基因工程及其在醫(yī)學中的應用

基因工程及其在醫(yī)學中的應用1第1頁，共74頁，2023年，2月20日，星期四第一節(jié)

基因工程2第2頁，共74頁，2023年，2月20日，星期四目的①分離獲得某一感興趣的基因或DNA②獲得感興趣基因的表達產(chǎn)物（蛋白質(zhì)）基因工程(geneticengineering)

——將體外分離或人工合成的DNA與載體DNA連接，形成重組DNA，然后轉(zhuǎn)化細菌或轉(zhuǎn)染真核細胞宿主，通過篩選得到能表達重組DNA的活細胞，純化后，穩(wěn)定地擴增、傳代和表達?；蚬こ痰母拍?/p>

3第3頁，共74頁，2023年，2月20日，星期四基因工程基本原理4第4頁，共74頁，2023年，2月20日，星期四基因工程操作流程①載體的構(gòu)建和選擇；②目的基因的制備；③限制性內(nèi)切酶酶切載體和目的基因形成相匹配的接口；④DNA連接酶連接載體和目的基因；⑤重組DNA轉(zhuǎn)化入細胞；⑥擴增；⑦篩選和鑒定重組子；⑧表達，純化蛋白5第5頁，共74頁，2023年，2月20日，星期四基因工程載體制備的目的基因或外源性DNA片段必須與合適的載體連接形成重組體，才能進入受體細胞并進行復制和表達。

載體：指能攜帶外源DNA片段導入宿主細胞進行擴增或表達的工具。載體的本質(zhì)為DNA。6第6頁，共74頁，2023年，2月20日，星期四基因工程載體的一般要求①能夠自我復制，產(chǎn)生大量拷貝，裝載目的基因后使后者能得到大量擴增；②載體DNA在提純分離中容易和宿主細胞的染色體DNA分開；③本身分子量較小，容易操作，可裝載較大分子量的目的基因；④具有多個單一限制性內(nèi)切酶酶切位點，便于目的基因的插入；⑤含有一個或多個篩選標記，目的基因插入、轉(zhuǎn)化細菌后可以通過抗生素抗性、營養(yǎng)缺陷或顯色表型反應等進行篩選；⑥穩(wěn)定地在子代細胞中復制或表達。7第7頁，共74頁，2023年，2月20日，星期四8第8頁，共74頁，2023年，2月20日，星期四載體分類按載體來源分為:質(zhì)粒噬菌體病毒按載體用途分為:克隆載體表達載體按載體的宿主細胞分為:原核克隆/表達載體真核克隆/表達載體9第9頁，共74頁，2023年，2月20日，星期四1.質(zhì)粒

(plasmid)特點能在宿主細胞內(nèi)獨立自主復制；帶有某些遺傳信息,會賦予宿主細胞一些遺傳性狀。10第10頁，共74頁，2023年，2月20日，星期四目錄11第11頁，共74頁，2023年，2月20日，星期四pUC18/1912第12頁，共74頁，2023年，2月20日，星期四λ噬菌體DNA改造系統(tǒng)λgt系列（插入型，適用cDNA克?。〦MBL系列（置換型，適用基因組克?。?.噬菌體(phage)M13噬菌體DNA改造系統(tǒng)（含lacZ基因）M13mp系列pUC系列13第13頁，共74頁，2023年，2月20日，星期四14第14頁，共74頁，2023年，2月20日，星期四病毒載體質(zhì)粒和噬菌體載體只能在細菌中繁殖，不能滿足真核DNA重組需要。感染動物的病毒可改造用作動物細胞的載體。由于動物細胞的培養(yǎng)和操作較復雜、花費也較多，因而病毒載體構(gòu)建時一般都把細菌質(zhì)粒復制起始序列放置其中。使載體及其攜帶的外來序列能方便地在細菌中繁殖和克隆，然后再引入真核細胞。目前病毒載體常用包括：如腺病毒載體、腺相關(guān)病毒載體、逆轉(zhuǎn)入病毒載體、慢病毒載體以及用于昆蟲病毒表達的桿狀病毒載體等。15第15頁，共74頁，2023年，2月20日，星期四目的基因的獲取人工合成基因文庫cDNA文庫PCR擴增16第16頁，共74頁，2023年，2月20日，星期四條件：已知目的基因核酸序列或蛋白質(zhì)序列?；蜉^小人工合成17第17頁，共74頁，2023年，2月20日，星期四人工合成基因的局限性長度有限密碼子兼并性二級結(jié)構(gòu)影響拼接費用較高18第18頁，共74頁，2023年，2月20日，星期四二、基因組文庫的構(gòu)建應用核酸的分離純化技術(shù)，直接從生物體組織和細胞中將全部DNA提取出來，然后用限制性內(nèi)切酶隨機地將DNA酶切成20kb~40kb或更大的數(shù)以萬計的片段。將所有的片段與同一類載體連接重組，得到數(shù)以萬計的重組體，再全部轉(zhuǎn)化入宿主細胞進行擴增和保存。這種含有所有DNA克隆的混合體就是基因文庫。需要制備目的基因時，可以通過探針或其他技術(shù)將所需的目的基因從基因文庫中“釣”出來。19第19頁，共74頁，2023年，2月20日，星期四

