微生物藥物制造工藝

微生物藥物制造工藝第1頁，共73頁，2023年，2月20日，星期四第四章微生物藥物制造工藝生物工程教研室劉靜霆

第2頁，共73頁，2023年，2月20日，星期四§1微生物藥物概述§2抗生素制造工藝§3其他微生物藥物第3頁，共73頁，2023年，2月20日，星期四§1微生物藥物概述一、微生物藥物的定義和發(fā)展二、微生物藥物的分類三、微生物藥物研發(fā)進(jìn)展第4頁，共73頁，2023年，2月20日，星期四§1微生物藥物概述一.微生物藥物的定義和發(fā)展

1.定義（MicrobialMedicines）：微生物在其生命活動過程中產(chǎn)生的生理活性物質(zhì)及其衍生物，包括抗生素，酶抑制劑，免疫調(diào)節(jié)劑等一類化學(xué)物質(zhì)的總稱，是人類控制感染等疾病，保障身體健康，以及用來防治動、植物病害的重要化療藥物。第5頁，共73頁，2023年，2月20日，星期四2、發(fā)展（1）傳統(tǒng)抗生素(antibiotic）:第6頁，共73頁，2023年，2月20日，星期四

1942年，Waksman首先定義：抗生素是微生物在其代謝過程中所產(chǎn)生的、具有抑制它種微生物生長及活動甚至殺滅它種微生物性能的化學(xué)物質(zhì)。第7頁，共73頁，2023年，2月20日，星期四1947年1948年1950年1952年1953年第8頁，共73頁，2023年，2月20日，星期四1950至80，我國譯為抗菌素第9頁，共73頁，2023年，2月20日，星期四

1980年后，抗腫瘤、抗寄生蟲等抗生素的不斷發(fā)現(xiàn)，超出對微生物作用范圍，又改譯為抗生素。第10頁，共73頁，2023年，2月20日，星期四（2）半合成抗生素（3）微生物來源的其他活性物質(zhì)酶抑制劑:亮肽素bestatin

免疫抑制劑：環(huán)孢菌素Aβ羥基-甲基戊二酰輔酶A還原酶抑制劑第11頁，共73頁，2023年，2月20日，星期四§1微生物藥物概述3、抗生素的發(fā)展方向：①加強(qiáng)基礎(chǔ)理論研究和新技術(shù)的應(yīng)用②選育抗性菌種和新型菌株③大力發(fā)展農(nóng)業(yè)抗生素第12頁，共73頁，2023年，2月20日，星期四抗生素類藥物維生素類藥物氨基酸類藥物核酸類藥物酶與輔酶類藥物酶抑制劑免疫調(diào)節(jié)劑甾體類激素

二.微生物藥物的分類第13頁，共73頁，2023年，2月20日，星期四（一）抗生素類藥物1、抗生素的命名依動植物學(xué)、菌屬學(xué)名稱而定－－青霉素、鏈霉素、灰黃霉素、黃連素、蒜素、魚素等；依族命名－－四環(huán)素、氯霉素等；依地名及俗名而定－－創(chuàng)新霉素、廬山霉素、平陽霉素、井岡霉素、土霉素等。第14頁，共73頁，2023年，2月20日，星期四2.抗生素類藥物的分類生物來源化學(xué)結(jié)構(gòu)作用對象作用機(jī)制第15頁，共73頁，2023年，2月20日，星期四1）根據(jù)生物來源分類：

（1）放線菌產(chǎn)生：鏈霉素（2）真菌產(chǎn)生：青霉素（3）細(xì)菌產(chǎn)生：短桿菌（4）動植物產(chǎn)生：蒜素、黃連素第16頁，共73頁，2023年，2月20日，星期四2）根據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)分類：（1）β-內(nèi)酰胺類抗生素

青霉素、頭孢菌素、硫霉素、亞胺培南第17頁，共73頁，2023年，2月20日，星期四（2）氨基糖苷類抗生素

鏈霉素、新霉素、卡那霉素、慶大霉素第18頁，共73頁，2023年，2月20日，星期四（3）大環(huán)內(nèi)酯類抗生素紅霉素、螺旋霉素、麥迪霉素第19頁，共73頁，2023年，2月20日，星期四（4）四環(huán)類抗生素四環(huán)素、金霉素、土霉素第20頁，共73頁，2023年，2月20日，星期四（5）多肽類抗生素多粘菌素、放線菌素、桿菌肽第21頁，共73頁，2023年，2月20日，星期四（6）多烯類抗生素兩性霉素、曲古霉素、制霉菌第22頁，共73頁，2023年，2月20日，星期四（7）蒽環(huán)類抗生素柔紅霉素、阿霉素、正定霉素第23頁，共73頁，2023年，2月20日，星期四（8）苯烴基胺類抗生素

