分子生物學(xué)研究方法211優(yōu)秀公開課件

分子生物學(xué)研究方法2023/4/72本章將在回顧重組DNA技術(shù)史上主要事件的基礎(chǔ)上，討論DNA操作技術(shù)、基因克隆的常用載體系統(tǒng)以及基因的分離與鑒定等環(huán)節(jié)。DNA分子的切割與連接核酸分子雜交凝膠電泳細(xì)胞轉(zhuǎn)化核酸序列分析基因的人工合成基因操作基因的定點(diǎn)突變PCR擴(kuò)增等核心技術(shù)2023/4/735.1重組DNA發(fā)展史-------三大成就

：1.40年代確定了遺傳信息的攜帶者，即基因的分子載體是DNA而不是蛋白質(zhì)，解決了遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)問題；1928FrederickGriffith&1944OswaldAveryTransformationofStreptococcuspneumoniae(肺炎鏈球菌)1957年，HeinzFraenkel-Conrat和B.Singre的雜合病毒實(shí)驗(yàn)1952年Hershey和Chase證實(shí)噬菌體DNA侵染細(xì)菌實(shí)驗(yàn)2023/4/75

1920年7月25日，羅莎琳生于倫敦的一個(gè)猶太家庭。1942年，她又到英國(guó)煤炭應(yīng)用研究協(xié)會(huì)從事碳纖維研究。1951年，倫敦大學(xué)國(guó)王學(xué)院（KingsCollege）的約翰?伯納爾（JohnRandall）邀請(qǐng)羅莎琳到他那里工作。他的一位研究生對(duì)DNA分子作了初步的X衍射試驗(yàn)，伯納爾希望她對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行深入分析。

1952年，羅莎琳得到了B型DNA分子清晰的X衍射圖像（DNAPhotograph51），這是一張具有里程碑意義的圖像。1953年1月，威爾金斯把這張圖片展示給了沃森和克里克。

1962年，沃森、克里克和威爾金斯分享了諾貝爾生理學(xué)獎(jiǎng)，然而他們?cè)讷@獎(jiǎng)后的演講中也沒有提到羅莎琳。1958年4月，羅莎琳被病魔奪去了年僅38歲的生命。

2023/4/763.50年代末至60年代，相繼提出了"中心法則"和操縱子學(xué)說,成功地破譯了遺傳密碼，充分認(rèn)識(shí)了遺傳信息的流動(dòng)和表達(dá)。JacobandMonod2023/4/77兩大技術(shù)保證：1.DNA的體外切割和連接1962年Arber發(fā)現(xiàn)限制性核酸內(nèi)切酶，1967Gellert發(fā)現(xiàn)了DNA連接酶DNAligasecovalentlylinkstwoDNAstrandsRestrictionenzymeRestrictionenzymeLigaseLigase3’5’3’5’但是，如果沒有分離和富集單一DNA分子的技術(shù)，科學(xué)家就無(wú)法對(duì)這類物質(zhì)進(jìn)行直接的生化分析。2023/4/79幾百堿基對(duì)長(zhǎng)短的DNA片段適于進(jìn)行精細(xì)的物理圖譜以及DNA序列分析等；因此常選用切點(diǎn)較多的識(shí)別位點(diǎn)為4個(gè)核苷酸序列的酶。這在建立基因組文庫(kù)常用的方法識(shí)別位點(diǎn)為6個(gè)核苷酸序列的限制性內(nèi)切酶通常產(chǎn)生1一10kB長(zhǎng)短的限制性寸段，適于進(jìn)行較長(zhǎng)的DNA分子的物理圖譜和包括內(nèi)含子．結(jié)構(gòu)基因以及調(diào)控序列在內(nèi)的完整基因的克??；2023/4/710重組DNA實(shí)驗(yàn)中常見的主要工具酶酶

類功

能限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別并在特定位點(diǎn)切開DNADNA連接酶通過磷酸二酯鍵把兩個(gè)或多個(gè)DNA片段連接成一個(gè)DNA分子DNA聚合酶I（大腸桿菌）按5'到3'方向加入新的核苷酸，補(bǔ)平DNA雙鏈中的缺口反轉(zhuǎn)錄酶按照RNA分子中的堿基序列，根據(jù)堿基互補(bǔ)原則合成DNA鏈多核苷酸激酶把磷酸基團(tuán)加到多聚核苷酸鏈的5'-OH末端（進(jìn)行末端標(biāo)記實(shí)驗(yàn)或用來(lái)進(jìn)行DNA的連接末端轉(zhuǎn)移酶在雙鏈核酸的3'末端加上多聚單核苷酸DNA外切酶III從DNA鏈的3'末端逐個(gè)切除單核苷酸λ噬菌體DNA外切酶從DNA鏈的5'末端逐個(gè)切除單核苷酸堿性磷酸酯酶切除位于DNA鏈5'或3'末端的磷酸基團(tuán)

到目前為止，科學(xué)家已經(jīng)幾乎能隨心所欲地把任何DNA分子切割成一系列不連續(xù)的片段，再利用凝膠電泳技術(shù)將這些片段按照分子量大小逐一分開，以供下一步研究。2023/4/711DNA片段在體外不具備自我復(fù)制能力，要想得到足夠量和足夠純度的DNA，必須將它們連接到具備自主復(fù)制能力的DNA分子上（載體上），并轉(zhuǎn)入寄主細(xì)胞中進(jìn)行繁殖。這就是基因克隆，或分子克隆。2023/4/7131973-Boyer,Cohen&ChangTransformE.coliwithrecombinantplasmidStanleyCohen&AnnieChanHerbertBoyerKanamycinresistancegenePlasmidpSC101TetracyclineresistancegeneE.colitransformedwithrecombinantplasmidTransformedcellsplatedontomediumwithkanamycinandtetracyclineOnlycellswithrecombinantplasmidsurvivetoproducecoloniesBoyer-Cohen實(shí)驗(yàn)：1973年斯坦福大學(xué)的S.Cohen小組將含有卡那霉素抗性基因的大腸桿菌R6-5質(zhì)粒與含有四環(huán)素抗性基因的另一種大腸桿菌質(zhì)粒pSC101連接成重組質(zhì)粒，具有雙重抗藥性。后來(lái)又把非洲爪蟾核糖體基因片斷同pSC101質(zhì)粒重組，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，并在菌體內(nèi)成功轉(zhuǎn)錄出相應(yīng)的mRNA。這是第一次成功的基因克隆實(shí)驗(yàn)。2023/4/714Generalprocessofgeneengineering(1).

