基因工程11大腸桿菌基因工程課件

第十三章大腸桿菌基因工程2023/4/81D基因工程菌的遺傳不穩(wěn)定性及其對策大腸桿菌基因工程C大腸桿菌基因工程菌的構建策略B外源基因在大腸桿菌中高效表達的原理A大腸桿菌作為表達外源基因受體菌的特征E利用重組大腸桿菌生產(chǎn)人胰島素2023/4/82A大腸桿菌作為表達外源基因受體菌的特征大腸桿菌表達外源基因的優(yōu)勢全基因組測序，共有4405個開放型閱讀框架基因克隆表達系統(tǒng)成熟完善繁殖迅速、培養(yǎng)簡單、操作方便、遺傳穩(wěn)定被美國FDA批準為安全的基因工程受體生物2023/4/83B外源基因在大腸桿菌中高效表達的原理啟動子終止子核糖體結(jié)合位點密碼子質(zhì)?？截悢?shù)2023/4/85啟動子啟動子最佳距離的探測目的基因EEAEE啟動子A酶切開Bal31酶解目的基因2023/4/86啟動子的構建-35區(qū)序列-10區(qū)序列PlLPrecAPtrpPlacPtraAPtac啟動子TTGACAGATACTTTGATATATAATTTGACATTAACTTAGACATAATGTTTTACATATAATTTGACATATAATPtac

=3

Ptrp

=11

Plac2023/4/87強終止子的選擇與使用

目前外源基因表達質(zhì)粒中常用的終止子是來自大腸桿菌rRNA操縱子上的rrnT1T2以及T7噬菌體DNA上的Tf。對于一些終止作用較弱的終止子，通?？梢圆捎枚垠w終止子串聯(lián)的特殊結(jié)構，以增強其轉(zhuǎn)錄終止作用2023/4/89核糖體結(jié)合位點

外源基因在大腸桿菌細胞中的高效表達不僅取決于轉(zhuǎn)錄啟動的頻率，而且在很大程度上還與mRNA的翻譯起始效率密切相關。mRNA翻譯的起始效率主要由其5’端的結(jié)構序列所決定，稱為核糖體結(jié)合位點（RBS）2023/4/810大腸桿菌核糖體結(jié)合位點包括下列四個特征結(jié)構要素：位于翻譯起始密碼子上游的6-8個核苷酸序列5’UAAGGAGG3’，即Shine-Dalgarno（SD）序列，它識別并與16SrRNA3’端的3’AUUCCUCC5’專一性結(jié)合，將mRNA定位于核糖體上，從而啟動翻譯；翻譯起始密碼子，大腸桿菌絕大部分基因以AUG作為閱讀框架的起始位點；SD序列與翻譯起始密碼子之間的距離重要而堿基組成不重要；在很多情況下，SD序列位于AUG之前大約七個堿基處。基因編碼區(qū)5’端若干密碼子的堿基組成也較重要，這一序列不能與mRNA的5’端非編碼區(qū)形成莖環(huán)結(jié)構。