氯霉素、甲砜氯霉素（9）環(huán)橋類抗生素

利福霉素（10）其他

磷霉素、創(chuàng)新霉素第24頁，共73頁，2023年，2月20日，星期四3）根據(jù)作用對象分類：

①抗G+菌：青霉素、紅霉素②抗G-菌：主要有多粘菌素③抗真菌：制霉菌素、灰黃霉素、兩性霉素④抗結(jié)核分枝桿菌：鏈霉素、新霉素、卡那霉素⑤抗癌：放線菌素D、博來霉素、阿霉素⑥抗病毒：四環(huán)類抗生素、艾霉素⑦抗原蟲：巴龍霉素、抗滴蟲霉素、蒜素第25頁，共73頁，2023年，2月20日，星期四

4）根據(jù)作用機(jī)制分類

①抑制細(xì)菌壁合成：青霉素②影響細(xì)胞膜功能：多烯類抗生素③抑制核酸合成：影響DNA結(jié)構(gòu)的博來霉素、絲裂霉素C及柔毛霉素等；④抑制Pr合成：四環(huán)素、氯霉素、鏈霉素⑤抑制生物能作用：抑制電子轉(zhuǎn)移的抗霉素、抑制氧化磷酸化作用的短桿菌肽和寡霉素第26頁，共73頁，2023年，2月20日，星期四根據(jù)作用機(jī)制分類第27頁，共73頁，2023年，2月20日，星期四維生素B2維生素Cβ-胡蘿卜素（二）維生素β-胡蘿卜素第28頁，共73頁，2023年，2月20日，星期四（三）氨基酸目前大部分氨基酸可用發(fā)酵法生產(chǎn)（四）核酸類藥物如肌苷酸，腺苷酸，肌苷，腺苷等第29頁，共73頁，2023年，2月20日，星期四（五）酶與輔酶類藥物

鏈激酶、L-天冬酰胺酶（六）酶抑制劑（七）免疫調(diào)節(jié)劑

（八）甾體類激素克拉維酸、洛伐他汀第30頁，共73頁，2023年，2月20日，星期四三、微生物藥物研發(fā)進(jìn)展1.尋找新的微生物資源稀有放線菌極端微生物海洋微生物第31頁，共73頁，2023年，2月20日，星期四2.新的篩選模型及手段

新藥物作用靶標(biāo)微生物產(chǎn)物庫高通量篩選虛擬篩選第32頁，共73頁，2023年，2月20日，星期四3.組合生物合成技術(shù)的應(yīng)用酮基合成酶(KS)、?；D(zhuǎn)移酶（AT）、脫氫酶（DH）、烯酰還原酶（ER）、酮基還原酶（KR）和?；d體蛋白（ACP）等功能域第33頁，共73頁，2023年，2月20日，星期四4、代謝調(diào)控與基因敲除第34頁，共73頁，2023年，2月20日，星期四5.基因改組（DNASuffling）第35頁，共73頁，2023年，2月20日，星期四§1微生物藥物概述§2抗生素制造工藝§3其他微生物藥物第36頁，共73頁，2023年，2月20日，星期四§2抗生素制造工藝一、β-內(nèi)酰胺類抗生素二、氨基糖苷類抗生素三、大環(huán)內(nèi)酯類抗生素四、四環(huán)素類抗生素第37頁，共73頁，2023年，2月20日，星期四一般制備過程培養(yǎng)發(fā)酵：發(fā)酵液預(yù)處理固液分離第38頁，共73頁，2023年，2月20日，星期四

胞內(nèi)產(chǎn)物細(xì)胞破碎固液分離胞外產(chǎn)物初步純化

精制第39頁，共73頁，2023年，2月20日，星期四初步純化方法：沉淀、吸附、萃取、超濾精制方法：層析、電泳、結(jié)晶第40頁，共73頁，2023年，2月20日，星期四選擇方法依據(jù)1、產(chǎn)品性質(zhì)：化學(xué)組成、分子量、穩(wěn)定性、溶解度、解離特性等2、主要雜質(zhì)屬性3、方法前后銜接要求4、產(chǎn)品質(zhì)量要求第41頁，共73頁，2023年，2月20日，星期四一、β-內(nèi)酰胺類抗生素

（一）結(jié)構(gòu)與性質(zhì)

a青霉烷*b青霉烯c頭孢烷d頭孢烯*e單環(huán)β-內(nèi)酰胺

f碳青霉烷*g碳青霉烯*h碳頭孢烷I碳頭孢烯

j氧青霉烷*k氧青霉烯l氧頭孢烷m氧頭孢烯*天然產(chǎn)物第42頁，共73頁，2023年，2月20日，星期四CNHCHCHCOOCNCHCH3CH3COOHSSiteofpenicillinaseaction.Breakageoftheβ-lactamring.STRUCTUREOFPENICILLIN第43頁，共73頁，2023年，2月20日，星期四（二）、青霉素的制備（A）、理化性質(zhì)：1、溶解性：受pH影響游離酸：易溶于有機(jī)溶劑，難溶于水鹽：易溶于水，幾乎不溶于有機(jī)溶劑2、酸堿性：有機(jī)弱酸第44頁，共73頁，2023年，2月20日，星期四3、穩(wěn)定性：