從生物有機(jī)體基因組中，分離出帶有目的基因的DNA片段。(2).

將帶有目的基因的外源DNA片段連接到能夠自我復(fù)制的并具有選擇記號(hào)的載體分子上，形成重組DNA分子。(3).

將重組DNA分子轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞（亦稱寄主細(xì)胞）并與之一起增殖。(4).

從大量的細(xì)胞繁殖群體中，篩選出獲得了重組DNA分子的受體細(xì)胞，并篩選出已經(jīng)得到擴(kuò)增的目的基因。2023/4/715(5).將目的基因克隆到表達(dá)載體上，導(dǎo)入寄主細(xì)胞，使之在新的遺傳背景下實(shí)現(xiàn)功能表達(dá)，研究核酸序列與蛋白質(zhì)功能之間的關(guān)系。生長(zhǎng)分化刺激因子基因工程技術(shù)區(qū)別于其它技術(shù)的根本特征：具有跨越天然物種屏障、把來(lái)自任何生物的基因置于毫無(wú)親緣關(guān)系的新的寄主生物細(xì)胞之中的能力。2023/4/717Sanger雙脫氧鏈終止法(dideoxy-terminationsequencing)

原理：雙脫氧（2'，3'）-核苷酸可以象2'-脫氧核苷酸那樣直接摻入新合成的DNA鏈中，但因3’端不具OH基，DNA鏈合成至此中斷。由于雙脫氧核苷酸在每個(gè)DNA分子中摻入的位置不同，故可根據(jù)不同長(zhǎng)度的DNA片段測(cè)定出核苷酸序列。不能和下一個(gè)核苷酸通過磷酸二酯鍵連接起來(lái)2023/4/718AGCTAAAGGTACGGGAATTTCGCG5’3’添加DNApolymerase所有4dNTPs其中一種標(biāo)記的ddNTPddTTPddCTPddGTPddATP在四個(gè)不同的反應(yīng)管中各只包含一種ddNTP.2023/4/719AGCTAAAGGTACGGGAATTTCGCG5’3’TTCGATTCGATTTCGATTTTCTCGATTTCTCGATTTCCTCGTCGATreactionCreactionGreactionAreaction每一管中的復(fù)制的序列都停留在ddNTPs處5’2023/4/721

過程：制備ss-DNA→與引物退火→分為4個(gè)反應(yīng)系統(tǒng)→每個(gè)系統(tǒng)中加入dNTP（其中dATP常帶同位素標(biāo)記）和一種雙脫氧核苷酸→DNA聚合酶定序反應(yīng)→反應(yīng)產(chǎn)物變性后電泳→凝膠干燥→放射自顯影。`

該法亦適合mRNA的序列分析。

GC富集區(qū)常出現(xiàn)“隱影”或“停止”現(xiàn)象，如在反應(yīng)中加入dITP（脫氧三磷酸次黃嘌呤）或脫氧三磷酸-7-脫氧鳥苷可解決GC富集區(qū)的測(cè)序。2023/4/722b．Maxam-Gilbert化學(xué)修飾法(哈佛大學(xué))

該方法的基本原理是用化學(xué)試劑處理具有末端放射性標(biāo)記的DNA片段，造成堿基的特異性切割并產(chǎn)生一組具有不同長(zhǎng)度的DNA鏈降解產(chǎn)物，經(jīng)凝膠電泳分離和放射自顯影之后，可直接讀出待測(cè)DNA片段的核苷酸序列。該反應(yīng)的關(guān)鍵在于使DNA的4種核苷酸中，只有1-2種發(fā)生特異性的化學(xué)切割反應(yīng)：

堿基的特異性修飾；

被修飾的堿基從核糖環(huán)上轉(zhuǎn)移；

失去堿基的糖環(huán)部位發(fā)生DNA鏈斷裂。2023/4/7232023/4/7252023/4/726DNA序列測(cè)定的自動(dòng)化

1.DNA測(cè)序步驟與自動(dòng)化1）模板制備可自動(dòng)化2）定序反應(yīng)可自動(dòng)化3）凝膠電泳自動(dòng)化有一定困難：制膠，點(diǎn)樣，電泳，凝膠干燥，放射自顯影。4）核苷酸序列閱讀與計(jì)算機(jī)輸入可自動(dòng)化2.自動(dòng)測(cè)序儀

Conney等人于1987年設(shè)計(jì)了不同熒光染料標(biāo)記引物，然后做鏈終止測(cè)序，用激光掃描閱讀序列。

紅色引物+T反應(yīng)系統(tǒng)（引物+DNA+dNTP+ddTTP）

黃色引物+G反應(yīng)系統(tǒng)（引物+DNA+dNTP+ddGTP）

綠色引物+A反應(yīng)系統(tǒng)（引物+DNA+dNTP+ddATP）

蘭色引物+C反應(yīng)系統(tǒng)（引物+DNA+dNTP+ddCTP）2023/4/729雜交測(cè)序自從70年代末期DNA測(cè)序技術(shù)問世以來(lái)，人們已經(jīng)做了大量重要的改進(jìn)，但從根本原理上創(chuàng)新的則只有雜交測(cè)序法（sequencingbyhybridization，SBH）一種。它利用一組已知序列的寡核苷酸短序列作探針，同某一特定的較長(zhǎng)的靶DNA分子進(jìn)行雜交，從而測(cè)定其核苷酸的序列。

DNA雜交測(cè)序?qū)嵸|(zhì)上包括兩個(gè)主要的步驟首先是將待測(cè)定的靶DNA分子同一組已知其核苷酸順序的寡核苷酸探針進(jìn)行雜交，然后與那些能夠同靶DNA形成完全的雙鏈雜合分子的寡核苷酸探針做比較分析，并據(jù)此推算出靶DNA的核苷酸序列。2023/4/730如果將一種核苷酸順序?yàn)?'-AGCCTAGCTGAA-3'的12-mer的靶DNA，與一組完全隨機(jī)的8-mer寡核苷酸探針混合雜交，在總數(shù)為48=65536種的8-mer探針群體中，僅有5種會(huì)與靶DNA形成完全互補(bǔ)的雙鏈體分子。根據(jù)這5種發(fā)生了完全雜交作用的8-mer寡核苷酸探針之間的重疊序列的線性關(guān)系，便可推算出這段12-mer的靶DNA分子的核苷酸順序。

