體融合育種原生質體:脫去細胞壁的植物、真菌或細菌細胞。第10頁，共60頁，2023年，2月20日，星期四原生質體融合原生質體融合（protoplastfusion）是20世紀70年代發(fā)展起來的育種技術。用水解酶除去遺傳物質轉移的最大障礙—細胞壁，制成由原生質膜包被的裸細胞，然后用物理、化學或生物學方法，誘導遺傳特性不同的兩親本原生質體融合，經染色體交換、重組而達到雜交的目的，經篩選獲得集雙親優(yōu)良性狀于一體的穩(wěn)定融合子。第11頁，共60頁，2023年，2月20日，星期四MicrobeAMicrobeBADDENZYME第12頁，共60頁，2023年，2月20日，星期四第13頁，共60頁，2023年，2月20日，星期四ADDFUSIONPROMOTER第14頁，共60頁，2023年，2月20日，星期四原生質體融合第15頁，共60頁，2023年，2月20日，星期四融合后再生第16頁，共60頁，2023年，2月20日，星期四原生質體融合后基因重組第17頁，共60頁，2023年，2月20日，星期四與常規(guī)雜交相比，原生質體融合具有多方面的優(yōu)勢

大幅度提高親本之間重組頻率。擴大重組的親本范圍。原生質體融合時親本整套染色體參與交換，遺傳物質轉移和重組性狀較多，集中雙親本優(yōu)良性狀機會更大。第18頁，共60頁，2023年，2月20日，星期四不足之處原生質體融合后DNA交換和重組隨機發(fā)生，增加重組體分離篩選的難度。細胞對異體遺傳物質的降解和排斥作用，以及遺傳物質非同源性等因素也會影響原生質體融合的重組頻率，使遠緣融合雜交存在較大困難。第19頁，共60頁，2023年，2月20日，星期四第3節(jié)原生質體融合育種的步驟一、直接親本及其遺傳標記的選擇二、原生質體制備與再生三、原生質體融合四、融合體再生與檢出五、重組體檢出鑒別與遺傳特性分析第20頁，共60頁，2023年，2月20日，星期四

一、直接親本及其遺傳標記的選擇原生質體融合的親本應采用具有較大遺傳差異的近親菌株，重組后的新個體具有更大的雜種優(yōu)勢。第21頁，共60頁，2023年，2月20日，星期四一、直接親本及其遺傳標記的選擇作為原生質體融合的二親本菌株都應該帶有一定的遺傳標記，便于重組體的檢出。常用遺傳標記：（何謂“遺傳標記”）營養(yǎng)缺陷抗性熱致死（滅活）孢子顏色菌落形態(tài)第22頁，共60頁，2023年，2月20日，星期四熱致死（滅活）把雙親中任何一方的原生質體用熱滅活（如50℃，2h或60℃，5min)或用紫外線、藥物滅活，使細胞內的某些酶或代謝途徑鈍化（核酸不變性），然后和另一方具有正?；钚缘脑|體融合而獲得重組體。采用滅活標記融合頻率較低，但重組體產量較高。

滅活正?；钚哉；钚哉；钚詿o活性AB第23頁，共60頁，2023年，2月20日，星期四

二、原生質體制備與再生（一）原生質體制備制備大量具有活性的原生質體是微生物原生質體融合育種的前提。第24頁，共60頁，2023年，2月20日，星期四1.原生質體制備方法機械法、非酶分離法和酶法。采用前兩種方法制備的原生質體效果差，活性低，僅適用于某些特定菌株。最有效和最常用的是酶法。該法時間短，效果好。第25頁，共60頁，2023年，2月20日，星期四ProtoplastfusionProtoplastfusionallowsgeneticimprovement(randommutation&recombination)ofasexualmicro-organismsprotoplastspreparation:cellsaregrowninisotonicsolutionwhileinhibitinggrowthofcellwall,andpartlydissociationit(lysozyme)第26頁，共60頁，2023年，2月20日，星期四

2.原生質體的鑒定(1)低滲爆破法：直接在顯微鏡下觀察原生質體在低滲溶液中吸水膨脹、破裂的過程。第27頁，共60頁，2023年，2月20日，星期四2.原生質體的鑒定(2)熒光染色法：原生質體混懸液用熒光增白劑（VBL）染色，洗滌后在熒光顯微鏡下觀察，發(fā)出紅色光則為完全原生質體，發(fā)出綠色光則表明還有細胞壁成分存在。（區(qū)別細胞壁與細胞膜的不同）第28頁，共60頁，2023年，2月20日，星期四

