課件微生物學生長與控制microbiology final

各位同學：以此版本為準，請互相轉告。?？荚嚦晒?！第六章微生物的生長及其控制第一節(jié)測定生長繁殖的方法第二節(jié)微生物的生長規(guī)律第三節(jié)影響微生物生長的主要因素第四節(jié)微生物培養(yǎng)法概論第五節(jié)有害微生物的控制第六章微生物的生長及其控制第一節(jié)測定生長繁殖的方法第二節(jié)微生物的生長規(guī)律第三節(jié)影響微生物生長的主要因素第四節(jié)微生物培養(yǎng)法概論第五節(jié)有害微生物的控制地球估計有4-6x1030個原核生物細胞BacteriaArchaeawatersoilsedimentvsvs微生物的生長繁殖生長growth:同化(合成)作用的速度超過異化(分解)作用->原生質總量(體積和重量)不斷增加繁殖reproduction:這種平衡生長達到一定程度后將會引起個體數(shù)目的增加微生物個體和群體的關系個體生長->個體繁殖->群體生長(populationgrowth*) (群體生長=個體生長+個體繁殖)研究微生物生長繁殖規(guī)律的意義:研究微生物生理、生化和遺傳等的重要指標,生產實踐上的應用或有害微生物防治測定生長繁殖的方法測生長量:基于原生質含量增加的原理直接法(測體積或干重)間接法(比濁法A450-650nm、生理指標如含氮/碳/磷量,DNA,RNA,ATP..)用刻度離心管將微生物離心,測沉降量分光光度計測定微生物懸浮液的光密度(opticaldensity),以OD值表示菌量測定生長繁殖的方法計繁殖數(shù)(計算個體數(shù)目)直接法:利用計數(shù)板在光學顯微鏡下直接觀察細胞并進行計數(shù)(總菌數(shù))->活菌染色vitalstaining:酵母菌的美藍染色,細菌丫啶橙染色間接法(活菌計數(shù)法viablecellcounting):原理是活菌生長使液體培養(yǎng)基變渾濁或在固體培養(yǎng)基上形成菌落平板菌落計數(shù)法

platecolonycounting:稀釋菌液->澆注平板或涂布平板->菌落形成單位cfu亨蓋特滾管技術

(Hungateroll-tubetechnique):用于厭氧菌菌落計數(shù)8用細菌計數(shù)板或血球計數(shù)板在光學顯微鏡下直接觀察計數(shù)總細胞計數(shù)totalcellcounting測定生長繁殖的方法直接計數(shù)法的優(yōu)缺點快速簡便，還可知細胞的形態(tài)特征不適于對運動細菌的計數(shù)不能區(qū)分死菌與活菌個體小的細菌在顯微鏡下難以觀察需要相對高的細菌濃度測定生長繁殖的方法直接計數(shù)法的優(yōu)缺點…當樣品中菌數(shù)很低時,可將一定體積的水樣通過膜過濾器,然后將濾膜干燥、染色,并經處理使膜透明,再在顯微鏡下計算膜上(或一定面積中)的細菌數(shù)11Countingbacteriabyfiltration樣品充分混勻每支移液管及涂棒只能接觸一個稀釋度的菌液同一稀釋度要三個以上重復并取平均值在合適的稀釋度下,每一個活細胞在固體平板上(內)形成一個單菌落每個平板上的菌落數(shù)目合適,一個9-cm直徑平板上一般以50~500個為宜platecolonycounting13第六章微生物的生長及其控制第一節(jié)測定生長繁殖的方法第二節(jié)微生物的生長規(guī)律第三節(jié)影響微生物生長的主要因素第四節(jié)微生物培養(yǎng)法概論第五節(jié)有害微生物的控制微生物的個體生長和同步生長個體生長individualgrowth:微生物細胞從小到大的生長過程(以及隨之發(fā)生的階段性的極其復雜的生物化學變化和細胞學變化)同步生長synchronousgrowth:通過同步培養(yǎng)技術使微生物群體中的各個個體處于分裂步調一致的生長狀態(tài)*環(huán)境條件誘導法:氯霉素抑制蛋白質合成、細菌芽孢誘導發(fā)芽、藻類細胞的光照和黑暗控制..機械篩選法:

利用處于同一生長階段細胞的體積、大小的相似性(如Helmstetter-Cummings膜洗脫法)

