基因工程的基本操作程序

基因工程的基本操作程序第1頁，共48頁，2023年，2月20日，星期四基因工程基本操作的四個步驟1、目的基因的獲取2、基因表達載體的構(gòu)建3、目的基因?qū)胧荏w細胞4、目的基因的檢測與鑒定有了目的基因，我們才能賦予一種生物以另一種生物的遺傳特性。使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并可進行遺傳、表達和發(fā)揮作用

載體進入受體細胞穩(wěn)定表達，才能實現(xiàn)一種生物的基因在另一種生物中的轉(zhuǎn)化。

才能確定目的基因是否真正在受體細胞中穩(wěn)定遺傳和正確表達。1.2基因工程的基本操作程序第2頁，共48頁，2023年，2月20日，星期四第3頁，共48頁，2023年，2月20日，星期四一、目的基因的獲取1目的基因主要是編碼蛋白質(zhì)的基因：如：與生物抗性相關(guān)的基因、與優(yōu)良品質(zhì)相關(guān)的基因、與生物藥物和保健品相關(guān)的基因、與毒物降解相關(guān)的基因、與工業(yè)用酶相關(guān)的基因、具調(diào)控作用的因子等。2獲取目的基因的常用方法：1、從已有物種中分離：如從基因文庫中獲取2、利用PCR技術(shù)擴增目的基因3、人工合成目的基因第4頁，共48頁，2023年，2月20日，星期四1.從基因文庫中獲取目的基因1).基因文庫的概念:將含有某種生物不同基因的許多DNA片斷，導(dǎo)入到受體菌的群體中，各個受體菌分別含有這種生物的不同基因。

基因文庫的種類:基因組文庫：含有一種生物的全部基因部分基因文庫：只包含了一種生物的部分基因，如：cDNA文庫第5頁，共48頁，2023年，2月20日，星期四基因組文庫1.從基因文庫中獲取目的基因各個受體菌分別含有這種生物的不同基因。受體菌群包含了這種生物所有的基因，該受體菌群稱為這種生物的基因組文庫。受體菌群包含了一種生物部分基因。部分基因文庫第6頁，共48頁，2023年，2月20日，星期四2.利用PCR技術(shù)擴增目的基因1概念：PCR全稱為_______________，是一項在生物____復(fù)制___________的核酸合成技術(shù)。2模板DNA；兩種引物；4種脫氧核苷酸；熱穩(wěn)定DNA聚合酶（Taq酶）；ATP等多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體外特定DNA片段3前提：已知目的基因的一段核苷酸序列原理：DNA復(fù)制條件：第7頁，共48頁，2023年，2月20日，星期四4PCR技術(shù)的操作過程a、DNA變性（90℃-95℃）：雙鏈DNA模板高溫解旋，_____斷裂，形成________b、復(fù)性（55℃-65℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，合成與模板互補的________。氫鍵單鏈DNA雙鏈DNA鏈d.重復(fù)a.b.c步驟：每重復(fù)一次，目的基因增加___倍，成指數(shù)形式擴增（2n)。一第8頁，共48頁，2023年，2月20日，星期四PCR技術(shù)的操作過程第9頁，共48頁，2023年，2月20日，星期四PCR技術(shù)擴增與DNA復(fù)制的比較DNA復(fù)制PCR技術(shù)場所原理條件解旋方式酶特點結(jié)果堿基互補配對原則堿基互補配對原則四種脫氧核苷酸、模板、酶、ATP、適宜的溫度和PH四種脫氧核苷酸、模板、酶、ATP、適宜的溫度和PH、兩種引物DNA在高溫下變性解旋解旋酶催化解旋半保留復(fù)制、邊解旋邊復(fù)制半保留復(fù)制、全解旋再復(fù)制體外復(fù)制主要在細胞核內(nèi)大量的DNA片段形成整個DNA分子熱穩(wěn)定的DNA聚合酶細胞內(nèi)的DNA聚合酶、解旋酶等第10頁，共48頁，2023年，2月20日，星期四3.人工合成法在基因較小，核苷酸序列已知的情況下，可以利用DNA合成儀人工合成蛋白質(zhì)的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列基因的核苷酸序列目的基因化學(xué)合成推測推測化學(xué)合成法反轉(zhuǎn)錄法目的基因的mRNARNA-DNA雜交雙鏈雙鏈DNA(即目的基因)DNA聚合酶反轉(zhuǎn)錄酶第11頁，共48頁，2023年，2月20日，星期四二、基因表達載體的構(gòu)建——基因工程的核心1使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時使目的基因能夠表達和發(fā)揮作用。2基因表達載體的組成：目的：目的基因+啟動子+終止子+標(biāo)記基因等第12頁，共48頁，2023年，2月20日，星期四表達載體目的基因：編碼蛋白質(zhì)的基因啟動子：位于基因的首端，它是RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，以驅(qū)動目的基因轉(zhuǎn)錄出mRNA終止子：位于基因的尾端，能終止mRNA的轉(zhuǎn)錄標(biāo)記基因的作用是為了鑒別受體細胞中是否含有目的基因，從而將有目的基因的細胞篩選出來第13頁，共48頁，2023年，2月20日，星期四①用__________切割目的基因和質(zhì)粒，使其生