當(dāng)然，這只是一種理想化狀態(tài)，實(shí)際上此種雜交模式要復(fù)雜得多，因?yàn)槟切]有同靶DNA片段完全互補(bǔ)的寡核苷酸探針，也仍然會(huì)與之形成不穩(wěn)定的雙鏈分子。2023/4/731（基因芯片測(cè)序)2023/4/732上圖是兩條長(zhǎng)度均為17-mer的靶DNA片段I和II的雜交測(cè)序結(jié)果，兩者僅在第8位堿基有不同，分別為C和T。靶DNA片段I可與1~8共8段彼此相互重疊的8-mer寡核苷酸形成完全的雙鏈分子，但不能與第9段8-mer寡核苷酸形成完全的雙鏈分子。根據(jù)相鄰的兩段8-mer寡核苷酸之間各自具有7個(gè)堿基的重疊情況，可以構(gòu)建出互補(bǔ)的DNA序列。靶DNA片段II的雜交結(jié)果表明，橫跨其第8位堿基T的6段8-mer寡核苷酸的雙鏈體，由于含有內(nèi)部的堿基錯(cuò)配，因此其雜交效率明顯下降；但與第1和第8兩段8-mer寡聚體形成的具有末端G-T錯(cuò)配的雙鏈分子，其穩(wěn)定性下降并不顯著。與第9段8-mer寡核苷酸能雜交形成完全的雙鏈體分子，證實(shí)與片段I相比，它在第8位發(fā)生了由C堿基到T堿基的變化。5.2

DNA操作技術(shù)

5.2.1核酸的凝膠電泳自從瓊脂糖（agarose）和聚丙烯酰胺（polyacrylamide）凝膠被引入核酸研究以來(lái)，按分子量大小分離DNA的凝膠電泳技術(shù)，已經(jīng)發(fā)展成為一種分析鑒定重組DNA分子及蛋白質(zhì)與核酸相互作用的重要實(shí)驗(yàn)手段，也是現(xiàn)在通用的許多分子生物學(xué)研究方法，如：DNA分型、DNA核苷酸序列分析、限制性內(nèi)切酶片段分析以及限制酶切作圖等的技術(shù)基礎(chǔ)，受到科學(xué)界的高度重視。

2023/4/7345.2.1.1基本原理

長(zhǎng)度不同的核酸分子也具有幾乎一致的電荷-質(zhì)量比。在一定的電場(chǎng)強(qiáng)度下，DNA分子的這種遷移速度，亦即電泳的遷移率，取決于核酸分子本身的大小和構(gòu)型。如果只在溶液中則不能分離，如果改在凝膠中，則分離得以實(shí)現(xiàn)。由于在電泳中往往使用無(wú)反應(yīng)活性的穩(wěn)定的支持介質(zhì)，如瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠等，故電泳的遷移率與分子的摩擦系數(shù)成反比。已知摩擦系數(shù)是分子大小、極性及介質(zhì)粘度的函數(shù)，因此，根據(jù)分子大小的不同、構(gòu)型或形狀的差異以及所帶的凈電荷的多寡，便可以通過電泳將蛋白質(zhì)或核酸分子混合物中的各種成分彼此分離開來(lái)。2023/4/735聚丙烯酰胺凝膠電泳常用于蛋白質(zhì)及小分子量核酸的分離。DNA的序列分析就采用聚丙烯酰胺凝膠電泳。蛋白質(zhì)的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳可用于測(cè)定蛋白質(zhì)的分子量。相鄰的SDS分子由于帶有相同的負(fù)電荷而相互排斥，使結(jié)合了SDS分子的蛋白質(zhì)形成棒狀構(gòu)型并且具有相同的荷質(zhì)比，此時(shí)的蛋白質(zhì)處于變性狀態(tài)。它們?cè)谀z中的遷移速度決定于它們的長(zhǎng)度。脈沖場(chǎng)凝膠電泳技術(shù)(PFGE)是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的分離大分子量DNA的有效手段。在兩個(gè)不同方向的電場(chǎng)周期性交替進(jìn)行的，DNA分子在交替變換方向的電場(chǎng)中作出反應(yīng)所需的時(shí)間顯著地依賴于分子大小，DNA越大，這種構(gòu)象改變需要的時(shí)間越長(zhǎng)，重新定向的時(shí)間也越長(zhǎng)，于是在每個(gè)脈沖時(shí)間內(nèi)可用于新方向泳動(dòng)的時(shí)間越少，因而在凝膠中移動(dòng)越慢。反之，較小的DNA移動(dòng)較快，于是不同大小的分子被成功分離。2023/4/7362023/4/737瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠分辨DNA片段的范圍為0.2~50kb之間2023/4/738聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠，其分辨范圍為1個(gè)堿基對(duì)到1000個(gè)堿基對(duì)之間2023/4/739凝膠類型及濃度分離DNA片段的大小范圍（bp）0.3%瓊脂糖50000~10000.7%瓊脂糖20000~10001.4%瓊脂糖6000~3004.0%聚丙烯酰胺1000~10010.0%聚丙烯酰胺500~2520.0%聚丙烯酰胺50~1凝膠的分辨能力同凝膠的類型和濃度有關(guān)，凝膠濃度的高低影響凝膠介質(zhì)孔隙的大小，濃度越高，孔隙越小，其分辨能力就越強(qiáng)。反之，濃度降低，孔隙就增大，其分辨能力也就隨之減弱。2023/4/740在凝膠電泳中，加入適量溴化乙錠（ethidiumbromide，簡(jiǎn)稱EtBr）染料對(duì)核酸分子進(jìn)行染色，然后將電泳標(biāo)本放置在紫外光下觀察，可十分靈敏而快捷地檢測(cè)出凝膠介質(zhì)中DNA的譜帶部位，即使每條DNA帶中僅含有0.05μg的微量DNA，也可以被清晰地檢測(cè)出來(lái)。在紫外線的照射下結(jié)合溴化乙錠的DNA分子發(fā)出熒光2023/4/741稱樣溶解加熱制板倒膠電泳操作基本程序2023/4/742取樣點(diǎn)樣電泳檢測(cè)2023/4/7431.將快速生長(zhǎng)中的大腸桿菌置于經(jīng)低溫（0℃）預(yù)處理的低滲氯化鈣溶液中，便會(huì)造成細(xì)胞膨脹（形成原生質(zhì)球）。