3.原生質體的收集和純化純化方法有以下幾種（這些方法基于什么原理？）(1)過濾法(2)密度梯度離心法(3)界面法(4)漂浮法通常采用離心法。第29頁，共60頁，2023年，2月20日，星期四(1)過濾法根據(jù)細胞大小，選用孔徑略小于細胞的砂芯漏斗，過濾。原生質體由于外層細胞膜柔軟可變形，可以由比它小的微孔中穿過，而未酶解細胞或細胞團卻不能。第30頁，共60頁，2023年，2月20日，星期四(2)密度梯度離心法用蔗糖或氯化銫等制成濃度（密度）梯度溶液，由于密度差別，經離心后原生質體漂浮于上部，未酶解細胞和細胞碎片沉于溶液下部。原生質體細胞碎片、未酶解細胞第31頁，共60頁，2023年，2月20日，星期四(3)界面法原理：選兩種不同濃度的溶液，其中一種溶液密度大于原生質體的密度，另一種溶液小于原生質體的密度。離心后原生質體就集中在兩層液面交界處而得到純化。原生質體13%甘露醇溶液25%蔗糖溶液第32頁，共60頁，2023年，2月20日，星期四(4)漂浮法適用于一些細胞較大的微生物。原生質體與細胞比重不同，原生質體的比重小于細胞，能在一定濃度的溶液中漂浮在液面上，從而得到純化。第33頁，共60頁，2023年，2月20日，星期四

4.原生質體的活力鑒定分離純化后的原生質體，用作再生或融合等育種的出發(fā)材料，必須具有活力及再生能力，因此需要進行活力鑒定。原生質體活力鑒定方法主要有：（注意區(qū)別）①熒光素雙醋酸鹽染色法②酚藏花紅染色法③伊文思藍染色法第34頁，共60頁，2023年，2月20日，星期四①熒光素雙醋酸鹽（FDA）染色法FDA本身不發(fā)熒光，被細胞吸收脂解后產生具有熒光的物質。能發(fā)出熒光的原生質體具有活性；（吸收-代謝-呈色）第35頁，共60頁，2023年，2月20日，星期四②酚藏花紅染色法活性原生質體能吸收酚藏花紅染料而成紅色，無活性的死細胞不能吸收染料呈白色;（吸收-呈色）③伊文思藍染色法活性原生質體不吸附染料為無色，死的無活性細胞吸附染料呈藍色。（不吸收-呈色）第36頁，共60頁，2023年，2月20日，星期四5.原生質體的保存原生質體新鮮程度與其活性有關。如果不是立即使用，則必須在低溫下保存。但是保藏時間很短。第37頁，共60頁，2023年，2月20日，星期四

（二）原生質體再生原生質體融合試驗之前必須摸索出最佳的再生條件和完成再生實驗，為融合體再生和復原做好準備。原生質體必須重新合成細胞壁物質，恢復至完整細胞形態(tài)，才能進一步生長、分裂和增殖，這一過程就是原生質體的再生。第38頁，共60頁，2023年，2月20日，星期四影響原生質體再生的因素（略）菌體生理狀態(tài)穩(wěn)定劑酶濃度與酶作用時間再生培養(yǎng)基的組成原生質體的密度……第39頁，共60頁，2023年，2月20日，星期四

三、原生質體融合（一）融合劑和融合手段化學融合劑，普遍采用PEG介導的化學融合法。在PEG介導融合時，通常需要一定濃度的Ca2+和Mg2+，能更有效地促進融合。第40頁，共60頁，2023年，2月20日，星期四（一）融合劑和融合手段物理融合手段，電融合細胞產生偶極化，原生質體相互粘連，細胞沿電力方向排列成串；在外加瞬間高頻直流強電壓作用下，擾亂原生質體膜的分子排列，使之穿孔，然后發(fā)生原生質體膜復原過程，原生質體發(fā)生融合。第41頁，共60頁，2023年，2月20日，星期四電場作用下原生質膜被擊穿的過程第42頁，共60頁，2023年，2月20日，星期四

（二）原生質體融合過程在高滲穩(wěn)定液中，兩個或兩個以上凝聚成團，相鄰原生質體緊密接觸的質膜面擴大，相互接觸的質膜消失，細胞質融合，形成一個異核體細胞；第43頁，共60頁，2023年，2月20日，星期四

四、融合體再生與檢出（一）融合體再生融合體的再生，包括融合體細胞壁合成、重建和融合體的再生。原生質體復原后，細胞的生理和生物學特性可恢復正常狀態(tài)。但一些質?？赡軙撀洹５?4頁，共60頁，2023年，2月20日，星期四（二）融合體的檢出與分離利用營養(yǎng)缺陷型標記選擇融合體利用抗藥性選擇融合體利用滅活原生質體檢出融合體利用熒光染色法選擇融合體利用雙親對碳源利用不同而檢出融合體√××ABABAABB第45頁，共60頁，2023年，2月20日，星期四

