微生物的利用

微生物的利用第1頁/共24頁第一部分

微生物的利用實驗一大腸桿菌的培養(yǎng)和分離第2頁/共24頁實驗?zāi)康?.進(jìn)行大腸桿菌的擴(kuò)增，利用液體培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)的操作2.進(jìn)行大腸桿菌的分離，用固體平面培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)菌的劃線培養(yǎng)3.說明大腸桿菌培養(yǎng)的條件和實驗原理第3頁/共24頁一.基礎(chǔ)知識（一）微生物（二）微生物培養(yǎng)基（三）無菌技術(shù)二.微生物實驗所需的操作技術(shù)三.大腸桿菌的培養(yǎng)和分離實驗四.課題小結(jié)第4頁/共24頁1.1微生物結(jié)構(gòu)都相當(dāng)簡單，個體多數(shù)十分微小，通常要用光學(xué)顯微鏡或電子顯微鏡才能看到，有的甚至沒有細(xì)胞結(jié)構(gòu)。且體內(nèi)一般不含有葉綠素，不能進(jìn)行光合作用五類病毒細(xì)菌放線菌真菌原生動物病毒界原核生物界真菌界原生生物界1.1.1微生物的特點1.1.2微生物的種類1.1.3細(xì)菌的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和菌落第5頁/共24頁1.1.3細(xì)菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)和菌落圖1-1常見的三種細(xì)菌典型形態(tài)A.球菌B.桿菌C.弧菌單細(xì)胞不分枝的原核微生物，細(xì)菌細(xì)胞微小而透明，通常用適當(dāng)染料染色后顯微鏡觀察1.1.3.1細(xì)菌的形態(tài)1.1.3.2細(xì)菌的結(jié)構(gòu)基本結(jié)構(gòu)：細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞質(zhì)中有液泡、儲存性顆粒、核質(zhì)等附屬結(jié)構(gòu)：鞭毛、纖毛、莢膜、芽孢（抗逆休眠體）等1.1.3.3菌落革蘭氏染色：陽性或陰性，細(xì)胞壁成分不同第6頁/共24頁1.1.3.3菌落單個或少數(shù)細(xì)菌在固體培養(yǎng)基上大量繁殖時，就會形成一個肉眼可見的，具有一定形態(tài)結(jié)構(gòu)的子細(xì)胞群體，叫做菌落細(xì)菌的菌落特征因種而異

菌落是鑒定菌種的重要依據(jù)大腸桿菌大腸菌群第7頁/共24頁1.2微生物培養(yǎng)基培養(yǎng)基（培養(yǎng)液）是微生物生存的環(huán)境和營養(yǎng)物質(zhì)1.2.1培養(yǎng)基的分類（按物理形態(tài)分）（1）液體培養(yǎng)基（液）（2）半固體培養(yǎng)基（3）固體培養(yǎng)基添加的瓊脂量決定1.2.2培養(yǎng)基所含的成分（1）水（2）無機(jī)鹽（3）碳源（4）氮源（5）生長因子含碳無機(jī)物或有機(jī)物，后者通常可作能源含氮無機(jī)鹽或有機(jī)物，用于合成氨基酸等生長必需，而自身不能合成的化合物不同微生物所需無機(jī)鹽、碳源、氮源和生長因子的種類不同培養(yǎng)基需要調(diào)節(jié)pH、滲透壓、控制含氧量等條件細(xì)菌：用蛋白胨和酵母提取物配制霉菌：用無機(jī)物或添加蔗糖的豆芽汁配制細(xì)菌：中性偏堿（7.5~8.5）霉菌：中性偏酸（5.0~6.0）通常用NaCl調(diào)節(jié)第8頁/共24頁1.3無菌技術(shù)1.3.1獲得純凈微生物培養(yǎng)物的關(guān)鍵防止外來雜菌的入侵1.3.2無菌技術(shù)的四個方面（1）對實驗操作空間、操作者的衣著和手進(jìn)行清潔和消毒