。②

用__________將目的基因插入質(zhì)粒切口處，形成了一個重組DNA分子(重組質(zhì)粒)。同種限制酶相同黏性末端DNA連接酶3.表達載體的構(gòu)建方法：不同受體細胞其構(gòu)建方法不完全相同第14頁，共48頁，2023年，2月20日，星期四注意：①載體與表達載體的區(qū)別：二者都有標(biāo)記基因和復(fù)制原點兩部分DNA片段。表達載體在載體基礎(chǔ)上增加了目的基因、啟動子、終止子三部分結(jié)構(gòu)②用到的工具酶：既用到限制酶切割載體，又用到DNA連接酶將目的基因和載體拼接，兩種酶作用的化學(xué)鍵都是磷酸二酯鍵③啟動子、終止子對于目的基因表達必不可少④目的基因不能單獨進入受體細胞，必需以表達載體的方式攜帶進去。第15頁，共48頁，2023年，2月20日，星期四三、將目的基因?qū)胧荏w細胞1目的基因進入受體細胞內(nèi)，并且在受體細胞內(nèi)維持穩(wěn)定（復(fù)制）和表達（轉(zhuǎn)錄和翻譯）的過程。2大腸桿菌、枯草桿菌、土壤農(nóng)桿菌、酵母菌和動植物細胞等。轉(zhuǎn)化：常用的受體細胞：第16頁，共48頁，2023年，2月20日，星期四1、目的基因?qū)胫参锛毎w細胞）的方法（1）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法易感染雙子葉植物和裸子植物，對大多數(shù)單子葉植物沒有感染能力。Ti質(zhì)粒上的T-DNA可以轉(zhuǎn)移到受體細胞，并整合到受體細胞染色體的DNA上。

①農(nóng)桿菌特點：②原理：第17頁，共48頁，2023年，2月20日，星期四三、目的基因?qū)胧荏w細胞③過程：植物組織培養(yǎng)技術(shù)第18頁，共48頁，2023年，2月20日，星期四1、目的基因?qū)胫参锛毎姆椒ǎ?）基因槍法：目的基因?qū)雴巫尤~植物細胞（3）花粉管通道法：將目的基因?qū)胫参锛毎?/p>

例：轉(zhuǎn)基因抗蟲棉第19頁，共48頁，2023年，2月20日，星期四2、將目的基因?qū)雱游锛毎▌游锸芫眩俜椒ǎ孩俪绦驗槭裁磳⒛康幕驅(qū)雱游锛毎Ｓ玫氖荏w細胞是受精卵？含目的基因的表達載體取動物的受精卵含目的基因的受精卵轉(zhuǎn)基因動物顯微注射發(fā)育顯微注射法第20頁，共48頁，2023年，2月20日，星期四3、將目的基因?qū)胛⑸锛毎傥⑸镒魇荏w細胞原因：繁殖快、多為單細胞、遺傳物質(zhì)相對少②常用菌：大腸桿菌③常用法：Ca2+處理獲得感受態(tài)細胞④過程：Ca2+處理大腸桿菌感受態(tài)