溫度、pH對其穩(wěn)定性的影響第45頁，共73頁，2023年，2月20日，星期四4降解反應(yīng)第46頁，共73頁，2023年，2月20日，星期四5、聚合反應(yīng)氨芐青霉素在水溶液中易形成聚合物，是氨芐青霉素過敏反應(yīng)的主要過敏原之一。第47頁，共73頁，2023年，2月20日，星期四6、過敏反應(yīng)

可能為青霉烯酸、青霉噻唑酸和青霉噻唑蛋白第48頁，共73頁，2023年，2月20日，星期四（B）、制備工藝1、菌種最早的原始菌種是點(diǎn)青霉菌現(xiàn)用產(chǎn)黃青霉菌(Pen.chrysogenum)按菌絲的形態(tài)分為絲狀菌和球狀菌兩種。國內(nèi)青霉素生產(chǎn)廠大都采用綠色絲狀菌。第49頁，共73頁，2023年，2月20日，星期四2、發(fā)酵工藝流程絲狀菌發(fā)酵工藝流程第50頁，共73頁，2023年，2月20日，星期四發(fā)酵工藝要點(diǎn)碳源：乳糖、葡萄糖、天然油脂

葡萄糖母液和工業(yè)用葡萄糖氮源：玉米漿、

花生餅粉、麩質(zhì)、尿素前體：苯乙酸、苯乙酰胺加入量＜0.1%無機(jī)鹽：硫、磷、鉀30%、鈣20%、鎂41%、Fe3+6ug/ml第51頁，共73頁，2023年，2月20日，星期四3、培養(yǎng)條件控制①菌絲生長繁殖期:②青霉素分泌期:菌絲生長趨勢減弱，間隙添加葡萄糖作碳源和間隙加入花生餅粉、尿素作氮源，并間隙加入前體，此期間球狀菌pH要求6.6～6.9，絲狀菌pH要求6.2～6.4，青霉素分泌旺盛。③菌絲自溶期:第52頁，共73頁，2023年，2月20日，星期四4、控制要點(diǎn)：

1）糖：pH上升后可開始加糖。

2）補(bǔ)料及添加前體：發(fā)酵液中殘余苯乙酰胺濃度為0.05～0.08%。

3）pH：主要通過加葡萄糖控制pH4）T：種子罐培養(yǎng)絲狀菌要求25℃，發(fā)酵罐培養(yǎng)絲狀菌要求26℃-24℃5）通氣與攪拌：深層培養(yǎng)需通入一定量空氣，并不停地?cái)嚢枰员ＷC溶氧的濃度

6）泡沫與消沫：泡敵第53頁，共73頁，2023年，2月20日，星期四5、提煉工藝流程工業(yè)鉀鹽生產(chǎn)工藝流程p581第54頁，共73頁，2023年，2月20日，星期四影響因素pH值：萃取到BA時(shí)，pH選2.0～2.5，而從BA反萃取到水相時(shí)，pH選6.8～7.2溫度：低溫(10℃以下)，在設(shè)備上要考慮用冷鹽水進(jìn)行冷卻，以降低溫度，特別是酸化崗位，溫度要求更低些。時(shí)間：酸化時(shí)速度應(yīng)快些,而堿化時(shí)速度可放慢些第55頁，共73頁，2023年，2月20日，星期四二、氨基糖苷類抗生素(一)、結(jié)構(gòu)與性質(zhì)胍基pK11.5甲氨基pK7.7第56頁，共73頁，2023年，2月20日，星期四鏈霉素的理化性質(zhì)1、酸堿性：強(qiáng)堿性2、溶解性：易溶于水，難溶于有機(jī)溶劑3、穩(wěn)定性：較穩(wěn)定pH4-7溶液數(shù)周內(nèi)穩(wěn)定

pH4.0-4.5最穩(wěn)定降解反應(yīng)：酸、堿條件下水解出鏈霉胍等4、醛基反應(yīng)：與伯胺形成席夫堿第57頁，共73頁，2023年，2月20日，星期四5、成鹽：與磷鎢酸、苦味酸、甲基橙等成鹽沉淀，用于鑒別與磺酸、羧酸、磷酸酯成鹽，可溶于有機(jī)溶劑中，可用于溶劑萃取法。與某些鹽形成復(fù)鹽，用于精制，如：鏈霉素鹽酸鹽與氯化鈣（在甲醇中）形成復(fù)鹽，復(fù)鹽溶于水，可通過陰離子交換樹脂（SO42-）轉(zhuǎn)為硫酸鹽。第58頁，共73頁，2023年，2月20日，星期四(二）鏈霉素的制備

