丙型肝炎臨床檢驗(yàn)技術(shù)發(fā)展現(xiàn)狀與展望

丙型肝炎臨床檢驗(yàn)技術(shù)發(fā)展現(xiàn)狀與展望丙型肝炎臨床檢驗(yàn)技術(shù)進(jìn)展現(xiàn)狀與展望

丙型肝炎臨床檢驗(yàn)技術(shù)進(jìn)展現(xiàn)狀與展望

：黃華

【關(guān)鍵詞】HCV抗原檢測(cè)核心抗原核酸檢測(cè)技術(shù)（NAT）同時(shí)檢測(cè)

丙型肝炎是由丙型肝炎病毒（HCV）感染引起的一種重要的世界性傳染病[1],這種病毒主要經(jīng)由血液傳播，也可能存在其他傳播途徑如母嬰傳播、性傳播和家庭內(nèi)接觸傳播。約有近半數(shù)的HCV感染傳播途徑不明確。丙型肝炎的流行呈全球性，是歐美及日本等國家終末期肝病的最主要緣由。依據(jù)WHO統(tǒng)計(jì)，全球HCV的感染率約為3%,估量約2億人感染了HCV,每年新發(fā)丙型肝炎病例約有3.5萬例。目前尚無治療丙型肝炎的疫苗，也沒有有效的治療方法。因此防控丙型肝炎傳染源及阻斷傳播途徑最為有效的手段就是早期精確?????診斷并準(zhǔn)時(shí)發(fā)覺HCV感染者。從傳染源和傳播途徑兩方面掌握丙型肝炎[2].正由于如此世界各國都在不遺余力地討論診斷丙型肝炎的新技術(shù)。自1989年建立了丙肝病毒抗-HCV檢測(cè)方法以來，隨著醫(yī)學(xué)檢測(cè)技術(shù)和儀器的不斷進(jìn)展，丙型肝炎的檢測(cè)技術(shù)始終處于不斷進(jìn)展中。到目前為止，丙型肝炎檢測(cè)技術(shù)主要有抗-HCV檢測(cè)、HCV-RNA核酸擴(kuò)增檢測(cè)、HCV核心抗原的檢測(cè)以及同時(shí)檢測(cè)抗-HCV和HCV核心抗原4種類型。本文將對(duì)丙型肝炎臨床檢驗(yàn)技術(shù)的進(jìn)展與展望做一綜述，現(xiàn)報(bào)道如下。

1抗-HCV的檢測(cè)

最早消失的HCV檢測(cè)技術(shù)是抗-HCV的檢測(cè)。由于HCV在病人外周血液中的含量及病毒抗原的含量很低，這就使得用常規(guī)方法難以直接檢測(cè)，經(jīng)過十幾年的不斷改進(jìn)和進(jìn)展，其檢測(cè)方法又演化出多種，如：雙抗原夾心ELISA、間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（間接ELISA）、重組免疫印跡法（RIBA）、蛋白芯片檢測(cè)法以及免疫層析法。在這些方法之中，重組免疫印跡法（RIBA）是抗體檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)，蛋白芯片檢測(cè)法主要用于抗-HCV的分型。而ELISA由于其操作簡(jiǎn)潔，檢測(cè)設(shè)備廉價(jià)，因此成為應(yīng)用最廣的抗體檢測(cè)技術(shù)。

依據(jù)消失時(shí)間的先后以及使用抗原的不同，抗-HCV檢測(cè)技術(shù)可分成三代。第一代抗-HCVIgG試劑盒所用的抗原來自病毒基因組非結(jié)構(gòu)區(qū)（C100），它的使用使HCV的輸血感染率下降了80%以上。但其缺陷是：靈敏度較低，抗體檢出時(shí)間較晚，敏感性也較高，達(dá)到80%——90%,但假陽性較高。其次代試劑除了包被C100抗原外又加入了HCV核心區(qū)多肽C22—3和非結(jié)構(gòu)區(qū)抗原C33C.抗-C22-3和抗-C33C感染后消失較早，敏感性和特異性明顯提高，感染后8——12周即可檢測(cè)。且對(duì)HCV的特異性較好，二者聯(lián)合應(yīng)用可進(jìn)一步提高檢出率。第三代HCV抗體ELISA試劑中采納了重組的NSS多肽，核心區(qū)抗原比例相對(duì)下降，而相應(yīng)地增加了非結(jié)構(gòu)區(qū)的NSS區(qū)C33C抗原的比例，添加了NSS區(qū)抗原使其敏感性和特異性得到進(jìn)一步改善。

上述三代抗-HCV檢測(cè)方法多采納間接ELISA,雖然也有過雙抗原夾心直接檢測(cè)抗-HCV的報(bào)道[3],但由于HCV抗原存在不穩(wěn)定性，因此至今仍無商品化的試劑盒。目前我國市售的抗-HCV試劑盒普遍是采納間接法的第三代抗-HCVELISA試劑盒和膠體金試劑盒，其特異性可以達(dá)到92%——100%.但由于各廠家使用的HCV基因重組抗原的質(zhì)量和各抗原片段包被比例有所不同，從而使各廠家試劑的靈敏度和特異性存在肯定的差異，導(dǎo)致抗一HCV檢測(cè)結(jié)果的不全都，產(chǎn)生漏檢和假陽性等[4],未能解決在正常ALT者和健康獻(xiàn)血者存在的假陽性問題。加上少部分免疫功能不正常的HCV感染者，則不能檢出抗一HCV.另外，由于“窗口期”的存在，仍有肯定的漏檢率[5].目前抗-HCV的.檢測(cè)方法仍有改進(jìn)的潛力，隨著對(duì)HCV的討論不斷深化，更多的HCV蛋白會(huì)被發(fā)覺，其中新型核心蛋白和外膜蛋白被認(rèn)為能有效提高抗-HCV的靈敏度，但其對(duì)抗體的檢出率依靠于抗原的獲得方法，可能與抗原的構(gòu)象表位有關(guān)[6,7].