細胞感受態(tài)細胞吸收DNA表達載體與感受態(tài)細胞混合第21頁，共48頁，2023年，2月20日，星期四四、目的基因的檢測與鑒定導(dǎo)入過程完成后，全部受體細胞都能攝入重組DNA分子嗎？1真正能攝入重組DNA分子的受體細胞很少。2目的基因進入受體細胞后，是否都能穩(wěn)定維持和表達？不一定，需要檢測第22頁，共48頁，2023年，2月20日，星期四1、鑒定——分子水平的鑒定轉(zhuǎn)基因生物的DNA（目的基因）探針15N15N14N14N（1）導(dǎo)入檢測：是目的基因能否在受體細胞內(nèi)穩(wěn)定遺傳的關(guān)鍵。基因探針：用放射性同位素標(biāo)記的目的基因片段方法——DNA分子雜交技術(shù)(DNA與DNA)變性變性第23頁，共48頁，2023年，2月20日，星期四DNA分子雜交示意圖若將兩種生物的DNA分子的單鏈能通過堿基互補配對形成雜合雙鏈，即能夠進行雜交；若不能堿基互補配對，仍然是兩條游離的單鏈。第24頁，共48頁，2023年，2月20日，星期四第25頁，共48頁，2023年，2月20日，星期四1、鑒定——分子水平的鑒定變性方法——分子雜交技術(shù)（DNA與mRNA雜交）（2）轉(zhuǎn)錄檢測（目的基因）探針15N15N轉(zhuǎn)基因生物的mRNA14N第26頁，共48頁，2023年，2月20日，星期四與相應(yīng)抗體雜交1、鑒定——分子水平的鑒定（3）翻譯檢測方法——抗原-抗體雜交提取轉(zhuǎn)基因生物的蛋白質(zhì)顯出雜交帶（表明目的基因已形成蛋白質(zhì)產(chǎn)品）第27頁，共48頁，2023年，2月20日，星期四1、鑒定——分子水平的鑒定（3）檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)方法——抗原-抗體雜交蘇云金桿菌（含抗蟲基因）毒蛋白將毒蛋白注射小鼠體內(nèi)從小鼠血管抽出血液分離出抗毒蛋白的抗體抗體蛋白質(zhì)

出現(xiàn)雜交帶從轉(zhuǎn)基因生物（抗蟲棉）中提取第28頁，共48頁，2023年，2月20日，星期四2、鑒定——個體水平的鑒定抗蟲、抗病接種實驗，活性比較實驗例：用棉鈴飼喂棉鈴蟲，A.蟲吃后中毒死亡，說明攝入了抗蟲基因并得到表達。B.蟲吃后不出現(xiàn)中毒癥狀，說明:①未攝入目的基因②攝入目的基因未表達。

目的基因表達的標(biāo)志：目的基因在受體細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄、翻譯合成相應(yīng)的蛋白質(zhì)，并賦予其特定性狀。第29頁，共48頁，2023年，2月20日，星期四第30頁，共48頁，2023年，2月20日，星期四歸納:基因工程的基本操作程序獲取目的基因從基因文庫利用PCR技術(shù)擴增目的基因人工合成（反轉(zhuǎn)錄法，化學(xué)人工合成）構(gòu)建基因表達載體目的基因、啟動子、終止子、標(biāo)記基因等將目的基因?qū)胧荏w細胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、顯微注射法、Ca2+處理法目的基因的檢測與鑒定檢測(分子水平檢測)：是否插入、轉(zhuǎn)錄、翻譯鑒定（個體水平鑒定）：抗蟲、抗病的接種實驗第31頁，共48頁，2023年，2月20日，星期四課堂練習(xí)1、有關(guān)基因工程的敘述中，錯誤的是()A、DNA連接酶將黏性末端的堿基對連接起來

B、限制性內(nèi)切酶用于目的基因的獲得

C、目的基因須由運載體導(dǎo)入受體細胞

D、人工合成目的基因不用限制性內(nèi)切酶A第32頁，共48頁，2023年，2月20日，星期四課堂練習(xí)2、下列屬于獲取目的基因的方法的是()①利用mRNA反轉(zhuǎn)錄形成②從基因組文庫中提取③從受體細胞中提?、芾肞CR技術(shù)⑤利用DNA轉(zhuǎn)錄 ⑥人工合成