核糖體結(jié)合位點的結(jié)構2023/4/811使外源基因上的密碼子在大腸桿菌細胞中獲得最佳表達的策略：外源基因全合成同步表達相關tRNA編碼基因2023/4/813對于那些含有稀有密碼子出現(xiàn)頻率較高、而本身分子量又較大的外源基因而言，選擇相關tRNA編碼基因同步克隆表達的策略較為有利。例如，在人尿激酶原cDNA的412個密碼子中，共含有22個精氨酸密碼子，其中7個AGG、2個AGA，而大腸桿菌受體細胞中tRNAAGG和tRNAAGA的豐度較低。為了提高人尿激酶原cDNA在大腸桿菌中的高效表達，將大腸桿菌的這兩個tRNA編碼基因克隆在另一個高表達的質(zhì)粒上。由此構建的大腸桿菌雙質(zhì)粒系統(tǒng)有效地解除了受體細胞對外源基因高效表達的制約作用。同步表達相關tRNA編碼基因2023/4/814質(zhì)?？截悢?shù)質(zhì)?？截悢?shù)對細菌生長代謝的影響目前廣泛使用的表達型質(zhì)粒在每個大腸桿菌細胞中可達數(shù)百甚至上千個拷貝，質(zhì)粒的擴增過程通常發(fā)生在受體細胞的對數(shù)生長期內(nèi)，正是細菌生理代謝最旺盛的階段。質(zhì)粒分子的過度增殖以及其后目的基因的高效表達勢必會影響受體細胞的生長代謝，進而導致重組質(zhì)粒的不穩(wěn)定性以及目的基因宏觀表達水平的下降解決上述難題的一種有效策略是將重組質(zhì)粒的擴增納入可控制的軌道2023/4/815C大腸桿菌基因工程菌的構建策略包涵體型異源蛋白的表達分泌型異源蛋白的表達融合型異源蛋白的表達寡聚型異源蛋白的表達整合型異源蛋白的表達蛋白酶抗性或缺陷型表達系統(tǒng)的構建2023/4/817包涵體型異源蛋白的表達包涵體及其性質(zhì)

在特定生長條件下，大腸桿菌能積累某種特殊的生物大分子，它們致密地集聚在細胞內(nèi)，或被膜包裹或形成無膜裸露結(jié)構，這種水不溶性的結(jié)構稱為包涵體（InclusionBodies，IB）。由高效表達質(zhì)粒構建的工程菌大量合成異源蛋白質(zhì)，一般情況下也以包涵體的形式存在于細菌細胞內(nèi)。此外包涵體中還含有少量的DNA、RNA和脂多糖等非蛋白分子。2023/4/818以包涵體形式表達目的蛋白的優(yōu)缺點能簡化外源基因表達產(chǎn)物的分離操作包涵體表達形式的優(yōu)點：包涵體的水難溶性及其密度遠大于其它細胞碎片和細胞成分，菌體經(jīng)超聲波裂解后，直接通過高速離心即可將重組異源蛋白從細菌裂解物中分離出來能在一定程度上保持表達產(chǎn)物的結(jié)構穩(wěn)定在形成包涵體之后，大腸桿菌的蛋白酶降解作用對異源重組蛋白的穩(wěn)定性已構不成威脅2023/4/819包涵體型異源蛋白的表達包涵體的變性與復性操作C

共價修飾的蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)變性復性的動力學原理：C1C2CnCUI1InNX1X2XnXAAAAI

有效變復性過程中的中間狀態(tài)X

脫離有效變復性過程而進入集聚的中間狀態(tài)N

天然狀態(tài)的蛋白質(zhì)U

變性狀態(tài)的蛋白質(zhì)A集聚狀態(tài)的蛋白質(zhì)在細菌細胞內(nèi)，集聚狀態(tài)和共價修飾的蛋白質(zhì)不能進入復性過程，因此成為永遠無活性的蛋白質(zhì)。包涵體中的蛋白質(zhì)就屬于這兩種狀態(tài)，因此需要在體外進行人工變性和復性操作。2023/4/821包涵體的溶解與變性：主要任務是拆開錯配的二硫鍵和次級鍵；在人工條件下使蛋白溶解并重新進入復性途徑中。能有效促進包涵體溶解變性的試劑和條件包括：清洗劑

SDS、正十二醇肌氨酸，廉價，但影響復性和純化促溶劑

鹽酸胍、尿素，前者昂貴，尿素便宜，但常被自發(fā)形成的氰酸鹽污染，后者能與多肽鏈中的氨基反應

混合溶劑

如尿素與醋酸、二甲基砜等聯(lián)合使用，溶解力增強極端pH

廉價，但許多蛋白質(zhì)在極端pH條件下發(fā)生修飾反應2023/4/822包涵體的復性與重折疊（refolding）：包涵體的復性與重折疊的主要任務是：通過次級鍵的形成使蛋白質(zhì)復性使多肽鏈中被拆開的游離巰基重新折疊2023/4/823分泌型異源蛋白的表達表達的異源蛋白可通過運輸或分泌方式定位于細胞周質(zhì)，甚至穿過外膜進入培養(yǎng)基中。蛋白產(chǎn)物N端信號肽序列的存在是蛋白質(zhì)分泌的前提條件。2023/4/825以分泌形式表達目的蛋白的優(yōu)缺點分泌表達形式的優(yōu)點：目的蛋白穩(wěn)定性高

