外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)進(jìn)展

外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)進(jìn)展現(xiàn)在是1頁(yè)\一共有36頁(yè)\編輯于星期三主要內(nèi)容循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測(cè)的意義循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測(cè)的基本原理納米材料技術(shù)在循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測(cè)中的應(yīng)用微流控技術(shù)在循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測(cè)中的應(yīng)用現(xiàn)在是2頁(yè)\一共有36頁(yè)\編輯于星期三循環(huán)腫瘤細(xì)胞

（circulatingtumorcells,CTCs）1896年Ashworth在患者外周血中發(fā)現(xiàn)與原發(fā)腫瘤細(xì)胞體積和形態(tài)相似的細(xì)胞；目前CTCs定義為自發(fā)或因診療操作脫離實(shí)體瘤原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶進(jìn)入外周血循環(huán)的一類(lèi)腫瘤細(xì)胞。

AshworthTR.AustMedJ,1869,14:146-147AllardWJ,MateraJ,MillerMC,etal.ClinCancerRes,2004,10:6897-6904現(xiàn)在是3頁(yè)\一共有36頁(yè)\編輯于星期三研究CTCs的臨床意義

TNM分期的重要補(bǔ)充療效監(jiān)測(cè)和預(yù)后判斷個(gè)體化治療的指導(dǎo)轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的早期預(yù)警血循環(huán)轉(zhuǎn)移的機(jī)制現(xiàn)在是4頁(yè)\一共有36頁(yè)\編輯于星期三TNM分期的重要補(bǔ)充基于解剖學(xué)特點(diǎn)的TNM分期存在許多不足CTCs可以做為T(mén)NM分期的重要補(bǔ)充2007年CTCs被ASCO推薦做為腫瘤標(biāo)志物PantelK,etal.NatRevCancer.2008.8(5):329-40HarrisL,etal.JClinOncol.2007.25(33):5287-312CTCs的臨床意義現(xiàn)在是5頁(yè)\一共有36頁(yè)\編輯于星期三療效監(jiān)測(cè)和預(yù)后判斷CTCs可以直接提示癌癥患者對(duì)治療的反應(yīng)持續(xù)升高的CTCs提示腫瘤對(duì)治療反應(yīng)差?lèi)盒阅[瘤患者CTCs的出現(xiàn)均提示預(yù)后不良治療后CTCs出現(xiàn)與患者復(fù)發(fā)相關(guān)IgnatiadisM,etal.JClinOncol.2007.25(33):5194-202LiuMC,etal.JClinOncol.2009.27(31):5153-9RackBK,etal.JClinOncol.2010.28(15):1003HayesDF,etal.ClinCancerRes.2006.12(14Pt1):4218-24CristofanilliM,etal.NEnglJMed.2004.351(8):781-91CTCs的臨床意義現(xiàn)在是6頁(yè)\一共有36頁(yè)\編輯于星期三個(gè)體化治療的指導(dǎo)個(gè)體化治療方案的制定根據(jù)病灶的生物學(xué)特性轉(zhuǎn)移灶的生物學(xué)特點(diǎn)與原發(fā)灶細(xì)胞存在差異針對(duì)CTCs的分析有助于為臨床治療提供個(gè)體化信息StoeckleinNH,etal.IntJCancer.2010.126(3):589-98Alix-PanabieresC,etal.ClinChem.2013.59(1):110-8Alix-PanabieresC,etal.AnnuRevMed.2012.63:199-215CTCs的臨床意義現(xiàn)在是7頁(yè)\一共有36頁(yè)\編輯于星期三轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的早期預(yù)警腫瘤轉(zhuǎn)移是腫瘤發(fā)生發(fā)展的終末期，也是腫瘤病人死亡的主要原因目前常規(guī)檢測(cè)腫瘤轉(zhuǎn)移的方法主要影像學(xué)方法腫瘤轉(zhuǎn)移的早期發(fā)生在細(xì)胞水平即便高分辨率的影像學(xué)方法也無(wú)法偵測(cè)CTCs檢測(cè)可為潛在的轉(zhuǎn)移提供線索，為早期針對(duì)性治療提供可能CristofanilliM,etal.JAMA.2010.303(11):1092-3BuddGT,etal.ClinCancerRes.2006.12(21):6403-9CTCs的臨床意義現(xiàn)在是8頁(yè)\一共有36頁(yè)\編輯于星期三血循環(huán)轉(zhuǎn)移的機(jī)制CTCs形成是血循環(huán)轉(zhuǎn)移的必經(jīng)步驟具有何種生物學(xué)特性的細(xì)胞容易轉(zhuǎn)移ChafferCL,etal.Science.2011.331(6024):1559-64PantelK,etal.TrendsMolMed.2010.16(9):398-406CTCs的臨床意義現(xiàn)在是9頁(yè)\一共有36頁(yè)\編輯于星期三CTCs特點(diǎn)外周血含量低：1～10個(gè)CTC/mL血液﹠1個(gè)CTC/109