所謂細(xì)菌轉(zhuǎn)化，是指一種細(xì)菌菌株由于捕獲了來(lái)自另一種細(xì)菌菌株的DNA而導(dǎo)致性狀特征發(fā)生遺傳改變的生命過程。提供轉(zhuǎn)化DNA的菌株叫作供體菌株，接受轉(zhuǎn)化DNA的細(xì)菌菌株則被稱為受體菌株。處于能夠接受外源DNA狀態(tài)的細(xì)胞稱為感受態(tài)細(xì)胞。5.2.2細(xì)菌轉(zhuǎn)化步驟：2023/4/7442.與轉(zhuǎn)化混合物中的外源DNA形成粘附在細(xì)胞表面的復(fù)合物。3.立即將該體系轉(zhuǎn)移到42℃下做短暫的熱刺激，復(fù)合物便會(huì)被細(xì)胞所吸收。4.在全培養(yǎng)基中生長(zhǎng)一段時(shí)間使轉(zhuǎn)化基因?qū)崿F(xiàn)表達(dá)、細(xì)胞活性恢復(fù)5.涂布于選擇性培養(yǎng)基中分離轉(zhuǎn)化子。2023/4/745其原理是細(xì)菌處于0℃，CaCl2的低滲溶液中，菌細(xì)胞膨脹成球形，轉(zhuǎn)化混合物中的DNA形成抗DNase的羥基-鈣磷酸復(fù)合物粘附于細(xì)胞表面，經(jīng)42℃短時(shí)間熱沖擊處理，促使細(xì)胞吸收DNA復(fù)合物，在豐富培養(yǎng)基上生長(zhǎng)數(shù)小時(shí)后，球狀細(xì)胞復(fù)原并分裂增值，被轉(zhuǎn)化的細(xì)菌中，重組子中基因得到表達(dá)，在選擇性培養(yǎng)基平板上，可選出所需的轉(zhuǎn)化子。Ca2+處理的感受態(tài)細(xì)胞，其轉(zhuǎn)化率一般能達(dá)到5×106~2×107轉(zhuǎn)化子/ug質(zhì)粒DNA，可以滿足一般的基因克隆試驗(yàn)。如在Ca2+的基礎(chǔ)上，聯(lián)合其它的二價(jià)金屬離子（如Mn2+、Co2+）、DMSO或還原劑等物質(zhì)處理細(xì)菌，則可使轉(zhuǎn)化率提高100~1000倍。2023/4/7465.2.3基因擴(kuò)增聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，即PCR技術(shù)，是一種在體外快速擴(kuò)增特定基因或DNA序列的方法，故又稱為基因的體外擴(kuò)增法。DNA聚合酶具有在核苷酸底物的存在下，以一條DNA鏈為模板催化新鏈的合成需要具有3’-OH的引物具有5’到3’方向聚合的能力通常具有3’到5’外切酶活性2023/4/747PCRCycle-Step1-DenaturationTemplateDNAbyHeat(95oC)TargetSequenceTargetSequencePCR原理示意圖①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；2023/4/748PCRCycle-Step2–

Temperatureislowered(Tm)andprimersannealtotargetsequencesTargetSequenceTargetSequencePrimer1Primer25’3’5’5’3’5’3’3’②模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；2023/4/749PCRCycle-Step3-

At72oCTaqDNApolymerasecatalysesprimerextensionascomplementarynucleotidesareincorporatedTargetSequenceTargetSequencePrimer1Primer25’3’5’5’3’5’3’3’TaqDNAPolymerase③引物的延伸：DNA模板--引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈。2023/4/750Endofthe1stPCRCycle–

ResultsintwocopiesoftargetsequenceTargetSequenceTargetSequence每完成一個(gè)循環(huán)需2～4分鐘，2～3小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬(wàn)倍。2023/4/751TargetAmplificationNo.of No.AmpliconCycles CopiesofTarget1 22 43 84 165 326 6420 1,048,57630 1,073,741,8241cycle=2Amplicon2cycle=4Amplicon3cycle=8Amplicon4cycle=16Amplicon5cycle=32Amplicon6cycle=64Amplicon7cycle=128Amplicon2023/4/752PCR儀2023/4/7535.2.4實(shí)時(shí)定量PCR

SYBRGreenI與dsDNA結(jié)合熒光信號(hào)會(huì)增強(qiáng)800-1000倍，用SYBRGreenI染色的凝膠樣品熒光信號(hào)強(qiáng)，背景信號(hào)低。可適用于多種電泳分析。

2023/4/754反向PCR(reversePCR)是用反向的互補(bǔ)引物來(lái)擴(kuò)增兩引物以外的未知序列的片段，而常規(guī)PCR擴(kuò)增的是已知序列的兩引物之間DNA片段.實(shí)驗(yàn)時(shí)選擇已知序列內(nèi)部沒有切點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶對(duì)該段DNA進(jìn)行酶切，然后用連接酶使帶有粘性末端的靶序列環(huán)化連接，再用一對(duì)反向的引物進(jìn)行PCR，其擴(kuò)增產(chǎn)物將含有兩引物外未知序列，從而對(duì)未知序進(jìn)行分析研究.