三、cDNA文庫的構(gòu)建

以mRNA為模板，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶催化合成DNA，則此DNA序列與mRNA互補，稱為互補DNA或cDNA。提取出組織細胞的全部mRNA，在體外反轉(zhuǎn)錄成cDNA，與適當?shù)妮d體常用噬菌體或質(zhì)粒載體連接后轉(zhuǎn)化受體菌，則每個細菌含有一段cDNA，并能繁殖擴增，這樣包含著細胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合稱為該組織細胞的cDNA文庫。20第20頁，共74頁，2023年，2月20日，星期四cDNA文庫的構(gòu)建：21第21頁，共74頁，2023年，2月20日，星期四

22第22頁，共74頁，2023年，2月20日，星期四

基因組含有的基因在特定的組織細胞中只有一部分表達，而且處在不同環(huán)境條件、不同分化時期的細胞其基因表達的種類和強度也不盡相同，所以cDNA文庫具有組織細胞特異性。

cDNA文庫顯然比基因組DNA文庫小得多，能夠比較容易從中篩選克隆得細胞特異表達的基因。但對真核細胞來說，從基因組DNA文庫獲得的基因與從cDNA文庫獲得的不同，基因組DNA文庫所含的是帶有含子和外顯子的基因組基因，而從cDNA文庫中獲得的是已經(jīng)過剪接、去除了內(nèi)含子的DNA。23第23頁，共74頁，2023年，2月20日，星期四四、聚合酶鏈式反應（PCR）

24第24頁，共74頁，2023年，2月20日，星期四PCR基本原理N=N0(1+e)n

25第25頁，共74頁，2023年，2月20日，星期四PCR反應體系

模板（template）引物(primer)DNA聚合酶(DNApolymerase)dNTPPCRbuffer26第26頁，共74頁，2023年，2月20日，星期四PCR熱循環(huán)

94℃,300S

94℃,60S

30

55℃,60S

72℃,60S

（舉例）72℃,7min

27第27頁，共74頁，2023年，2月20日，星期四載體DNA與目的基因的連接28第28頁，共74頁，2023年，2月20日，星期四限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionendonuclease,RE)是識別DNA的特異序列,并在識別位點或其周圍切割雙鏈DNA的一類內(nèi)切酶。29第29頁，共74頁，2023年，2月20日，星期四BamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口粘端切口30第30頁，共74頁，2023年，2月20日，星期四DNA連接酶1、大腸桿菌DNA連接酶：只能連接粘性末端2、T4DNA連接酶：既能連接粘性末端，又能連接平末端31第31頁，共74頁，2023年，2月20日，星期四DNA連接酶作用模式圖32第32頁，共74頁，2023年，2月20日，星期四1.粘性末端連接方式：(1)同一限制酶切位點連接(2)不同限制酶切位點連接33第33頁，共74頁，2023年，2月20日，星期四BamHⅠ切割反應

GGATCCCCTAGGT4

DNA連接酶15oCGATCCGGCCTAG+目的基因用BamHⅠ切割載體DNA用BamHⅠ切割重組體載體自連目的基因自連同一限制酶切位點連接目錄第34頁，共74頁，2023年，2月20日，星期四不同限制酶切位點的連接EcoRⅠ切割位點Bg

lⅡ切割位點+EcoRⅠ+Bg

lⅡ雙酶切EcoRⅠ+Bg

lⅡ雙酶切T4

DNA連接酶15oC重組體配伍末端的連接情況和同一限制酶切位點連接相似。目錄第35頁，共74頁，2023年，2月20日，星期四同聚物加尾連接在末端轉(zhuǎn)移酶(terminaltransferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再進行粘端連接。36第36頁，共74頁，2023年，2月20日，星期四5′3′3′5′載體DNA5′3′3′5′目的基因限制酶或機械剪切限制酶5′3′3′5′5′3′T(T)nT

T(T)nT3′5′5′

3′3′5′5′3′A(A)nA

A(A)nA3′5′λ-核酸外切酶λ-核酸外切酶末端轉(zhuǎn)移酶+dATP末端轉(zhuǎn)移酶+dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nAT(T)nTT4

DNA連接酶15oC重組體目錄第37頁，共74頁，2023年，2月20日，星期四人工接頭(linker)連接由平端加上新的酶切位點，再用限制酶切除產(chǎn)生粘性末端，而進行粘端連接。