重組人胰島素原若分泌到細胞周中，其穩(wěn)定性大約是在細胞質(zhì)中的10倍。目的蛋白易于分離目的蛋白末端完整

真核生物成熟蛋白N端并不含有甲硫氨酸殘基，在大腸桿菌中表達時，N端的甲硫氨酸殘基往往不能被切除。若將外源基因與大腸桿菌的信號肽編碼序列重組在一起，一旦分泌型表達，N端的甲硫氨酸殘基便可在信號肽的剪切過程中被有效除去。

2023/4/826以融合形式表達目的蛋白的優(yōu)缺點目的蛋白穩(wěn)定性高

尤其對分子量較小的多肽效果更佳。目的蛋白易于分離

利用受體蛋白成熟的抗體、配體、底物進行親和層析，可以快速獲得純度較高的融合蛋白。目的蛋白表達率高

與受體蛋白共用一套完善的表達元件。

目的蛋白溶解性好

由于受體蛋白的存在，融合蛋白往往能在胞內(nèi)形成良好的空間構象，且大多具有水溶性。目的蛋白需要回收

融合蛋白需要裂解和進一步分離，才能獲得目的蛋白。在實際生產(chǎn)中，產(chǎn)品主要的成本往往就在該工段。2023/4/829融合型目的蛋白表達系統(tǒng)的構建融合蛋白表達質(zhì)粒的構建原則：受體蛋白能高效表達，可通過親和層析進行特異性簡單純化兩個結(jié)構基因拼接位點處的序列設計直接決定著融合蛋白的裂解工藝外源基因應裝在受體蛋白編碼基因的下游。有時不需要完整的受體結(jié)構基因，以避免融合蛋白分子中兩種組份的分子量過于接近，不利于目的蛋白分離回收兩個蛋白編碼序列應保持一致的翻譯閱讀框架2023/4/830融合型目的蛋白表達系統(tǒng)的構建用于融合蛋白構建的受體蛋白：谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（GST）

維持良好空間構象硫氧化還原蛋白（TrxA）

維持良好空間構象pTrxFus麥芽糖結(jié)合蛋白（MBP）

促進分泌金黃色葡萄球菌蛋白A（SAPA）

免疫親和層析pRIT2T外膜蛋白（OmpF）

促進分泌b-半乳糖苷酶（LacZ）

免疫親和層析泛素蛋白（Ubi）

維持良好空間構象2023/4/831目的蛋白的回收受體蛋白部分的存在可能會影響目的蛋白的空間構象和生物活性；如果注入人體還會導致免疫反應。因此在生產(chǎn)藥用目的蛋白時，將融合蛋白中的受體蛋白部分完整除去是必不可少的工序。融合蛋白的位點專一性斷裂方法有兩種：

化學斷裂法酶促裂解法

2023/4/832目的蛋白的回收

用于蛋白位點專一性化學斷裂的最佳試劑為溴化氰（CNBr）它與多肽鏈中的甲硫氨酸殘基側(cè)鏈的硫醚基反應，生成溴化亞氨內(nèi)酯，后者不穩(wěn)定，在水的作用下肽鍵斷裂，形成兩個多肽降解片段其中上游肽段的甲硫氨酸殘基轉(zhuǎn)化為高絲氨酸殘基，而下游肽段N端的第一位氨基酸殘基保持不變。這一方法的優(yōu)點是回收率高(可達到85%以上)，專一性強，且所產(chǎn)生的目的蛋白的N端不含甲硫氨酸，與真核生物細胞中的成熟表達產(chǎn)物較為接近。然而，如果異源蛋白分子內(nèi)部含有甲硫氨酸殘基，則不能用此方法?；瘜W斷裂法：2023/4/833目的蛋白的回收酶促裂解法：單殘基位點蛋白內(nèi)切酶切割位點梭菌蛋白酶