反向PCR(reversePCR)2023/4/755(1)、任一DNA序列在文庫(kù)中出現(xiàn)的概率：

N:該序列需要克隆的總數(shù)；p:待克隆DNA序列在文庫(kù)中設(shè)定的出現(xiàn)概率，一般為99％；I：待克隆DNA片段的長(zhǎng)度，假定為17kb;G:基因組DNA的總長(zhǎng)度，如人類為3×109bp5.2.5基因組文庫(kù)5.2.5.1文庫(kù)大小2023/4/756將數(shù)據(jù)代入上式

=8.1×105N的含義是克隆大小為17kb的人類DNA時(shí)，所構(gòu)建的基因文庫(kù)數(shù)必須在8.1×105以上時(shí)，才能以99％的概率得到此克隆。2023/4/757(2)、建庫(kù)的目的：1）.從復(fù)雜的基因組中分離單拷貝的基因；2）.是從來(lái)源復(fù)雜的總mRNA的cDNA文庫(kù)中分離稀有的cDNA克隆。(3)、建庫(kù)的關(guān)鍵：如何產(chǎn)生足夠數(shù)量的重組DNA(4)、建庫(kù)應(yīng)注意：

1）.保證載體DNA和靶DNA均不被外源DNA序列污染；2）.盡可能用“電話克隆”。2023/4/7582023/4/7595.2.5.2

DNA克隆片段的產(chǎn)生與分離（一）、基因組DNA的片段化

(1).用限制酶片段化:用限制酶消化DNA，不經(jīng)凝膠電泳分部離,直接和載體連接的克隆方法叫鳥槍法(shot-ganapproach)存在的問題：

①所形成的重組體分子是一群帶有大小不同插入片段的混合群體。以每個(gè)載體可插入1～3kbDNA計(jì)算，基因庫(kù)至少含10～30萬(wàn)個(gè)重組質(zhì)粒。從中篩出目的基因工作量是很大的。②目的基因內(nèi)部可能有一個(gè)以上的酶切位點(diǎn)，即一個(gè)基因分載在幾個(gè)重組質(zhì)粒上，完整篩出更不容易。2023/4/760(2).隨機(jī)片段化：超聲波：可產(chǎn)生300bp的短片段。高速攪拌：1500轉(zhuǎn)/分×30分可切平均長(zhǎng)度8kb的分子群體。(3).雙酶消化

雙酶切產(chǎn)生的DNA片段平均大小不超過1kb,但如采用雙酶部分消化，產(chǎn)物的分子量可達(dá)10～30kb,它們存在著隨機(jī)序重疊，用蔗糖梯度離心或凝膠電泳可將這些片段群體按大小分開，可得到的分子量大小約為20kb的隨機(jī)DNA片段群體。2023/4/7615.3RNA基本操作技術(shù)由于mRNA分子敏感脆弱，在自然狀態(tài)下難以被擴(kuò)增。一般將其反轉(zhuǎn)錄成穩(wěn)定的DNA雙螺旋，再插入到可以自我復(fù)制的載體中。cDNA來(lái)自反轉(zhuǎn)錄的mRNA，不含冗余序列，通過特異性探針篩選cDNA文庫(kù)，可以較快地分離到相關(guān)基因，2023/4/7625.3.1總RNA的提取要獲得均一的RNA取決于能否有效去除RNA提取中DNA和蛋白質(zhì)。采用高活性RNA酶抑制劑，可以防止RNA的降解，采用酚-氯仿抽提可以方便地去除RNA提取物中蛋白質(zhì)。常用的異硫氰酸胍（Trizol試劑異硫氰酸胍和苯酚）和鹽酸胍是RNA抑制劑之一，它能在裂解細(xì)胞的同時(shí)使RNA酶失活，而且還能使RNA提取過程中的蛋白質(zhì)變性。

2023/4/7632023/4/7642023/4/765

5.3.2.mRNA的純化

可應(yīng)用PromegaPolyATtractmRNA分離系統(tǒng)分離多聚(A)mRNA。將用生物素標(biāo)記的寡聚(dT)引物與細(xì)胞總RNA共溫育，加入與微磁球相連的抗生物素蛋白，用磁場(chǎng)吸附通過寡聚(dT)引物與抗生物素蛋白及強(qiáng)力微磁球相連的mRNA。Promega公司mRNA磁珠法分離試劑盒(PolyATtractmRNAIsolationSystems)2023/4/7665.3.3反轉(zhuǎn)錄生成cDNA

可同時(shí)在反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)中加入寡聚（dT）及隨機(jī)引物R6，以保證得到全長(zhǎng)cDNA，應(yīng)選用活性較高的反轉(zhuǎn)錄酶及甲基化dCTP，保證所獲得雙鏈cDNA的方向性。

因?yàn)榻^大多數(shù)大腸桿菌細(xì)胞都會(huì)切除帶有5‘-methylC的外源DNA，所以實(shí)驗(yàn)中常選用mcrA-mcrB-菌株。

由于cDNA第一鏈中含有5’甲基化的dCTP，使在以后的實(shí)驗(yàn)步驟中可以避免被限制性內(nèi)切酶所消化。

merA(Modifiedcytosinerestrictionproteina)這種酶能特異性地作用于外來(lái)DNA上的被甲基化的胞嘧啶序列，及C5mCGG特異序列。merB,C(Methylcytosine-specificrestriction)識(shí)別G5mC.2023/4/767

Oligo（dT）引物一般包含10～20個(gè)脫氧胸腺嘧啶核苷和一段帶有稀有酶切位點(diǎn)的引物共同組成，隨機(jī)引物一般是包含6～10個(gè)堿基的寡核苷酸短片段。

在第一鏈cDNA合成后直接采用末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）在第一鏈cDNA的3'-端加上一段Poly（dC）的尾巴，同時(shí)進(jìn)行酶切創(chuàng)造出另一端的粘端，與片段Ⅱ一起形成環(huán)化體，這種環(huán)化了的雜合雙鏈在RNA酶H、大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ和DNA連接酶的作用下合成與載體聯(lián)系在一起的雙鏈cDNA。其主要特點(diǎn)是合成全長(zhǎng)cDNA的比例較高，但操作比較復(fù)雜，形成的cDNA克隆中都帶有一段Poly（dC）/（dA），對(duì)重組子的復(fù)制和測(cè)序都不利。2023/4/768自身引導(dǎo)法（圖8-3）：