A.①②③⑤B.①②⑤⑥C.①②③④D.①②④⑥D(zhuǎn)第33頁，共48頁，2023年，2月20日，星期四課堂練習(xí)3、有關(guān)基因工程的敘述正確的是（）

A、限制酶只在獲得目的基因時才用

B、重組質(zhì)粒的形成在細胞內(nèi)完成

C、質(zhì)粒都可作為運載體

D、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)可為合成目的基因提供資料D第34頁，共48頁，2023年，2月20日，星期四課堂練習(xí)4、基因工程是在DNA分子水平上進行設(shè)計施工的。在基因操作的基本步驟中，不進行堿基互補配對的步驟是

（）

A、人工合成目的基因

B、目的基因與運載體結(jié)合

C、將目的基因?qū)胧荏w細胞

D、目的基因的檢測和表達C【拓展深化】只有第三步將目的基因?qū)胧荏w細胞不需堿基互補配對，其余三個步驟都涉及堿基互補配對第35頁，共48頁，2023年，2月20日，星期四課堂練習(xí)4．(2009年高考浙江卷)下列關(guān)于基因工程的敘述，錯誤的是(

)A．目的基因和受體細胞均可來自動、植物或微生物B．限制酶和DNA連接酶是兩類常用的工具酶C．人胰島素原基因在大腸桿菌中表達的胰島素原無生物活性D．載體上的抗性基因有利于篩選含重組DNA的細胞和促進目的基因的表達D第36頁，共48頁，2023年，2月20日，星期四提取某種生物的全部DNA用適當(dāng)?shù)南拗泼该盖幸欢ù笮〉腄NA片段將DNA片段與載體連接重組載體基因組文庫導(dǎo)入受體菌中儲存（2）.基因文庫的構(gòu)建方法①基因組文庫的構(gòu)建第37頁，共48頁，2023年，2月20日，星期四基因組DNA文庫與cDNA文庫某生物體內(nèi)全部DNA

許多DNA片段受體菌群體限制酶與運載體連接導(dǎo)入基因組文庫cDNA反轉(zhuǎn)錄受體菌群體與運載體連接導(dǎo)入cDNA文庫某種生物某個時期的mRNA第38頁，共48頁，2023年，2月20日，星期四基因的結(jié)構(gòu)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)RNA聚合酶結(jié)合位點外顯子內(nèi)含子終止子啟動子原核真核第39頁，共48頁，2023年，2月20日，星期四原核細胞的基因結(jié)構(gòu)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游與RNA聚合酶結(jié)合位點啟動子終止子①不編碼蛋白質(zhì)。：編碼蛋白質(zhì),連續(xù)不間斷編碼區(qū)非編碼區(qū)②調(diào)控遺傳信息表達,上游的RNA聚合酶結(jié)合位點:基因結(jié)構(gòu)第40頁，共48頁，2023年，2月20日，星期四真核細胞的基因結(jié)構(gòu)編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)內(nèi)含子外顯子啟動子終止子編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游編碼區(qū)非編碼區(qū)外顯子：能編碼蛋白質(zhì)的序列內(nèi)含子：不能編碼蛋白質(zhì)的序列：有調(diào)控作用,上游有RNA聚合酶結(jié)合位點(啟動子)。與RNA聚合酶結(jié)合位點基因結(jié)構(gòu)第41頁，共48頁，2023年，2月20日，星期四原核細胞與真核細胞的基因結(jié)構(gòu)比較原核細胞真核細胞不同點編碼區(qū)是_____的，邊_________邊_________編碼區(qū)是間隔的、_____的，先_____后_____相同點都由能夠編碼蛋白質(zhì)的______和具有調(diào)控作用的______區(qū)組成的連續(xù)不連續(xù)編碼區(qū)非編碼轉(zhuǎn)錄翻譯轉(zhuǎn)錄翻譯第42頁，共48頁，2023年，2月20日，星期四基因文庫的構(gòu)建方法①基因組文庫的構(gòu)建提取某種生物的全部D