個(gè)血細(xì)胞；CTCs特性、形態(tài)及細(xì)胞標(biāo)志隨著內(nèi)環(huán)境改變而改變，無(wú)統(tǒng)一鑒定標(biāo)準(zhǔn)。現(xiàn)在是10頁(yè)\一共有36頁(yè)\編輯于星期三CTC的檢測(cè)步驟檢測(cè)富集現(xiàn)在是11頁(yè)\一共有36頁(yè)\編輯于星期三以特異性抗體經(jīng)抗原抗體吸附篩選根據(jù)細(xì)胞大小進(jìn)行富集免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)合納米材料物理學(xué)免疫學(xué)免疫/化學(xué)CTC富集方法現(xiàn)在是12頁(yè)\一共有36頁(yè)\編輯于星期三免疫磁性分離陽(yáng)性選擇法MACS、Cellsearch系統(tǒng)以及CTC-Chip陰性排除法CD45磁珠去除白細(xì)胞（IMB法）抗原抗體吸附篩選現(xiàn)在是13頁(yè)\一共有36頁(yè)\編輯于星期三光鏡下(放大倍數(shù)400倍)免疫磁珠吸附目標(biāo)細(xì)胞現(xiàn)在是14頁(yè)\一共有36頁(yè)\編輯于星期三分子生物學(xué)方法(PCR)CTC檢測(cè)免疫細(xì)胞化學(xué)方法(ICC、EPISPOT)流式細(xì)胞技術(shù)現(xiàn)在是15頁(yè)\一共有36頁(yè)\編輯于星期三

CellSearchTM（免疫磁珠技術(shù)）采用與細(xì)微鐵顆粒結(jié)合的抗體(鐵液)。鐵液特異性結(jié)合循腫瘤細(xì)胞，其強(qiáng)大的磁場(chǎng)把循環(huán)腫瘤細(xì)胞“牽引”出血樣，再用染色鑒定。CellTracks?AutoPrep?System現(xiàn)在是16頁(yè)\一共有36頁(yè)\編輯于星期三CellSearch檢測(cè)CTCs流程圖現(xiàn)在是17頁(yè)\一共有36頁(yè)\編輯于星期三1、不同腫瘤表面抗體的表達(dá)量存在差異2、腫瘤發(fā)展過(guò)程中細(xì)胞的去上皮化

CTC研究現(xiàn)狀現(xiàn)在是18頁(yè)\一共有36頁(yè)\編輯于星期三磁珠體積很小，不損傷細(xì)胞、不影響細(xì)胞功能、不影響細(xì)胞的特異染色(細(xì)胞膜，細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞核)，顯微鏡下可直接觀察或計(jì)算機(jī)計(jì)數(shù)。前期應(yīng)用微米磁珠，比表面積小、尺寸大、穩(wěn)定性差、易聚沉，致細(xì)胞分離效率低，難洗脫并保持細(xì)胞活性；檢測(cè)成本高、樣品用量多、樣品檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、檢測(cè)過(guò)程封閉等諸多不足．納米技術(shù)增大比表面積，分散性好，降低機(jī)械壓力，提高富集率

CTC方法學(xué)現(xiàn)狀現(xiàn)在是19頁(yè)\一共有36頁(yè)\編輯于星期三納米技術(shù)納米科技是指在納米尺度(從單個(gè)原子、分子到亞微米尺度之間)上研究物質(zhì)特性和相互作用，以及由納米結(jié)構(gòu)集成的功能系統(tǒng)。以此可獲得結(jié)構(gòu)可控、表面功能化的納米材料和納米結(jié)構(gòu)；納米材料具有一些獨(dú)特的效應(yīng)，包括小尺寸效應(yīng)、量子尺寸效應(yīng)、界面效應(yīng)以及宏觀量子遂道效應(yīng)，使納米材料在性能上與具有相同組成的傳統(tǒng)概念上的微米材料有非常顯著的差異，表現(xiàn)出許多優(yōu)異的性能和全新的功能；納米技術(shù)增大比表面積，分散性好，降低機(jī)械壓力，提高富集率。現(xiàn)在是20頁(yè)\一共有36頁(yè)\編輯于星期三基于非磁性納米材料的CTC富集基于納米材料修飾表面將抗體功能化的不同形狀的納米材料(納米顆粒、納米線等)提高了細(xì)胞與捕獲靶點(diǎn)的接觸幾率、方便將CTC細(xì)胞從表面洗脫，減少納米顆粒吸附對(duì)于細(xì)胞活力和分析檢測(cè)的影響SekineJ,etal.AdvMater,2011,23(41):4788-4792ZhangN,etal.AdvMater,2012,24(20):2756-2760現(xiàn)在是21頁(yè)\一共有36頁(yè)\編輯于星期三基于非磁性納米材料的CTC富集基于納米結(jié)構(gòu)表面腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞在粗糙表面上具有不同的黏附特性，利用納米粗糙表面(如功能化的納米線、納米柱)分離血液中的CTC．ChenWQ,etal.ACSNano,2013,7(1):566-575現(xiàn)在是22頁(yè)\一共有36頁(yè)\編輯于星期三HouS,etal.AdvMater,2013,25(11):1547-1551現(xiàn)在是23頁(yè)\一共有36頁(yè)\編輯于星期三現(xiàn)在是24頁(yè)\一共有36頁(yè)\編輯于星期三微流控技術(shù)微流控技術(shù)是一種針對(duì)極小量(10-9～10-18L)流體進(jìn)行操控的系統(tǒng)科學(xué)技術(shù);微流控芯片是微流控技術(shù)實(shí)現(xiàn)的主要平臺(tái)和技術(shù)裝置，其主要特征是容納流體的有效結(jié)構(gòu)(通道、反應(yīng)室和其他某些功能部件)至少在一個(gè)維度上為微米級(jí)尺度?，F(xiàn)在是25頁(yè)\一共有36頁(yè)\編輯于星期三2007年Toner在Nature報(bào)道他們開(kāi)發(fā)的一套微流芯片系統(tǒng)----CTCschip