首先用氫氧化鈉消化雜合雙鏈中的mRNA鏈，解離的第一鏈cDNA的3'-末端就會(huì)形成一個(gè)發(fā)夾環(huán)（發(fā)夾環(huán)的產(chǎn)生是第一鏈cDNA合成時(shí)的特性，原因至今未知，據(jù)推測(cè)可能是由帽子的特殊結(jié)構(gòu)相關(guān)），并引導(dǎo)DNA聚合酶復(fù)制出第二鏈，此時(shí)形成的雙鏈之間是連接在一起的，再利用S1核酸酶將連接處（僅該位點(diǎn)處為單鏈結(jié)構(gòu)）切斷形成平端結(jié)構(gòu)可以進(jìn)行連接。

2023/4/769OligodT或隨機(jī)引物

合成cDNA第一鏈合成cDNA第二鏈補(bǔ)平cDNA鏈末端強(qiáng)堿2023/4/770從表中看出低豐度mRNA，每個(gè)細(xì)胞僅有14個(gè)拷貝左右，其總量約占總mRNA的30%，其中約有11,000個(gè)左右的不同種類的mRNA。因此，為了獲得一個(gè)能夠代表全部低豐度mRNA序列的cDNA基因文庫(kù)，必須的最低克隆數(shù)（理論值）應(yīng)是11,000/0.30=~37000。但由于在實(shí)驗(yàn)中存在著取樣上的差異，有些序列容易被克隆，有些序列卻不容易被克隆，為了保證基因文庫(kù)中能夠包含所有的序列，就必須增加克隆的數(shù)目。為了使上述低豐度mRNA的cDNA克隆達(dá)到99%的期望率，大約需要篩選170,000個(gè)克隆。豐

度

等

級(jí)相應(yīng)豐度等級(jí)的mRNA群體占總mRNA的百分?jǐn)?shù)（%）在相應(yīng)豐度等級(jí)中所含的不同種類mRNA序列的數(shù)量（個(gè)）每個(gè)細(xì)胞所含的相應(yīng)豐度mRNA序列的拷貝數(shù)（個(gè)）高豐度22303,500中豐度491,090230低豐度2910,670142023/4/7715.3.4cDNA文庫(kù)概況:cDNA文庫(kù)是通過反轉(zhuǎn)錄mRNA，并制備雙鏈cDNA(doublestrandedcDNA)來(lái)構(gòu)建的。構(gòu)建cDNA文庫(kù)的策略是取決于：(1)目的mRNA的相對(duì)豐度；(2)篩選方法：除簡(jiǎn)單的分子雜交法外還可對(duì)表達(dá)產(chǎn)物用各種方法進(jìn)行鑒定。2023/4/772

CDNA文庫(kù)的優(yōu)點(diǎn)(1).使遺傳物質(zhì)為RNA病毒可建立文庫(kù)；(2).因克隆數(shù)比基因組文庫(kù)少得多，易于篩選；(3).從分化特異的細(xì)胞的cDNA文庫(kù)中可分離到特異表達(dá)的基因。(4).建庫(kù)時(shí)已排除了其它的RNA，使假陽(yáng)性率減低。(5).

cDNA文庫(kù)可在細(xì)菌中表達(dá)，可用多種策略進(jìn)行篩選。2023/4/773但應(yīng)注意：1).細(xì)胞中不同mRNA的豐度不同，低豐度的mRNA要求很高的克隆數(shù)(要用公式來(lái)計(jì)算)。2).有的基因表達(dá)具有嚴(yán)格的時(shí)空性，要獲得其mRNA并非易事。用不同發(fā)育階段，或不同組織細(xì)胞中的mRNA制備的cDNA文庫(kù)會(huì)包含一些共同和特異序列。這可用于分離差異表達(dá)的基因。3).cDNA文庫(kù)的DNA無(wú)內(nèi)含子、調(diào)節(jié)元件和基因間DNA。不能用于基因結(jié)構(gòu)和調(diào)節(jié)的研究。一個(gè)基因經(jīng)不同的剪接可產(chǎn)生不同的部分重疊的cDNA克隆。2023/4/774第三節(jié)RNA操作技術(shù)5.基因文庫(kù)的篩選基因文庫(kù)的篩選是指通過某種特殊方法從基因文庫(kù)中鑒定出含有所需重組DNA分子的特定克隆的過程。篩選方法有很多種，常用的有：核酸雜交法PCR篩選法免疫篩選法2023/4/775原位雜交技術(shù)兩種意義的原位雜交;一種是指在構(gòu)建基因組文庫(kù)或cDNA文庫(kù)時(shí)，長(zhǎng)在培養(yǎng)皿上的菌落或噬菌斑經(jīng)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上后進(jìn)行分子雜交。另一種原位雜交技術(shù)則是指在細(xì)胞、組織切片上直接進(jìn)行分子雜交。通過檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)特異mRNA的存在與否，它能夠告訴我們，在哪些細(xì)胞中有特異基因的表達(dá)。2023/4/7762023/4/777InsituhybridizationLocalizationofDNALocalizationofRNA

2023/4/778底物堿性磷酸酶鏈霉抗生物素硝酸纖維濾膜2023/4/7795.4SNP的理論與應(yīng)用SNPs的定義：?jiǎn)魏塑账岫鄳B(tài)性(singlenucleotidepolymorphisms,SNPs)主要是指在基因組水平上由單個(gè)核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性。2023/4/780位于染色體上某一區(qū)域的一組相關(guān)聯(lián)的SNP等位位點(diǎn)被稱作單倍型，相鄰SNPs的等位位點(diǎn)傾向于以一個(gè)整體遺傳給后代。2023/4/781SNPs的研究意義（1）.SNPs作為第三代遺傳標(biāo)記（已知性、可遺傳性、可檢測(cè)性），用于疾病基因的定位、克隆和鑒定。___路標(biāo)的作用傳統(tǒng)研究策略（表征、蛋白、基因）逆向遺傳學(xué)（表型、基因、蛋白），（2）.基因多態(tài)性研究研究SNPs本身對(duì)機(jī)體的影響（生理特征、病理?xiàng)l件下的千差萬(wàn)別）

第1代標(biāo)記限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP），第2代標(biāo)記

1985年，小衛(wèi)星中心、可變串聯(lián)重復(fù)VNTR可提供不同長(zhǎng)度的片段，其重復(fù)單位長(zhǎng)度為6至12個(gè)核苷酸，1989年微衛(wèi)星標(biāo)記系統(tǒng)2023/4/782SNPs研究進(jìn)展和方向（1）.SNPs數(shù)據(jù)庫(kù)的構(gòu)建發(fā)現(xiàn)（2）.SNPs功能的研究（在1的基礎(chǔ)上）2023/4/783SNPs檢測(cè)方法（1）.理想的檢測(cè)SNPs的方法