1．利用營養(yǎng)缺陷型標記選擇融合體融合的雙親帶有不同營養(yǎng)缺陷型標記，在基本培養(yǎng)基上只有融合體生長而雙親本原生質體不能形成菌落。此法較為準確可靠，缺點是易使部分表型延遲的融合體漏選、工作量大，且營養(yǎng)缺陷型標記會使親本的優(yōu)良性狀喪失或降低。融合體AB第46頁，共60頁，2023年，2月20日，星期四

2.利用抗藥性選擇融合體微生物的抗藥性是菌種的重要特性。不同種的微生物對某一種藥物的抗性存在差異。應用此法要注意藥物的濃度，過高會使融合頻率降低，過低則會使親本生長，影響融合體的檢出。AmprKanr融合體AmprKanrAB第47頁，共60頁，2023年，2月20日，星期四

3.利用滅活原生質體檢出融合體產朊假絲酵母原生質體與釀酒酵母原生質體融合時，用碘乙酸使產朊假絲酵母原生質體滅活，然后雙親原生質體融合，利用形態(tài)差異選擇融合體。滅活法的不足之處：菌絲碎片或未酶解的完整細胞具有更強的抗性，在選擇培養(yǎng)基會優(yōu)先形成菌落，從而抑制融合體生長。第48頁，共60頁，2023年，2月20日，星期四

4.利用熒光染色法選擇融合體熒光染色法是事先使雙親染色而攜帶不同熒光色素標記，然后在顯微操作器和熒光顯微鏡下，挑取同時帶有雙親原生質體熒光標記的融合體。第49頁，共60頁，2023年，2月20日，星期四

5.利用雙親對碳源利用不同而檢出融合體利用親株對各種碳源利用差異，結合其他特性分離篩選融合體。不利用木糖，抗放線菌酮能利用木糖，對放線菌酮敏感含有木糖和放線菌酮的選擇培養(yǎng)基上檢出融合體第50頁，共60頁，2023年，2月20日，星期四

6．融合體的其他選擇方法①利用某些微生物對昆蟲的毒力進行選擇（略）；②通過形態(tài)差異進行融合體選擇。這一方法首先要求所采用的菌株具有可供肉眼直接觀察的形態(tài)學差異；③通過生化測定指標選擇融合體。通常測定的生化項目有DNA含量、氨基酸含量、酸性磷酸酶、同工酶電泳等。實際應用中往往是將上述這些方法結合使用。如將營養(yǎng)缺陷型與抗藥性，抗藥性與原生質體滅活等相結合選擇融合體。融合體檢出后，還要結合一些生化分析方法對其進一步鑒定。第51頁，共60頁，2023年，2月20日，星期四五、重組體檢出鑒別與遺傳特性分析雙親融合后形成的融合體不等于重組體，而可能是異核體或雜合二倍體。異核體細胞在繁殖過程中發(fā)生核的融合，形成雜合二倍體，通過染色體交換，產生各種重組體。（異核體-雜合二倍體-重組體）異核體、雜合體以及重組體都能在選擇培養(yǎng)基上生長。單倍體單倍體繁殖傳代異核體雜合體單倍體化第52頁，共60頁，2023年，2月20日，星期四重組體常用的鑒別方法菌體或孢子形態(tài)和大小的比較；DNA含量的測定比較；同工酶電泳譜帶的比較；酶活性的測定；代謝產物組成和產量的分析比較與測定；對營養(yǎng)物質的利用以及超微結構的變化等。第53頁，共60頁，2023年，2月20日，星期四第4節(jié)基因組改組育種基因組改組=誘變育種+多親本遞推原生質體融合多親本遞推原生質體融合的特點：多個帶有不同遺傳性狀的親本，一般4-11個親本；遞推式：融合重組后代可重復進行第二輪、第三輪，甚至更多輪融合。第54頁，共60頁，2023年，2月20日，星期四GenomeShufflingE.coliK12第55頁，共60頁，2023年，2月20日，星期四Whygenomeshuffling?傳統(tǒng)誘變育種與基因組改組育種比較Y.Zhang,etal.2002.Nature(415):644-646.第56頁，共60頁，2023年，2月20日，星期四FourmultipleauxotrophesofStreptomyces(“one-marker”)phenotype Arg Cys Pro Ura “marker”(prototrophy)parent-1 - - - + (U)parent-2 - - + - (P)parent-3 - + - - (C)parent-4 + - - - (A)Progeny(protoplasthybrids)“two-marker” + + - - (AC,AP,AU,CP,CU,PU)“three-marker” + + + - (ACP,ACU,APU,CPU)“four-marker” + + + + (ACPU)第57頁，共60頁，2023年，2月20日，星期四FourmultipleauxotrophesofStreptomyces(“one-marker”)phenotype Arg Cys Pro Ura “marker”(prototrophy)parent-1 - - - + (U)parent-2 - - + - (P)parent-3 - + - - (C)p