核心是在單晶硅表面蝕刻形成的微柱陣列，表面經(jīng)上皮細(xì)胞吸附分子（Anti-EpCAM）抗體進(jìn)行修飾，對(duì)循環(huán)腫瘤細(xì)胞的選擇性吸附和捕獲被捕獲的細(xì)胞分布在微流芯片三維空間內(nèi)納米技術(shù)與微流控技術(shù)結(jié)合現(xiàn)在是26頁(yè)\一共有36頁(yè)\編輯于星期三CTC-chips現(xiàn)在是27頁(yè)\一共有36頁(yè)\編輯于星期三納米技術(shù)與微流控技術(shù)結(jié)合磁性納米材料與微流控結(jié)合用于CTC富集；非磁性納米材料與微流控結(jié)合用于CTC富集?，F(xiàn)在是28頁(yè)\一共有36頁(yè)\編輯于星期三磁性納米材料與微流控結(jié)合與CellSearchTM原理類(lèi)似；微流控芯片的樣品量小、流速可控及構(gòu)件透明；磁珠用量減少25%?，F(xiàn)在是29頁(yè)\一共有36頁(yè)\編輯于星期三非磁性納米材料與微流控結(jié)合第二代CTC-chips現(xiàn)在是30頁(yè)\一共有36頁(yè)\編輯于星期三A)TheHB-Chipconsistsofamicrofluidicarrayofchannelswithasingleinletandexit.Insetillustratestheuniformbloodflowthroughthedevice.(B)Amicrographofthegroovedsurfaceillustratestheasymmetryandperiodicityoftheherringbonegrooves.Cartoonillustratingthecell-surfaceinteractionsin(C)theHB-Chip,and(D)atraditionalflat-walledmicrofluidicdevice.Flowvisualizationstudiesusingtwopairedstreamsofthesameviscosity(onestreamisgreen,theotherclear)demonstrate(E)thechaoticmicrovorticesgeneratedbytheherringbonegrooves,andthelackofmixingin(F)traditionalflat-walleddevices.舊方法:病人血液樣本通過(guò)一種表層涂有抗體的硅芯片，該抗體與腫瘤細(xì)胞結(jié)合，血液平滑流過(guò)microposts限制了與抗體覆蓋層的接觸。新方法：將血液標(biāo)本經(jīng)過(guò)一個(gè)人字形溝槽，可快速混合液體，并產(chǎn)生一個(gè)更亂的血流，顯著增加捕獲細(xì)胞的數(shù)量。TonerM,etal.

ProcNatlAcadSciUSA.

2010，107(43):18392-7HB-chips現(xiàn)在是31頁(yè)\一共有36頁(yè)\編輯于星期三BloodfrommetastaticprostatecancerpatientsandhealthydonorswasprocessedusingtheHB-Chip.(A)Healthydonors(n

=

10,redcircles)wereusedtoselectthesignalintensitythresholdinourautomatedimagingsystem(19).Themetastaticprostatecancerpatientdata(n

=

15,greencircles)hadsignificantlyhigherresults,with1415patientsamplespresentingCTCsabove-thresholdlevels.Additionally,(B)theTMPRSS2-ERGfusiontranscriptwasdetectedfromRNAisolatedfromtheHB-Chip,usingRT-PCR.SequencingofthegelbandidentifiedtheraregenefusionofTMPRSS2exon1andERGexon5.(C

and

D)MicrographsofCTCsisolatedfrompatientswithmetastaticprostatecancercostainedusingantibodiesagainstPSA(green),aleukocytemarker,CD45(red),andanuclearstain(DAPI).Correspondingmicrographsofthesamecellsareshowntotherightofthefluorescentimag