——發(fā)現(xiàn)未知的SNPs，或檢測(cè)已知的SNPs1)靈敏度和準(zhǔn)確度的要求（反應(yīng)原理嚴(yán)緊）2)快速、簡(jiǎn)便、高通量(操作和分析的自動(dòng)化程度高）3)費(fèi)用相對(duì)低廉（2）.現(xiàn)狀：到現(xiàn)在還沒有一個(gè)符合以上條件的理想方法出現(xiàn),但根據(jù)實(shí)際情況,可以選擇出較合適方法。2023/4/784SNPs檢測(cè)方法的分類一、區(qū)分SNPs位點(diǎn)的方法

1.基于雜交的方法2.基于酶的方法3.以構(gòu)象為基礎(chǔ)的方法4.直接測(cè)序的方法二、檢測(cè)分析技術(shù)

1.凝膠分析技術(shù)2.熒光檢測(cè)技術(shù)3.DNA芯片4.質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)2023/4/785SNP的檢測(cè)技術(shù)（1）.基因芯片技術(shù)通過優(yōu)化芯片雜交程序，使探針只與完全互補(bǔ)的序列雜交而不與含有單個(gè)錯(cuò)配堿基的序列雜交。優(yōu)點(diǎn)是高通量，缺點(diǎn)是成本高。（2）Taqman技術(shù)2023/4/786Taqman法該技術(shù)的基本原理是利用Taq酶的5′核酸外切酶活性,在這個(gè)PCR反應(yīng)中除了兩個(gè)傳統(tǒng)的PCR引物P1、P2外,還有第三個(gè)引物P3即等位特異性Taqman探針,含有待檢測(cè)的SNP位點(diǎn),特異結(jié)合在P1結(jié)合位點(diǎn)的下游。Taq酶以P1為引物合成新的DNA鏈,隨著反應(yīng)的進(jìn)行Taq酶接觸到P3并激發(fā)其5′→3′外切酶活性,使P3從5′端開始降解,最后DNA鏈得以延伸而P3探針上的熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)由于不再在一個(gè)分子上了,熒光基團(tuán)釋放熒光信號(hào)。熒光信號(hào)的強(qiáng)弱與PCR產(chǎn)物的數(shù)量成比例。這種檢測(cè)方法的優(yōu)點(diǎn)是閉管進(jìn)行,因而減少了PCR污染的風(fēng)險(xiǎn),但探針標(biāo)記的成本較高,且因其采用熒光猝滅及雙末端標(biāo)記技術(shù),猝滅難以徹底,本底較高。

2023/4/787分子信標(biāo)（Molecularbeacons）分子信標(biāo)是一種新型的發(fā)卡結(jié)構(gòu)的寡核苷酸探針,是在樣品PCR過程中因和樣品DNA雜交后而使自身熒光構(gòu)象改變從而實(shí)現(xiàn)對(duì)SNP的檢測(cè)(原理見圖1)。分子信標(biāo)由稱為“莖”(stem)和“環(huán)”(loop)的兩部分構(gòu)成,環(huán)的序列和待擴(kuò)增的目的片段互補(bǔ)并含有要檢測(cè)的SNP位點(diǎn)。當(dāng)分子信標(biāo)和其完全互補(bǔ)的目的片段雜交時(shí),其發(fā)卡結(jié)構(gòu)被拉開而使熒光分子和熒光猝滅基團(tuán)在空間上分開從而發(fā)射出熒光,其信號(hào)可提高900倍。2023/4/7881.

1個(gè)特異性的測(cè)序引物和單鏈DNA模板結(jié)合，然后加入酶混合物（包括DNAPolymerase、ATPSulfurylase、Luciferase和Apyrase腺苷三磷酸雙磷酸酶）和底物混合物（包括5’-磷酰硫酸APS和Luciferin）。2.四種dNTP（dATPS脫氧腺苷硫代三磷酸

，dTTP，dCTP，dGTP）之一被加入反應(yīng)體系，如與模板配對(duì)，與引物的末端形成共價(jià)鍵，dNTP的焦磷酸基團(tuán)（PPi）釋放出來(lái)。3.在ATP硫酸化酶的作用下，生成的PPi可以和APS結(jié)合形成ATP;在熒光素酶的催化下，生成的ATP又可以和熒光素結(jié)合形成氧化熒光素，同時(shí)產(chǎn)生可見光。通過CCD光學(xué)系統(tǒng)即可獲得一個(gè)特異的檢測(cè)峰，峰值的高低則和相匹配的堿基數(shù)成正比。4.反應(yīng)體系中剩余的dNTP和殘留的少量ATP在Apyrase的作用下發(fā)生降解。5.加入另一種dNTP,使第2-4步反應(yīng)重復(fù)進(jìn)行，根據(jù)獲得的峰值圖即可讀取準(zhǔn)確的DNA序列信息。dATPS不是熒光素的底物焦磷酸測(cè)序法(Pyrosequencing)2023/4/789DNA聚合酶、ATP硫酸化酶(ATPsulfurylase)、熒光素酶(luciferase)和腺苷三磷酸雙磷酸酶(apyrase)5’-磷酰硫酸(adenosine-5’-phosphosulfat，APS)、2023/4/7905.5基因克隆技術(shù)5.5.1RACE技術(shù)（rapidamplificationofcDNAends）5.5.2.應(yīng)用cDNA差示分析法克隆基因5.5.3.Gateway大規(guī)?？寺〖夹g(shù)5.5.4基因的圖位克隆法2023/4/7915.5.1RACE技術(shù)（rapidamplificationofcDNAends）