Arg-C葡萄球菌蛋白酶

Glu-C假單孢菌蛋白酶

Lys-C豬胰蛋白酶

Arg-C

Lys-C蛋白酶酶促裂解法的特點是斷裂效率更高，斷裂位點專一性強。在多肽鏈中的精氨酸、谷氨酸、賴氨酸殘基處切開酰胺鍵，形成不含上述殘基的下游斷裂肽段。但前提條件是外源蛋白分子內(nèi)部不能含有精氨酸、谷氨酸或賴氨酸殘基，而大分子量的異源蛋白含這三種氨基酸殘基的比率相當高。ArgCNNC受體蛋白目的蛋白2023/4/834目的蛋白的回收酶促裂解法：多殘基位點

為克服單一殘基的蛋白酶的應用局限性，可在受體蛋白編碼序列與不含起始密碼子的外源基因之間加裝一段編碼寡肽序列（Ile-Glu-Gly-Arg）的人工接頭DNA片段，該寡肽為具有蛋白酶活性的凝血因子Xa的識別和作用序列，其斷裂位點在Arg的C末端。純化后的融合蛋白用Xa處理，即可獲得目的蛋白。由于Xa的識別作用序列由四個氨基酸殘基組成，大多數(shù)蛋白質(zhì)中出現(xiàn)這種寡肽序列的概率極少，因此可廣泛用于回收各種目的蛋白。2023/4/835目的蛋白的回收酶促裂解法：多殘基位點啟動子受體基因接頭目的基因MetStopIle-Glu-gly-ArgIle-Glu-gly-Arg表達親和層析酶解回收2023/4/836寡聚型異源蛋白的表達通過增加質(zhì)粒拷貝數(shù),以提高目的蛋白產(chǎn)量往往不能獲得滿意的效果。既增加外源基因劑量又能提高目標蛋白產(chǎn)量的有效方法是構建寡聚串聯(lián)型異源蛋白表達載體，即將多個拷貝的外源基因串聯(lián)后克隆在一個低拷貝質(zhì)粒上，以取代高拷貝載體僅含單拷貝外源基因的策略。2023/4/837以寡聚形式表達目的蛋白的優(yōu)缺點目的蛋白高效表達在不提高質(zhì)?？截悢?shù)的前提下，增加目的基因的拷貝數(shù)，可以在一定程度上改善表達量穩(wěn)定表達小分子短肽短肽由于缺乏有效的空間結(jié)構，在細菌細胞中的半衰期較短。串聯(lián)短肽具有與蛋白質(zhì)相似的長度及空間結(jié)構，因而抗蛋白酶降解的能力大幅度提高目的產(chǎn)物回收困難寡聚短肽需要裂解和進一步分離，才能獲最終分子，但裂解后的短肽分子容易出現(xiàn)序列不均一性2023/4/838寡聚型目的蛋白表達系統(tǒng)的構建PSDgenegenegenegeneT1T2H2NCOOHMetMetMetMetmRNACNBr基本戰(zhàn)略：2023/4/839整合型異源蛋白的表達以整合形式表達目的蛋白的優(yōu)缺點目的基因穩(wěn)定表達整合型的目的基因隨受體細胞染色體DNA的復制而復制，相當穩(wěn)定，工程菌在沒有選擇壓力存在下可以連續(xù)培養(yǎng)而不丟失目的基因表達盒，這對以改良物種遺傳性狀為目的基因工程案例特別有意義目的基因表達率低單拷貝整合的目的基因表達率受到限制，此時可通過強化表達元件而加以補償2023/4/840DNA體內(nèi)重組的基本原理在生物體細胞尤其是原核細菌細胞內(nèi)，廣泛存在著DNA的遺傳重組機制，可能的生物學功能是促進生物種群的進化。細胞內(nèi)的遺傳重組可分為兩大類：

