酶譜法檢測血清基質(zhì)金屬蛋白酶MMPMMP9的活性優(yōu)秀公開課

酶譜法檢測血清中基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2和MMP-9活性綜合性設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)-2此實(shí)驗(yàn)共包括如下三個(gè)部分第一部分，電泳技術(shù)簡介第二部分，酶譜法檢測血清中基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2和MMP-9的活性第三部分，食管癌患者血液中MMP-2和MMP-9的活性變化及其臨床意義第一部分，電泳技術(shù)簡介影響泳動率u的因素內(nèi)因：1.凈電荷：電荷愈多愈快2.粒子大?。侯w粒直徑愈小愈快3.粒子形狀：愈接近球形愈快

外因：1.V(U/L)：電場強(qiáng)度越高電泳速度越快2.緩沖液的pH(pH恒定)：PH值決定帶電顆粒的解離程度，決定物質(zhì)所帶凈電荷的多少3.離子強(qiáng)度[I]最適:0.02-0.2緩沖液的離子強(qiáng)度越高，電泳速度越慢4.電滲：液體對固體支持物的相對移動，應(yīng)盡量避免選用有電滲作用的支持物按支持介質(zhì)的不同可分為：

紙電泳（Paperelectrophorisis）

醋酸纖維薄膜電泳（CelluloseAcetateelectrophoresis）

瓊脂凝膠電泳（AgarGelelectrophoresis）聚丙烯酰胺凝膠電泳（PolyacrylamideGel-electrophoresis）

SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS,十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳法）按支持介質(zhì)形狀不同可它為：

薄層電泳板電泳柱電泳電泳設(shè)備垂直電泳系統(tǒng)聚丙烯酰胺凝膠電泳原理

聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺(acrylamide，簡稱Acr)和交聯(lián)劑N,N′-甲叉雙丙烯酰胺(N,N′-methylene-bisacylamide,簡稱Bis)在加速劑N,N,N,N-四甲基乙二胺(N,N,N,N-tetram-ethylethylenediamine，簡稱TEMED)和催化劑過硫酸銨(ammoniumpersulfate(NH4)2S2O3，簡稱AP)的作用下聚合交聯(lián)成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠，以此凝膠為支持物的電泳稱為聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamidegelelectrophoresis，簡稱PAGE)。N,N′-甲叉（亞甲基）雙丙烯酰胺催化劑