機械篩選法獲得同步生長細胞Helmstetter-Cummings

法系最經典的獲得同步生長的方法原理：同一生長期細菌與膜結合牢固程度相當由于細胞的個體差異,同步生長往往只能維持2-3個世代,隨后又逐漸轉變?yōu)殡S機生長單細胞微生物的典型生長曲線生長曲線growthcurve:定量描述液體培養(yǎng)基中微生物群體生長規(guī)律的實驗曲線典型生長曲線:延滯期指數(shù)期穩(wěn)定期和衰亡期絲狀菌的“非典型”生長曲線:延滯期、快速生長期(培養(yǎng)時間與菌絲體干重的立方根成線性關系)和衰退期生長速率常數(shù)growthrateconstant:微生物每小時分裂的次數(shù)(R)延滯期lagphase指少量單細胞微生物接種到新鮮培養(yǎng)液中后,在開始培養(yǎng)的一段時間內,因代謝系統(tǒng)適應新環(huán)境的需要,細胞數(shù)目沒有增加的一段時期主要特點:生長速率常數(shù)R為0細胞形態(tài)變大或增長(許多桿菌可長成絲狀)細胞內RNA尤其是rRNA含量增高合成代謝活躍(核糖體,酶類及ATP)對外界不良條件敏感(鹽濃度,溫度,抗生素等)延滯期lagphase影響延滯期長短的因素:接種齡(即接種物inoculum的生長年齡)接種量(與延滯期成反比,發(fā)酵工業(yè)1:10v/v)培養(yǎng)基成分(營養(yǎng)豐富的天然培養(yǎng)基vs營養(yǎng)單調的組合培養(yǎng)基)

指數(shù)期exponentialphase生長曲線中緊接著延滯期的一段細胞數(shù)以幾何級數(shù)增長的時期主要特點:生長速率常數(shù)R最大(代時或倍增時間最短)平衡生長balancedgrowth酶系統(tǒng)活躍,代謝旺盛影響指數(shù)期微生物代時長短的因素:菌種(如E.coli

12.5-17min,Bacillussubtilis

26-32min..)營養(yǎng)成分(E.coliinmilk12.5minandinbroth17.0minat37oC)營養(yǎng)物濃度(既影響生長速率又影響生長總量->生長限制因子)培養(yǎng)溫度(及對工業(yè)發(fā)酵和食物保藏的啟示)指數(shù)期exponentialphase指數(shù)期微生物群體的應用優(yōu)點:整個群體的生理特性較一致、細胞各成分平衡增長和生長速率恒定用作代謝、生理和酶學等研究的良好材料增殖噬菌體的最適宿主發(fā)酵工業(yè)中用作種子的最佳材料Temp(oC)10203040G(min)860902917.5E.coli在不同溫度下的代時穩(wěn)定期stationaryphase新增細胞數(shù)與衰亡細胞數(shù)相等(動態(tài)平衡)菌體產量達到最大值(細菌109/ml

原生動物或藻類106/ml)進入穩(wěn)定期的原因：營養(yǎng)物質尤其是生長限制因子的耗盡營養(yǎng)物的比例失調(如C/N比)有害代謝產物(酸、醇、毒素或H2O2等)的積累理化條件(pH,氧化還原電勢)越來越不適宜穩(wěn)定期stationaryphase穩(wěn)定期對生產實踐的意義：對以生產菌體或與菌體生長相平行的代謝產物(如乳酸)為目的的發(fā)酵生產來說，穩(wěn)定期是產物的最佳收獲期生物測定(維生素、堿基、氨基酸等)的最佳時期衰亡期declinephase群體負生長(個體死亡速度超過新生速度)細胞形態(tài)多形化(膨大或不規(guī)則退化)自溶(蛋白水解酶活性增強)芽孢桿菌在此期釋放芽孢微生物的連續(xù)培養(yǎng)連續(xù)培養(yǎng)(continuousculture):向培養(yǎng)容器中連續(xù)流加新鮮培養(yǎng)液,使微生物的液體培養(yǎng)物長期維持穩(wěn)定\高速生長狀態(tài)的一種溢流培養(yǎng)技術措施：連續(xù)流入新鮮培養(yǎng)基,通氣及攪拌以溢流方式以同樣流速不斷流出培養(yǎng)物本質上是采取措施防止穩(wěn)定期的到來->連續(xù)生長(continuousgrowth)continuousculture連續(xù)培養(yǎng)器的類型恒濁器turbidostat根據(jù)微生物的生長密度控制培養(yǎng)液流速,以取得菌體密度高,生長速率恒定的微生物連續(xù)培養(yǎng)微生物始終能以最高生長速率生長應用于以獲得大量菌體或與菌群生長相平行的代謝產物(乳酸,乙醇等)的生產實踐Wiki連續(xù)培養(yǎng)器的類型恒化器chemostat:控制培養(yǎng)液流速(保持不變),從而微生物始終在低于其最高生長速率的條件下進行生長繁殖的連續(xù)培養(yǎng)裝置應用于與生長速率相關的實驗研究Satoriuschemostats控制對象 (菌體密度\培養(yǎng)基流速)培養(yǎng)基(無\有限制生長因子)培養(yǎng)基流速(不恒定\恒定)生長速率(最高速率\低于最高速率)產物(大量菌體或與菌體相平行的代謝產物\不同生長速率的菌體)應用范圍(生產為主\實驗室研究為主)恒濁器turbidostat