轉(zhuǎn)座因子依賴型同源序列依賴型2023/4/841

在原核細胞中，染色體DNA鏈上的兩個同源區(qū)之間可發(fā)生同源重組。距離越遠、長度越長、同源性越高，重組的頻率也就越高，反之亦然。同源重組有整合和交換兩種形式同源序列依賴型的體內(nèi)重組：基本形式2023/4/842同源序列依賴型的體內(nèi)重組：同源整合ori目的基因同源區(qū)域標記基因整合位點染色體DNA2023/4/843同源序列依賴型的體內(nèi)重組：同源交換ori目的基因同源區(qū)域標記基因交換區(qū)域染色體DNAori標記基因+2023/4/844蛋白酶抗性或缺陷型表達系統(tǒng)的構建重組目的蛋白表達后都會面臨被降解的命運。重組目的蛋白的不穩(wěn)定性源于對受體細胞蛋白酶系統(tǒng)的敏感性。重組蛋白的半衰期可以通過序列的人工設計以及受體細胞的改造加以控制。2023/4/845大多數(shù)不穩(wěn)定的重組目的蛋白是被大腸桿菌中的蛋白酶La和Ti降解的，兩者分別由lon和clp基因編碼。lon-的大腸桿菌突變株可使半衰期較短的細蛋白穩(wěn)定性大增，因此被廣泛用作外源基因高效表達的受體菌。蛋白酶缺陷型受體細胞的改造lon基因缺陷的大腸桿菌受體（lon-）：2023/4/846

大腸桿菌中的熱休克蛋白可脅迫異源蛋白形成一種對蛋白酶降解較有利的構象，從而提高異源蛋白對蛋白酶的敏感性。lon-htpR-的雙缺陷株非常適合高效表達不穩(wěn)定的重組異源蛋白。htpR基因缺陷的大腸桿菌受體（htpR-）：2023/4/847Asp離C末端越近，蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性就越大。在蛋白質(zhì)C末端引入Asp，能顯著延長半衰期?？沟鞍酌傅闹亟M異源蛋白序列的設計多肽鏈C末端氨基酸序列對穩(wěn)定性的影響：2023/4/848多肽鏈的N末端序列中含有較高比例的Ala、Asn、Cys、Gln、His，穩(wěn)定性顯著改善。N末端含有Pro、Glu、Ser、Thr，半衰期通常很短。尤其Pro-Glu-Ser-Thr序列（PEST序列），是蛋白酶的超敏感區(qū)。多肽鏈N末端氨基酸序列對穩(wěn)定性的影響：2023/4/849D基因工程菌的遺傳不穩(wěn)定性及其對策基因工程菌遺傳不穩(wěn)定性的表現(xiàn)與機制改善基因工程菌不穩(wěn)定性的策略2023/4/850基因工程菌遺傳不穩(wěn)定性的表現(xiàn)與機制工程菌遺傳不穩(wěn)定性的表現(xiàn)形式

基因工程菌的遺傳不穩(wěn)定性主要表現(xiàn)在重組質(zhì)粒的不穩(wěn)定性，這種不穩(wěn)定性具有下列兩種表現(xiàn)形式：結(jié)構不穩(wěn)定性重組DNA分子上某一區(qū)域發(fā)生缺失、重排、修飾，導致其表觀生物學功能的喪失分配不穩(wěn)定性整個重組DNA分子從受體細胞中逃逸（curing）2023/4/851改善基因工程菌不穩(wěn)定性的策略改進載體受體系統(tǒng)