38第38頁，共74頁，2023年，2月20日，星期四人工接頭及其應用CCGAATTCGGGCTTAAGC5′-3′-EcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠ目錄第39頁，共74頁，2023年，2月20日，星期四2.平端連接適用于：限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)生的平端粘端補齊或切平形成的平端40第40頁，共74頁，2023年，2月20日，星期四目的基因載體限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶T4DNA連接酶15oC重組體載體自連目的基因自連目錄41第41頁，共74頁，2023年，2月20日，星期四重組DNA分子引入受體細胞轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)染感染42第42頁，共74頁，2023年，2月20日，星期四一、轉(zhuǎn)化外源DNA進入細胞（常指原核細胞如細菌）而使遺傳性改變稱為轉(zhuǎn)化。指質(zhì)粒DNA或以它為載體構(gòu)建的重組DNA導入細菌的過程。

DNA進入細胞的效率很低，在分子生物學和基因工程工作中可采取一些方法處理細胞，經(jīng)處理后的細胞就容易接受外界DNA，稱為感受態(tài)細胞，再與外源DNA接觸，就能提高轉(zhuǎn)化效率。43第43頁，共74頁，2023年，2月20日，星期四二、轉(zhuǎn)染指病毒或以它為載體構(gòu)建的重組子（非包裝形式）導入受體細胞的過程。44第44頁，共74頁，2023年，2月20日，星期四三、感染噬菌體進入宿主細菌，病毒進入宿主細胞中繁殖就是感染（infection）。用經(jīng)人工改造的噬菌體活病毒作載體，以其DNA與目的序列重組后，在體外用噬菌體或病毒的外殼蛋白將重組DNA包裝成有活力的噬菌體或病毒，就能以感染的方式進入宿主細菌或細胞，使目的序列得以復制繁殖。感染的效率很高，但DNA包裝成噬菌體或病毒的操作較麻煩。45第45頁，共74頁，2023年，2月20日，星期四重組體的篩選和鑒定46第46頁，共74頁，2023年，2月20日，星期四一、遺傳標記篩選1.最常見的載體攜帶的標志是抗藥性標志，如抗氨芐青霉素（ampr）、抗四環(huán)素(terr)、抗卡那霉素(kanr)等。當培養(yǎng)基中含有抗生素時，只有攜帶相應抗藥性基因載體的細胞才能生存繁殖，這就把凡未能接受載體DNA的細胞全部篩除掉了。47第47頁，共74頁，2023年，2月20日，星期四48第48頁，共74頁，2023年，2月20日，星期四(插入失活法)抗藥性標記選擇第49頁，共74頁，2023年，2月20日，星期四2.營養(yǎng)缺陷型的互補篩選二氫葉酸還原酶(DHFR)基因缺陷α互補篩選50第50頁，共74頁，2023年，2月20日，星期四DHFR缺陷型CHO無胸腺嘧啶的培養(yǎng)基二氫葉酸還原酶(DHFR)基因促進THF合成λDNA重組體遺傳互補第51頁，共74頁，2023年，2月20日，星期四α互補的檢測第52頁，共74頁，2023年，2月20日，星期四53第53頁，共74頁，2023年，2月20日，星期四二、酶切鑒定54第54頁，共74頁，2023年，2月20日，星期四三、核酸分子雜交法

55第55頁，共74頁，2023年，2月20日，星期四四、免疫鑒定利用特定抗體與目的基因表達產(chǎn)物特異性結(jié)合的作用進行篩選。此法不是直接篩選目的基因，而是通過與基因表達產(chǎn)物的反應指示含有目的基因的轉(zhuǎn)化細胞，因而要求實驗設計要使目的基因進入受體細胞后能夠表達出其編碼產(chǎn)物。56第56頁，共74頁，2023年，2月20日，星期四五、PCR法57第57頁，共74頁，2023年，2月20日，星期四六、核苷酸序列測定58第58頁，共74頁，2023年，2月20日，星期四重組DNA技術(shù)操作的主要步驟載體質(zhì)粒噬菌體病毒目的基因（外源基因）基因組DNAcDNA人工合成PCR產(chǎn)物限制酶消化開環(huán)載體DNA目的基因連接酶重組體轉(zhuǎn)化體外包裝，轉(zhuǎn)染帶重組體的宿主篩選表型篩選酶切電泳鑒定菌落原位雜交第59頁，共74頁，2023年，2月20日，星期四目的基因的表達原核基因表達體系真核基因表達體系60第60頁，共74頁，2023年，2月20日，星期四原核表達載體強啟動子強終止子啟動子必須受控制起始密碼子與SD序列有合適距離蛋白選擇標記具復制原點、多克隆位點61第61頁，共74頁，2023年，2月20日，星期四原核細胞重組蛋白的表達、分離和純化62第62頁，共74頁，2023年，2月20日，星期四真核表達體系優(yōu)點：轉(zhuǎn)錄后加工翻譯后加工缺點：操作麻煩費用較高重組DNA進入真核細胞的方法