是用于從已知cDNA片段擴(kuò)增全長(zhǎng)基因的方法，它根據(jù)已知序列設(shè)計(jì)基因片段內(nèi)部特異引物，由該片段向外側(cè)進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到目的序列。用于擴(kuò)增5’端的方法稱為5’RACE，用于擴(kuò)增3’端的稱為3’RACE。已知序列cDNA的來(lái)源序列表達(dá)標(biāo)簽減法cDNA庫(kù)差式顯示基因文庫(kù)篩選獲得高質(zhì)量總RNA去磷酸化去掉mRNA5′帽子結(jié)構(gòu)加特異性RNA寡聚接頭合成第一條cDNA鏈5′RACE3′RACE將純化后的PCR產(chǎn)物克隆到載體DNA中，進(jìn)行序列分析RACE主要操作方法2023/4/7935’RACE在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，以已知基因片段內(nèi)部。特異性引物啟始cDNA第一條鏈的合成RNase混合物降解模板mRNA，純化cDNA第一條鏈。

用末端轉(zhuǎn)移酶在cDNA鏈3‘端加入連續(xù)的dCTP

以連有oligo(dG)的錨定引物和基因片段內(nèi)部特異的nested引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以期得到目的片段，并可用nestPCR進(jìn)行檢測(cè)。套式引物（NestedPrimer）PCR用第一套引物擴(kuò)增15～30個(gè)循環(huán)，再用擴(kuò)增DNA片段內(nèi)設(shè)定的第二套引物擴(kuò)增15～30個(gè)循環(huán)，這樣可使待擴(kuò)增序列得到高效擴(kuò)增，而次級(jí)結(jié)構(gòu)卻很少擴(kuò)增。用起始引物限量方法或Centricon30(Amicon)分子濾過器離心，在第二套引物加入前去除第一引物。（universaladaptorprimer，UAP）2023/4/7943’RACE是在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，以連有可以和polyA配對(duì)的oligo(dT)的錨定引物啟始cDNA第一條鏈的合成。用RNaseH降解模板mRNA。用通用錨定引物和基因片段內(nèi)部特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到目的3‘片段，并可用nestPCR的方法繼續(xù)進(jìn)行檢測(cè)和擴(kuò)增。2023/4/7955.5.2.

應(yīng)用cDNA差示分析法克隆基因

(1)應(yīng)用mRNA差別顯示技術(shù)分離克隆目的基因根據(jù)表達(dá)特性的差異可將高等真核生物的基因分為兩大類：一類叫做看家基因（house-keepinggene），另一類叫做發(fā)育調(diào)控基因（developmentalregulatedgene。我們將不同基因在生物個(gè)體發(fā)育的不同階段，或是在不同的組織或細(xì)胞中發(fā)生的按時(shí)間、空間進(jìn)行有序表達(dá)的方式稱為基因的差別表達(dá)（differentialexpression）。1992年，美國(guó)波士頓Dena-Farber癌癥研究所的兩位科學(xué)家P.Liang和A.D.Pardee發(fā)明了一種叫做mRNA差別顯示PCR（mRNAdifferentialdisplay）技術(shù)，簡(jiǎn)稱DDRT-PCR。2023/4/796DDRT-PCR的主要操作步驟如下：（1）從不同發(fā)育階段或不同基因型的細(xì)胞群體中分離mRNA，并以3'錨定引物作為反轉(zhuǎn)錄的引物，合成第一鍵cDNA；

（2）用5'隨機(jī)引物和某個(gè)3'端錨定引物對(duì)擴(kuò)增第一鏈(摻入32P-dNTP)；LiangP和PardeeA根據(jù)PolyA序列起點(diǎn)前2個(gè)堿基除AA外只有12種可能性的特征，設(shè)計(jì)合成了12種下游引物，稱3′-錨定引物，其通式為5'-T11MN；同時(shí)為擴(kuò)增出polyA上游500bp以內(nèi)所有可能性的mRNA序列，在5′端又設(shè)計(jì)了20種10bp長(zhǎng)的隨機(jī)引物。這樣構(gòu)成的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增能產(chǎn)生出20000條左右的DNA條帶，其中每一條都代表一種特定mRNA種2023/4/797（3）用DNA變性測(cè)序膠分離擴(kuò)增產(chǎn)物，X光片曝光后檢測(cè)差別條帶；

（4）回收特異性差別條帶；

（5）用同一引物對(duì)擴(kuò)增已回收的DNA條帶；

（6）用Northern，Southern及測(cè)序法分析所得的條帶；

（7）以該DNA片段做探針，篩選全長(zhǎng)cDNA或核基因。2023/4/798(2)應(yīng)用cDNA差示分析法（RDA）克隆基因l）cDNA文庫(kù)差示篩選法，這是一種直接分離組織或發(fā)育特異表達(dá)基因的方法，例如對(duì)于兩種不同的組織細(xì)胞，先提取它們的poly(A)+mRNA，分別構(gòu)建這兩種組織的cDNA文庫(kù)，然后以這些mRNA為模板，合成放射性標(biāo)記的cDNA探針，再用這兩種探針分別與一類cDNA文庫(kù)的兩套重復(fù)考貝雜交，跟兩種探針都雜交的克隆是兩種組織細(xì)胞中都表達(dá)的基因，而僅與一種探針雜交的克隆則是在一種組織細(xì)胞中特異表達(dá)的mRNA，再對(duì)這樣的克隆進(jìn)行測(cè)序比較和鑒定，就可分離到這種組織特異表達(dá)的基因。用這種方法已分離到許多根莖葉和生殖器官等特異表達(dá)的基因。2023/4/799A.差式雜交或扣除雜交克隆技術(shù)2023/4/7100

RDA法充分發(fā)揮了PCR以指數(shù)形式擴(kuò)增雙鏈DNA模板的特性，通過降低cDNA群體復(fù)雜性和更換cDNA兩端接頭等方法，特異擴(kuò)增了目的基因片段。因?yàn)樵囼?yàn)對(duì)象（Tester）和供試探針（Driver）在接受差示分析前均經(jīng)一個(gè)4堿基切割酶處理，形成平均長(zhǎng)度256bp的代表群（representation），保證絕大部分遺傳信息能被擴(kuò)增。每次T減D反應(yīng)后僅設(shè)置72℃復(fù)性與延伸，94℃變性這兩個(gè)參數(shù)共20個(gè)PCR循環(huán)，PCR產(chǎn)物的特異性和所得探針的純度非常高。試驗(yàn)對(duì)象（Tester）供試探針（Driver）4堿基切割酶處理平均長(zhǎng)度256bp的代