丙烯酰胺

聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝膠有下列特性：在一定濃度時(shí)，凝膠透明，有彈性，機(jī)械性能好；化學(xué)性能穩(wěn)定，與被分離物不起化學(xué)反應(yīng)，在很多溶劑中不溶；對pH和溫度變化較穩(wěn)定；幾乎無吸附和電滲作用，只要Acr純度高，操作條件一致，則樣品分離重復(fù)性好；樣品不易擴(kuò)散，且用量少，其靈敏度可達(dá)10-6g；凝膠孔徑可調(diào)節(jié)，根據(jù)被分離物的分子量選擇合適的濃度，通過改變單體及交聯(lián)劑的濃度調(diào)節(jié)凝膠的孔徑；分辨率高，尤其在不連續(xù)凝膠電泳中，集濃縮、分子篩和電荷效應(yīng)為一體。因而較醋酸纖維薄膜電泳、瓊脂糖電泳等有更高的分辨率。SDS－PAGE的原理聚丙烯酰胺凝膠電泳是網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，具有分子篩效應(yīng)，蛋白質(zhì)在電泳中保持完整的狀態(tài)，蛋白在其中依三種因素分開：蛋白大小，形狀和電荷。而SDS僅根據(jù)蛋白分子量亞基的不同而分離蛋白。這個(gè)技術(shù)首先是1967年由shapiro建立，他們發(fā)現(xiàn)在樣品介質(zhì)和丙烯酰胺凝膠中加入離子去污劑和強(qiáng)還原劑后，蛋白質(zhì)亞基的電泳遷移率主要取決于亞基分子量的大小，電荷因素可以忽視。SDS（SodiumDodecylSulfate）是陰離子去污劑，作為變性劑和助溶試劑，它能斷裂分子內(nèi)和分子間的氫鍵，使分子去折疊，破壞蛋白分子的二、三級結(jié)構(gòu)。而強(qiáng)還原劑如巰基乙醇，二硫蘇糖醇能使絆胱氨酸殘基間的二硫鍵斷裂。在樣品和凝膠中加入還原劑和SDS后，分子被解聚成多肽鏈，解聚后的氨基酸側(cè)鏈和SDS結(jié)合成蛋白-SDS膠束，所帶的負(fù)電荷大大超過了蛋白原有的蛋白量，這樣就消除了不同分子間的電荷差異和結(jié)構(gòu)差異。因此在電泳時(shí)，蛋白質(zhì)分子的遷移速度則主要取決于蛋白質(zhì)分子大小。不同聚丙烯酰胺凝膠濃度對不同分子量的蛋白質(zhì)混合物分離能力的關(guān)系5％10％15％294566972002945669720029456697200第二部分，酶譜法檢測血清中基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2和MMP-9的活性腫瘤細(xì)胞的侵襲移動CBAD腫瘤細(xì)胞侵襲是指腫瘤細(xì)胞粘附并穿越細(xì)胞外基質(zhì)，包括三個(gè)重要的步驟：粘附于基膜，裂解基膜蛋白形成缺口，細(xì)胞經(jīng)缺口移動。腫瘤細(xì)胞對周圍組織和血管的侵襲是腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟。轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞在原灶外存活和增殖，這是癌癥對人類生命的最大威脅。腫瘤細(xì)胞的侵襲是需要與細(xì)胞增殖、分化、移動的相關(guān)基因及其表達(dá)調(diào)控模式的改變和促進(jìn)細(xì)胞移動的外界因素兩者的共同作用。雖然腫瘤細(xì)胞侵襲的分子機(jī)制還不是十分清楚，但已發(fā)現(xiàn)許多調(diào)控細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵分子及其信號通路。腫瘤細(xì)胞通過其表面受體與ECM中的各種成分粘附后激活或分泌蛋白降解酶類來降解基質(zhì)，從而形成局部溶解區(qū)，構(gòu)成了腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移運(yùn)行通道。一般惡性程度高的腫瘤細(xì)胞具有較強(qiáng)的蛋白水解作用，可侵蝕破壞包膜，促進(jìn)轉(zhuǎn)移。目前較為關(guān)注的酶主要是絲氨酸蛋白酶類，如纖溶酶原激活物(plasminogenactivator,PA)和金屬蛋白酶(metalproteinase,MMP)類，如膠原酶IV、基質(zhì)降解酶、透明質(zhì)酸酶。MMPs家族成員根據(jù)其在細(xì)胞中表達(dá)部位的不同，分為胞質(zhì)型和膜型兩大類。前者分布在胞質(zhì)中，后者表達(dá)在膜上。胞質(zhì)型MMPs根據(jù)其作用底物的特異性、敏感性及氨基酸序列的同源性分為三大類：（1）間質(zhì)膠原酶，包括MMP-1、MMP-5、MMP-8、MMP-13，其作用底物主要為間質(zhì)膠原,即Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅶ、Ⅹ型膠原,但不能降解明膠和Ⅳ型膠原；（2）明膠酶，包括MMP-2和MMP-9,其作用底物主要是Ⅳ型膠原和明膠，還可降解Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ型膠原,但不能降解間質(zhì)膠原；（3）間充質(zhì)溶解素，包括MMP-3、MMP-7、MMP-10和MMP-11，其作用底物主要是基質(zhì)中的蛋白多糖和糖蛋白，如纖維粘連蛋白(FN)、層粘連蛋白(LN)，間充質(zhì)溶解素對膠原的作用不同于間質(zhì)膠原酶和明膠酶，它們能降解Ⅳ、Ⅴ、Ⅷ、Ⅹ型膠原酶以及Ⅰ型膠原的氨基端。通過影響細(xì)胞外基質(zhì)，基質(zhì)金屬蛋白酶蛋白家族參與胚胎發(fā)育、形態(tài)發(fā)生、組織重塑等過程，并參與炎癥、腫瘤、心血管、神經(jīng)等許多疾病過程?；|(zhì)金屬蛋白酶蛋白家族MMP-2又叫明膠酶A，其蛋白主要由纖維結(jié)締組織細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生，分子量為72kDa。MMP-9又稱為明膠酶B，主要由單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞多形核白細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生。分子量為92kDa，是MMPs中分子量最大的酶。中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)載脂蛋白（neutrophil