以增大質(zhì)粒穩(wěn)定性為目的的構建方法包括：將parB基因引入表達型載體中，其產(chǎn)物可選擇性地殺死由于分配不均勻所產(chǎn)生的無質(zhì)粒細胞正確設置載體上的多克隆位點，禁止DNA片段插在穩(wěn)定區(qū)內(nèi)將致死性基因如sacB安裝在載體上2023/4/852施加選擇壓力根據(jù)載體上的抗藥性標記，向培養(yǎng)系統(tǒng)中添加相應的抗生素藥物和食品生產(chǎn)時禁止使用抗生素根據(jù)載體上的營養(yǎng)缺陷型標記，向培養(yǎng)系統(tǒng)中添加相應的營養(yǎng)組份培養(yǎng)基復雜，成本較高2023/4/853控制目的基因的過量表達使用可控型啟動子使用可控型復制子培養(yǎng)基組成：限制培養(yǎng)基比豐富培養(yǎng)基更有利于穩(wěn)定培養(yǎng)溫度：較低的培養(yǎng)溫度有利于重組質(zhì)粒的穩(wěn)定2023/4/854E利用重組大腸桿菌生產(chǎn)人胰島素胰島素的結(jié)構及其生物合成人胰島素的生產(chǎn)方法重組人胰島素的大腸桿菌工程菌的構建2023/4/855胰島素的結(jié)構及其生物合成SSSSCNSSB肽（30）C肽（31）A肽（21）RRRKSSSSCNSSNC高爾基體內(nèi)的特異性肽酶NC信號肽B肽C肽A肽信號肽酶2023/4/856人胰島素的生產(chǎn)方法直接提取法制人胰島素迄今為止，有四種大規(guī)模生產(chǎn)人胰島素的方法：早期人的胰島素是從人的胰臟中直接分離純化的，產(chǎn)量遠遠不能滿足日益增多的糖尿病人的臨床需求。2023/4/857人胰島素的生產(chǎn)方法化學合成法制人胰島素根據(jù)人胰島素A鏈和B鏈的序列，由單個氨基酸從頭合成。這條化學全合成的路線從技術上來說是能夠做到的，但生產(chǎn)成本奇高，限制了廣泛應用。2023/4/858人胰島素的生產(chǎn)方法化學轉(zhuǎn)型法制人胰島素

豬的胰島素可從原料豐富的豬胰臟中提取獲得，而且豬胰島素與人胰島素只在B鏈的C末端有一個氨基酸的差異，豬的為Ala，人的為Thr，因此將豬胰島素在體外酶促轉(zhuǎn)化為人胰島素不失為一種選擇。技術路線是：在pH為6-7的有機相中使胰蛋白酶催化其逆反應，該酶在過量的蘇氨酸叔丁酯的存在下，將豬胰島素B鏈C末端的丙氨酸交換下來，所形成的胰島素叔丁酯再用三氯乙酸脫去叔丁酯基團，最終獲得人胰島素。該過程的總轉(zhuǎn)化率為60%。但工藝路線耗時，分離純化操作復雜，產(chǎn)品的價格不菲。2023/4/859基因工程法制人胰島素

1982年，美國ElyLiLi公司首先使用重組大腸桿菌生產(chǎn)人胰島素，成為世界上第一個上市的基因工程藥物。1987年，Novo公司又推出了利用重組酵母菌生產(chǎn)人胰島素的新工藝。

上述由基因工程菌合成的重組人胰島素在體外胰島素受體結(jié)合性能、淋巴細胞和成纖維細胞的應答能力、降血糖作用、血漿藥代動力學等指標上均與天然胰島素沒有任何區(qū)別，而且還具有無免疫原性、注射吸收迅速等優(yōu)點，充分展示了基因工程在生物醫(yī)藥領域中的巨大潛力。2023/4/860重組人胰島素的大腸桿菌工程菌的構建A鏈和B鏈分別表達法基因工程菌的構建戰(zhàn)略：tactacb-Galb-GalApeptideBpeptideorioriAprAprMetMetMetMetMMNCMMNC化學合成A鏈和B鏈的編碼序列2023/4/861表達產(chǎn)物的后處理路線：MMNCMMNCb-Galb-GalABCNBr處理NCSSSSCNSSNCNCNCNCCys體外氧化和重折疊分離純化2023/4/862A鏈和B鏈分別表達法生產(chǎn)技術的評價：

由于A鏈和B