（2）將培養(yǎng)器皿、接種用具和培養(yǎng)基等器具進(jìn)行滅菌（3）為避免周圍微生物污染，實驗操作應(yīng)在酒精燈火焰附近旁進(jìn)行（4）避免已滅菌處理的材料用具與周圍物品相接觸1.3.3消毒與滅菌第9頁/共24頁1.3.3.1消毒使用較為溫和的物理或化學(xué)方法僅殺死物體表面或內(nèi)部一部分對人體有害的微生物一般不能殺死芽孢和孢子常用消毒方法常用于牛奶的消毒煮沸消毒法巴氏消毒法紫外線消毒化學(xué)藥劑消毒法酒精、氯氣、石碳酸、煤酚皂溶液等第10頁/共24頁在充分燃燒層灼燒1.3.3.2滅菌使用強(qiáng)烈的理化因素殺死物體內(nèi)外所有的微生物，包括芽孢和孢子常用滅菌方法和適用范圍灼燒滅菌干熱滅菌高壓蒸汽滅菌微生物的接種工具（接種環(huán)、接種針）或其他金屬用具能耐高溫的需要保持干燥的物品（玻璃器皿）160－170℃；1－2h100kPa121℃15—30min最常用方式，通常用于培養(yǎng)基的滅菌及各種器具的滅菌第11頁/共24頁2.微生物實驗所需的操作技術(shù)2.1器具的滅菌2.2培養(yǎng)液（基）的配置、滅菌，放斜面和倒平板技術(shù)2.3細(xì)菌的接種和純化技術(shù)棉花塞口牛皮紙（或報紙）包口或包扎60~80℃烘干121℃（1Kg/cm2）滅菌15min不能用脫脂棉：易吸水后導(dǎo)致污染2.3.1平板劃線法2.3.2稀釋涂布平板法簡便，常用效果好第12頁/共24頁2.2培養(yǎng)液的配置、滅菌，放斜面和倒平板技術(shù)

2.2.1配置LB（Luria-Bertani，溶菌肉湯）培養(yǎng)基配方蛋白胨：0.5g酵母提取物：0.25gNaCl：0.5g水：50mL瓊脂：1g（固體）pH：7.4～7.6配制過程計算、稱量混合加熱溶化NaOHHCl調(diào)pH（7．6）分裝三角漏斗分三角瓶試管棉塞或封口膜加塞包扎通氣；阻止微生物進(jìn)入牛皮紙滅菌高壓蒸汽1Kg/cm2，121℃，15min放斜面倒平板未凝固時固體培養(yǎng)基第13頁/共24頁分裝、放斜面、倒平板分裝培養(yǎng)基不能沾上塞子、管口和管壁易導(dǎo)致污染固體分裝試管，培養(yǎng)液不超過管高1/5便于放斜面液體分裝三角瓶，一般培養(yǎng)基高度為瓶高1/4左右本實驗中，將50mL液體LB培養(yǎng)基和50mL固體LB培養(yǎng)基分別裝入2個250mL三角瓶中，加封口膜（或棉塞）放斜面固體培養(yǎng)基置于試管中滅菌后，斜靠在平放鉛筆上，冷卻倒平板培養(yǎng)接種用菌種超凈臺和雙手消毒點燃酒精燈創(chuàng)造無菌環(huán)境倒平板操作第14頁/共24頁倒平板操作倒平板操作中的問題討論第15頁/共24頁倒平板操作中的問題討論

（1）培養(yǎng)基滅菌后，需要冷卻到50℃左右時，才能用來倒平板。你用什么辦法來估計培養(yǎng)基的溫度？（2）為什么需要使錐形瓶的瓶口通過火焰？（3）平板冷凝后，為什么要將平板倒置？（4）在倒平板的過程中，如果不小心將培養(yǎng)基濺在皿蓋與皿底之間的部位，這個平板還能用來培養(yǎng)微生物嗎？為什么？可以用手觸摸盛有培養(yǎng)基的錐形瓶，感覺錐形瓶的溫度下降到剛剛不燙手時，就可以進(jìn)行倒平板了通過灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基平板冷凝后，皿蓋上會凝結(jié)水珠，凝固后的培養(yǎng)基表面的濕度也比較大，將平板倒置，既可以使培養(yǎng)基表面的水分更好地?fù)]發(fā)，又可以防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染空氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之間的培養(yǎng)基上滋生，因此最好不要用這個平板培養(yǎng)微生物第16頁/共24頁2.3.1平板劃線法平板劃線法操作中的問題討論第17頁/共24頁平板劃線法操作的問題討論1平板劃線的具體方法連續(xù)劃線法