vs.恒化器chemostat微生物的高密度培養(yǎng)高密度培養(yǎng)(HCDC):指微生物在液體培養(yǎng)條件下細胞密度超過常規(guī)培養(yǎng)10倍以上的培養(yǎng)技術基于利用基因工程菌(特別是E.coli)生產多肽類藥物的實踐發(fā)展而來具有重要實踐價值(提高產物的比生產率)具體方法(以E.coli為例)選取最佳培養(yǎng)基成分及其含量適時補料(逐量流加)提高溶解氧濃度防止有害代謝產物(乙酸)的生成第六章微生物的生長及其控制第一節(jié)測定生長繁殖的方法第二節(jié)微生物的生長規(guī)律第三節(jié)影響微生物生長的主要因素第四節(jié)微生物培養(yǎng)法概論第五節(jié)有害微生物的控制溫度temperature影響細胞內的一系列生化反應->微生物的生命活動影響生物大分子的物理狀態(tài)(低溫導致細胞膜凝固,高溫使蛋白質變性)生長溫度三基點(threecardinalpoints):最低生長溫度,最適生長溫度和最高生長溫度窄溫微生物(人體專性寄生致病菌)和寬溫微生物(E.coli10~47.5oC)最適生長溫度optimumgrowthtemperature:分裂代時最短或生長速率最高時的培養(yǎng)溫度溫度temperature生長溫度三基點(threecardinalpoints):最低生長溫度,最適生長溫度和最高生長溫度微生物類型最低生長溫度(oC)最適生長溫度(oC)最高生長溫度(oC)Polaromonasvacuolata嗜冷菌-4412Escherichiacoli中溫菌83948Bacillusstearothermophilus嗜熱菌426068Pyrolobusfumarii超嗜熱菌90106114氧氣oxygen氧對微生物的生命活動有著極其重要的影響好氧菌aerobes專性好氧菌obligateaerobes:需氧,在正常大氣壓下(~20.2kPa)通過呼吸產能(絕大多數(shù)細菌和真菌屬于此類)兼性厭氧菌facultativeanaerobes:以呼吸為主,兼營發(fā)酵或厭氧呼吸產能(許多酵母如釀酒酵母和細菌包括腸桿菌科如E.coli)微好氧菌microaerophilicbacteria:只能在微量氧(1.01-3.04kPa)條件下才能正常生長,通過呼吸鏈并以氧氣為最終氫受體而產能氧氣oxygen厭氧菌anaerobes耐氧性厭氧菌aerotolerantanaerobes:可在分子氧存在下進行發(fā)酵性厭氧生活(如常見的乳酸菌)厭氧菌anaerobes:對氧敏感,以發(fā)酵、無氧呼吸或循環(huán)光合磷酸化產能(梭菌屬Clostridium擬桿菌屬Bacteroides產甲烷古菌methanogens專性厭氧生活的SOD學說(McCordandFridovich,1971)凡嚴格厭氧菌就無SOD活力,一般也無過氧化氫酶活力所有具細胞色素系統(tǒng)的好氧菌都有SOD和過氧化氫酶耐氧性厭氧菌不含細胞色素系統(tǒng),但具有SOD活力而無過氧化氫酶活力缺乏SOD的微生物必然只能營專性厭氧生活超氧化物歧化酶SOD在生物體內,超氧陰離子自由基普遍存在超氧化物歧化酶(SuperoxideDismutase,SOD),1938年Marn等人首次從牛紅血球中分離得到1969年McCord等重新發(fā)現(xiàn)這種蛋白,并且發(fā)現(xiàn)了它們的生物活性,弄清了它催化過氧陰離子發(fā)生歧化反應的性質2O2-+2H+->H2O2+O2O2-:超氧陰離子自由基pH水溶液中氫離子濃度的負對數(shù)值絕大多數(shù)微生物的生長pH范圍是5-9不同微生物生長的最低,最適和最高pH(極端嗜酸vs.嗜堿)同種微生物在其不同的生長階段和不同的生理生化過程中也有不同的最適pH要求不管微生物的pH范圍如何,其細胞內環(huán)境中的pH一般接近中性(DNAATP|RNA磷脂)微生物的代謝活動會改變環(huán)境的pH(培養(yǎng)基,酸性礦山廢水)第六章微生物的生長及其控制第一節(jié)測定生長繁殖的方法第二節(jié)微生物的生長規(guī)律第三節(jié)影響微生物生長的主要因素第四節(jié)微生物培養(yǎng)法概論第五節(jié)有害微生物的控制微生物培養(yǎng)法概論理想的微生物培養(yǎng)方法提供豐富而均衡的營養(yǎng)適宜的物理化學條件(溫度,氧氣..)防止雜菌污染微生物培養(yǎng)技術的歷史發(fā)展

