現(xiàn)代遺傳學(xué)14遺傳工程學(xué)課件

第十四章遺傳工程利用轉(zhuǎn)基因手段對生物進(jìn)行人為改造的技術(shù)什么是遺傳工程？

體外DNA重組技術(shù)：利用工具酶將外源片段和載體連接，導(dǎo)入生物體并使其穩(wěn)定復(fù)制和傳代的技術(shù)目的研究工作生物產(chǎn)品(生物反應(yīng)器)改良物種(提高品質(zhì))基因治療限制性內(nèi)切酶II及其產(chǎn)生的3種不同末端5'突出的粘性末端3'突出的粘性末端平末端EcoRIEcoRVPstIPPPPPP同切酶和同粘酶同切酶:識別相同的位點(diǎn),但生成不同的末端.同粘酶:識別不同的位點(diǎn),但產(chǎn)生相同的粘性末端SmaI

5′...CCC^GGG...3′3′...GGG^CCC...5′XmaI

5′...C^CCGGG...3′3′...GGGCC^C...5′同切酶連接酶及其對底物的要求:T4Ligase,EcoliLigase底物:自由5’末端和自由3’末端,5’末端帶磷酸基團(tuán)反應(yīng)條件：Mg++，ATP存在聚合酶(polymerase):DNA聚合酶I,klenow片段,Taq,Pfu,末端轉(zhuǎn)移酶外切核酸酶(exonuclease):exoIII,S1核酸酶,DNaseI脫磷酸酶(dephosphatase):堿性磷酸酯酶CIP磷酸化酶,激酶(kinase)逆轉(zhuǎn)錄酶(reversetranscriptase)RNaseH,RNaseA甲基化酶(methylase)其它工具酶載體及其構(gòu)成基本要素能獨(dú)立復(fù)制并穩(wěn)定傳代:復(fù)制起始點(diǎn)ori或自主復(fù)制序列ARS和著絲粒,端粒方便插入外源片段:單酶切位點(diǎn)選擇標(biāo)記:藥物抗性報(bào)告基因:插入篩選標(biāo)記易分離提取高產(chǎn)率（多拷貝）強(qiáng)啟動(dòng)子多宿主宿主繁殖快,易于培養(yǎng),能夠快速得到產(chǎn)物對所攜帶基因的表達(dá)產(chǎn)物具有較高耐受性,具有克隆最多種基因的可能突變率低,能夠穩(wěn)定忠實(shí)的保存被克隆基因常用宿主大腸桿菌:繁殖快,易培養(yǎng),易分離產(chǎn)物噬菌體:轉(zhuǎn)化效率高,易于保存酵母:繁殖最快的真核生物,適于有蛋白質(zhì)加工的基因表達(dá)lacZ如何提高克隆效率?提高插入片段和載體的比例盡可能采用粘端連接*載體脫磷以降低載體自連插入片段磷酸化改進(jìn)轉(zhuǎn)化條件問題:有一外源片段用某種酶切,生成了5′突出粘性末端5′-GATC,但是載體上的單酶切位點(diǎn)只能生成下面這幾種粘性末端:5′-CTAG5′-TCGA5′-TTAA應(yīng)當(dāng)采用怎樣的策略來提高連接效率?不依賴于內(nèi)切酶和連接酶的體外重組

位點(diǎn)專一性重組（依賴于短片段同源序列的重組）cosN,LoxPTransform+reportgenesubstrates篩選DNA文庫用標(biāo)記的核酸作為探針用誘餌質(zhì)粒篩選表達(dá)cDNA文庫探針標(biāo)記標(biāo)記物：同位素標(biāo)記：32P非放射性標(biāo)記：熒光標(biāo)記，生物素，dig(地高辛）等變性模板DNA隨機(jī)6核苷酸引物，dNTP,某種標(biāo)記dNTPDNAPolI5‘隨機(jī)引物標(biāo)記的DNA片段REMOVEREMOVEInsertedDNAcodingProteinfordetectionGAL4-ADlacZbaitDNAInsertedDNAcodingProteinfordetectionGAL4-ADlacZbaitDNABaitDNABaitDNAPCR技術(shù)及其應(yīng)用應(yīng)用范圍：檢測和診斷（高靈敏度）基因克?。╡g:通過部分已知序列擴(kuò)增未知目標(biāo)片段其他常用分子生物學(xué)技術(shù)丙烯酰氨凝膠電泳（PAGE）脈沖電泳雙向電泳Southern雜交northern雜交western雜交轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物和基因治療轉(zhuǎn)基因動(dòng)物：醫(yī)學(xué)研究，生物制藥轉(zhuǎn)基因植物：改良品質(zhì)，提高抗逆能力