交叉劃線法213平板劃線的具體方法（1）為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)？在劃線操作結(jié)束時，仍然需要灼燒接種環(huán)嗎？為什么？每次劃線前灼燒接種環(huán)是為了殺死上次劃線結(jié)束接種環(huán)上殘留的菌種，使下一次劃線的菌種直接來源于上次劃線的末端，使每次劃線時菌種的數(shù)目逐漸減少，以便得到菌落。結(jié)束后要灼燒接種環(huán)以及時殺死殘留的菌種，避免污染環(huán)境和感染操作者單菌落123460—70°第18頁/共24頁平板劃線法操作的問題討論2（2）在灼燒接種環(huán)之后，為什么要等其冷卻后再進(jìn)行劃線？（3）在作第二次以及其后的劃線操作時，為什么總是從上一次劃線的末端開始劃線？以免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種線條末端細(xì)菌的數(shù)目較少，這樣操作能使細(xì)菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐步減少，最終得到由單個細(xì)菌繁殖而來的菌落（4）為什么平板劃線時不能劃破培養(yǎng)基表面？一是劃破后會造成劃線不均勻，難以達(dá)到分離單菌落的目的二是存留在劃破處的單個細(xì)胞無法形成規(guī)矩的菌落，菌落會沿著劃破處生長，會形成一個條狀的菌落第19頁/共24頁2.3.2稀釋涂布平板法操作方法梯度稀釋

涂布分離問題：涂布平板的所有操作都應(yīng)在火焰附近進(jìn)行。結(jié)合平板劃線與系列稀釋的無菌操作要求，想一想，第2步應(yīng)如何進(jìn)行無菌操作？第20頁/共24頁3.大腸桿菌的培養(yǎng)和分離實驗3.1設(shè)備及用品滅菌鍋或高壓鍋、250ml的三角瓶、封口膜和橡皮圈、直徑90mm的培養(yǎng)皿、接種環(huán)和玻璃三角刮刀、恒溫培養(yǎng)箱、搖床、酒精燈和超凈臺、一次性塑料手套、裝有酒精棉球的廣口瓶、鑷子、有棉塞的試管（15mm×120mm）5支3.2實驗材料（1）50mlLB液體培養(yǎng)基：蛋白胨0.5g、酵母提取物0.25g、NaCl0.5g、加水50ml（2）大腸桿菌菌種斜面（3）空白斜面3.3實驗過程3.4課題成果評價革蘭氏陰性，兼性厭氧菌第21頁/共24頁3.3實驗過程1.配制LB培養(yǎng)基2.滅菌LB液體培養(yǎng)基LB固體培養(yǎng)基各50mL，三角瓶3.倒平板固體冷卻成平板培養(yǎng)基4個培養(yǎng)皿液體4.接種擴(kuò)大培養(yǎng)1.培養(yǎng)基冷卻2.接種環(huán)燒灼3.接種環(huán)在菌種斜面培養(yǎng)基上冷卻4.挑取菌種接種到液體培養(yǎng)基中5.37℃搖床震蕩培養(yǎng)12h培養(yǎng)的大腸桿菌菌種5.平板劃線分離37℃培養(yǎng)24h4℃保存6.單菌落接種6.菌種培養(yǎng)、保存1.挑取單菌落菌種2.斜面連續(xù)劃線酒精燈旁操作細(xì)菌培養(yǎng)分離視頻第22頁/共24頁3.4課題成果評價培養(yǎng)基的制作是否合格接種操作是否符合無菌要求是否進(jìn)行了及時細(xì)致的觀察與記錄如果未接種的培養(yǎng)基在恒溫箱中保溫1～2d后無菌落生長，說明培養(yǎng)基的制備是成功的，否則需要