gelatinaseassociatedlipocalin，NGAL)是1993年Kjeldsen等人在研究MMP-9在細(xì)胞內(nèi)存在形式時(shí)發(fā)現(xiàn)的，它能夠與MMP-9聚合形成異源二聚體，保護(hù)和調(diào)節(jié)MMP-9活性，從而促進(jìn)惡變細(xì)胞的浸潤和轉(zhuǎn)移。檢測MMP-9和MMP-2的活性，對分析腫瘤細(xì)胞惡性程度和預(yù)后提供幫助。MMP-2的結(jié)構(gòu)Pre:信號肽序列Pro:帶巰基的前肽Zn:Zn離子結(jié)合部分II:能結(jié)合膠原的II型纖維結(jié)合素結(jié)構(gòu)域H:絞鏈區(qū)Hemopexin：類血紅素蛋白結(jié)構(gòu)，由四段重復(fù)序列組成，其中第一個(gè)與第四個(gè)間存在一個(gè)二硫鍵。MMP-9的結(jié)構(gòu)由三個(gè)α螺旋與5個(gè)β折疊構(gòu)成含有2個(gè)鋅離子和5個(gè)鈣離子右圖可見一個(gè)小分子化合物位于酶活性中心，并與一個(gè)鋅離子結(jié)合NGAL能與MMP-9以二硫鍵的方式結(jié)合，能起到保護(hù)和調(diào)節(jié)MMP-9功能的作用，所以NGAL與腫瘤的侵襲移動有密切的聯(lián)系。汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室李恩民教授課題組以轉(zhuǎn)染有pcDNA3空白質(zhì)粒載體的SHEEC細(xì)胞為對照，酶譜法檢測結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染有pcDNA-NGAL(-)的SHEEC細(xì)胞分泌的MMP-9和MMP-2的活性均明顯降低；而與此同時(shí)，轉(zhuǎn)染有pcDNA-NGAL(＋)的SHEEC細(xì)胞分泌的MMP-9和MMP-2的活性均明顯升高。表明通過有義、反義技術(shù)使NGAL基因表達(dá)發(fā)生改變可以對SHEEC細(xì)胞分泌的MMP-9和MMP-2的活性產(chǎn)生明顯影響。M：蛋白marker；1.細(xì)胞培養(yǎng)基；2.pcDNA3；3.pcDNA-NGAL(+)；4.pcDNA-NGAL(-)實(shí)驗(yàn)操作樣品制備:血清、血漿和尿樣品可取適量直接與2×SDS樣品緩沖液等體積混勻進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)，如酶活性太高造成顯帶不理想，可適當(dāng)進(jìn)行稀釋;凝膠的制備:

玻璃板對齊后放入夾中垂直卡緊。按表格配10％分離膠，加入TEMED后立即搖勻即可灌膠，灌膠時(shí)，可用5ml加樣槍吸取凝膠沿玻璃板加進(jìn)去，然后膠上加一層異丙醇，以隔離空氣中的氧，促進(jìn)凝膠聚合（灌膠時(shí)開始可快一些，膠面快到所需高度時(shí)要放慢速度。操作時(shí)凝膠一定要沿玻璃板流下，這樣膠中才不會有氣泡）。約幾分鐘后當(dāng)異丙醇和膠之間有一條折射線時(shí)，說明膠已凝了，再等3min使膠充分凝固就可倒去膠上層水并用吸水紙將水吸干。按前面表格配4％的濃縮膠，加入TEMED后立即搖勻即可灌膠。將剩余空間灌滿濃縮膠，然后將梳子插入濃縮膠中。灌膠時(shí)也要使膠沿玻璃板流下以免膠中有氣泡產(chǎn)生。插梳子時(shí)要使梳子保持水平。待到濃縮膠凝固后，兩手分別捏住梳子的兩邊豎直向上輕輕將其拔出;在每個(gè)加樣孔中加入10μl樣品;電泳：在4℃100V下，約2h;凝膠的處理：（1）電泳結(jié)束后，取下凝膠，放入平皿中，用洗滌緩沖液在室溫?fù)u動下洗滌1h，其間換液一次；（2）棄去洗滌緩沖液，然后加入孵育緩沖液沒過膠面，至37℃恒溫箱中，24h后取出；（3）棄去孵育緩沖液，加入0.1%考馬斯亮藍(lán)染液染色約30min