1、菌種--灰色鏈霉菌防止鏈霉菌株變異的措施：冷凍干燥法或砂土管法保存菌種，限制有效使用期；0-4℃暫存，限制使用期限；嚴(yán)控傳代次數(shù)，一般以3次為限；定期純化篩選，淘汰退化菌落；不斷選育出高發(fā)酵單位的新菌種。第59頁，共73頁，2023年，2月20日，星期四2、發(fā)酵工藝?yán)鋬龉苣感毙泵骀咦渔咦优囵B(yǎng)27℃,6~7d一級種子罐二級種子罐發(fā)酵罐放罐提取搖瓶培養(yǎng)種子培養(yǎng)種子培養(yǎng)發(fā)酵28.5℃,pH=6.5~7.3接種量為10%最后接種為20%第60頁，共73頁，2023年，2月20日，星期四3、提煉發(fā)酵液〔酸化處理〕1~2倍水稀釋，草酸酸化pH2.8~3.2,加熱

70℃

~75℃酸化液〔過濾或離心〕板框過濾離心分離酸化濾洗液〔中和〕冷卻至15℃以下，10％NaOH中和pH6.7~7.2中和濾液〔一次離子交換〕110-Na型樹脂吸附（20萬U/ml）飽和樹脂〔一次洗脫〕

水洗至澄清，5％~6％H2SO4洗脫一次洗脫液〔二次離子交換〕NaOH中和后401樹脂吸附（10萬U/ml）第61頁，共73頁，2023年，2月20日，星期四蒸發(fā)濃縮液〔脫色、無菌過濾、噴霧干燥〕

先用無鹽水?dāng)D壓，再以8%H2SO4單罐洗脫3~4次〔精制〕NaOH中和,1×14-H型、

330-OH型樹脂精制精制液〔活性碳脫色〕pH4.3~5.0,0.2%~3%活性碳，透光度90%以上精脫液〔薄膜濃縮〕＜35℃/-0.00266mPa（24萬～36萬U/ml）飽和樹脂〔二次洗脫〕二次洗脫液硫酸鏈霉素成品第62頁，共73頁，2023年，2月20日，星期四三、大環(huán)內(nèi)酯類抗生素（一）、概述：

結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：以大環(huán)內(nèi)酯為母體第63頁，共73頁，2023年，2月20日，星期四共性：

1、無色弱堿性化合物

2、微溶于水，在水中溶解度隨溫度上升而下降

3、酸性條件苷鍵易水解，堿性內(nèi)酯環(huán)易破壞第64頁，共73頁，2023年，2月20日，星期四分類多氧大環(huán)內(nèi)酯類抗生素－－按碳原子數(shù)可分為12元環(huán)、14元環(huán)和16元環(huán)三類，如紅霉素、竹桃霉素、吉他霉素、螺旋霉素等；多烯大環(huán)內(nèi)酯類抗生素－－具有26-28元大環(huán)內(nèi)酯，含4-7個(gè)共軛雙鍵，如制霉菌素蒽莎大環(huán)內(nèi)酯抗生素－－又叫環(huán)橋類抗生素，如利福霉素第65頁，共73頁，2023年，2月20日，星期四（二）紅霉素的主要性質(zhì)1、酸堿性：二甲氨基呈堿性2、溶解性：易溶于醇、丙酮、氯仿、酯，微溶于乙醚和水，在水中溶解度55℃時(shí)最小3、穩(wěn)定性：pH6-8最穩(wěn)定第66頁，共73頁，2023年，2月20日，星期四（三）制備工藝1、菌種紅色鏈霉菌多組分主要有效組分---紅霉素A

其他成分-----紅霉素B、C、E第67頁，共73頁，2023年，2月20日，星期四冷凍管母斜孢子培養(yǎng)液孢子培養(yǎng)37℃,7~10d,避光一級種子罐繁殖罐發(fā)酵罐放罐提取微孔接種種子培養(yǎng)種子培養(yǎng)發(fā)酵31℃,pH=6.6~7.2，

6~7d33℃，40h2、發(fā)酵工藝35℃,65h37℃,7~9d,避光第68頁，共73頁，2023年，2月20日，星期四3、提取發(fā)酵液〔預(yù)處理，過濾〕0.1%甲醛，3%ZnSO4NaOH

調(diào)pH7.8~8.2濾洗液〔樹脂吸附〕CAD-40樹脂吸附，濃度3.5萬U/ml