…微生物固體培養(yǎng)法好氧菌的固體培養(yǎng)試管斜面test-tubeslant|瓊脂平板agarplate|克氏扁瓶Kolleflask厭氧菌的固體培養(yǎng)

必需的營養(yǎng)元素、還原劑(有機或無機)及Eh指示劑(resazuriu)高層瓊脂柱anaerobicagarcolumn(e.g.Veillontube)厭氧培養(yǎng)皿anaerobicPetridish(Brewer,BrayandSpray)微生物固體培養(yǎng)法厭氧菌的固體培養(yǎng)亨蓋特滾管技術Hungateroll-tubetechnique一種集制備高純氮(除氧銅柱),以氮驅氧和全過程實現(xiàn)無氧操作、無氧培養(yǎng)和無氧檢測的嚴格厭氧菌研究技術和裝置(Hungate,1950)PRAS培養(yǎng)基(pre-reducedanaerobicallysterilizedmedium)微生物固體培養(yǎng)法厭氧罐

anaerobicjar常用但并非很嚴格的厭氧菌培養(yǎng)技術.原理..厭氧工作站anaerobicstation無氧操作+嚴格厭氧菌培養(yǎng)|惰性氣體(N2:CO2:H285:5:10)+鈀催化劑AnaerobicJarELECTROTEKAnaerobicworkstation液體培養(yǎng)法好氧菌的液體培養(yǎng)大多數(shù)的微生物屬于好氧菌,溶解氧是其生長和繁殖的重要限制因子措施:

增加培養(yǎng)液與氧的接觸面積,或提高氧分壓以提高溶氧速率淺層液體靜止培養(yǎng),搖瓶培養(yǎng),通入加壓空氣,機械攪拌實驗室常用的好氧液體培養(yǎng)法:試管液體培養(yǎng)(兼性厭氧菌)三角瓶淺層液體培養(yǎng)(兼性厭氧菌)搖瓶(振蕩)培養(yǎng)臺式發(fā)酵罐benchtopfermentor液體培養(yǎng)法厭氧菌的液體培養(yǎng)厭氧罐或厭氧工作站中培養(yǎng)普通有氧環(huán)境下培養(yǎng)(有機還原劑如巰基乙酸,無機還原劑如鐵絲,石蠟油封閉液面或深層培養(yǎng)->Eh-150~-420mV)第六章微生物的生長及其控制第一節(jié)測定生長繁殖的方法第二節(jié)微生物的生長規(guī)律第三節(jié)影響微生物生長的主要因素第四節(jié)微生物培養(yǎng)法概論第五節(jié)有害微生物的控制有害微生物控制微生物無處不在(everythingiseverywhere)其中一部分對人類有害食品或工農業(yè)產品的霉腐實驗室微生物和動植物組織和細胞培養(yǎng)物的污染工業(yè)發(fā)酵中的雜菌污染人類和動植物的病原菌等..防止\抑制或殺滅它們..有害微生物控制殺滅法滅菌

sterilization:采用強烈的理化因素(高溫\輻射等)使所有微生物不可逆地喪失其生長繁殖能力->殺菌\溶菌消毒disinfection:采用較溫和的理化因素,僅殺死病原菌而對被消毒對象基本無害的措施抑制法防腐antisepsis:利用理化因素抑制霉腐微生物的生長繁殖(抑菌作用bacteriostasis),包括低溫\缺氧\干燥\加防腐劑等化學治療chemotherapy:指利用高度選擇毒力的化學物質來抑制宿主體內病原微生物的生長繁殖,從而達到治療相關傳染病的措施物理滅菌因素-高溫高溫導致生物大分子降解或改變其空間結構,從而變性或破壞干熱滅菌法dryheatsterilization:電熱烘箱150-170C1-2h->徹底滅菌(包括細菌芽孢)灼燒incineration/combustion->最徹底的干熱滅菌法濕熱滅菌法moistheatsteri