2HCV-RNA核酸擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)（Nucleic-acidAmplificationTechnologyNAT）

從外周血中檢出HCVRNA是HCV復(fù)制活躍的牢靠指標(biāo)，在感染2個(gè)星期內(nèi)的血清中可檢測(cè)到HCVRNA,在感染自然恢復(fù)前血清中HCVRNA將達(dá)到一個(gè)高峰[8],目前NAT檢測(cè)被國內(nèi)外部分機(jī)構(gòu)作為HCV感染的確認(rèn)方法。但HCVRNA在達(dá)到峰值或重新消失前數(shù)天或數(shù)周內(nèi)間或也可能檢測(cè)不到[9].同時(shí)HCVRNA還受進(jìn)食的影響，易與血中脂質(zhì)及脂蛋白結(jié)合，降低檢出率[10].因此在肯定程度上影響了NAT檢測(cè)方法的完善。另外由于NAT檢測(cè)技術(shù)本身在技術(shù)和設(shè)備上要求較高，且耗時(shí)、試驗(yàn)步驟較多（其中任何步驟消失問題均影響其檢出），因此該方法也簡(jiǎn)單因污染而消失假陽性，難以在常規(guī)工作或基層試驗(yàn)室推廣，限制了其應(yīng)用的普遍性。

NAT檢測(cè)技術(shù)同為檢測(cè)HCVRNA,但不同的廠商進(jìn)展出不同的方法和技術(shù)，其中PCR技術(shù)進(jìn)展得最為快速，也得到了最廣泛的應(yīng)用，最早的是RT-PCR,然后是套式PCR,現(xiàn)在是實(shí)時(shí)熒光定量PCR,檢測(cè)靈敏度特異性不斷提高，且實(shí)現(xiàn)了全自動(dòng)定量檢測(cè)。最新的NAT討論有環(huán)介導(dǎo)等溫基因擴(kuò)增技術(shù)（LAMP）以及基因芯片技術(shù)[11,12],由于LAMP技術(shù)操作簡(jiǎn)潔，且無需特別儀器，具有寬闊的應(yīng)用前景。

3HCV抗原的檢測(cè)

目前報(bào)道有兩類HCV抗原包括非結(jié)構(gòu)抗原和核心抗原的檢測(cè)可作為HCV感染的指標(biāo)。血清中HCV抗原的檢測(cè)有利于HCV感染患者的早期發(fā)覺，特殊是某些免疫功能紊亂、免疫功能低下的患者和某些不產(chǎn)生抗體的攜帶者。HCV核心抗原與HCVRNA的動(dòng)力學(xué)變化親密相關(guān)，可以作為HCV復(fù)制的標(biāo)志[13].

近年來對(duì)HCV抗原的檢測(cè)方法的討論不斷取得進(jìn)展，關(guān)鍵點(diǎn)在于單克隆抗體的研制以及抗原抗體復(fù)合物解離劑的討論。近期美國Ortho公司已推出了用雙抗體夾心法定性或定量檢測(cè)血清樣品中總的或游離的HCV核心抗原ELISA試劑盒，與RT-PCR方法相比，具有操作簡(jiǎn)潔、耗時(shí)短、對(duì)試驗(yàn)環(huán)境要求較低以及假陽性率低等特點(diǎn)，在臨床上可用于HCV血清學(xué)轉(zhuǎn)換前的早期急性丙型肝炎診斷、抗-HCV陽性感染者的病毒血癥分析以及HCV感染者治療前后病毒血癥追蹤分析等[14].HCV核心抗原存在的時(shí)間較短（約27——70d），所以HCV核心抗原的檢測(cè)還要結(jié)合抗-HCV的結(jié)果。同時(shí)HCV核心區(qū)基因的變異也可能影響了HCV核心抗原的檢測(cè)，比如HCV核心區(qū)49位氨基酸的突變就降低了抗原測(cè)定的敏感性[15].改進(jìn)現(xiàn)行試劑盒的主要途徑是提高單克隆抗體對(duì)于自然?抗原的構(gòu)象表位的親和力。

對(duì)于非結(jié)構(gòu)蛋白的檢測(cè)主要為NS3、NS4和NS5位點(diǎn)的蛋白[16],由于這部分蛋白消失變異的概率較大，目前僅見報(bào)道。

4同時(shí)檢測(cè)抗-HCV和HCV核心抗原

聯(lián)合檢測(cè)抗原抗體的思路是HCV篩查試劑盒和血清學(xué)檢測(cè)的進(jìn)展方向。目前主要把HCV核心抗原和外周蛋白抗體及部分核心抗體相結(jié)合的檢測(cè)試劑盒[17].HCV核心抗原是HCV感染者體內(nèi)消失的早期感染指標(biāo)，幾乎與HCVRNA同時(shí)消失，核心抗原和HCVRNA的動(dòng)力學(xué)變化親密相關(guān)。

HCV核心抗原檢測(cè)用雙抗體夾心法定性或定量檢測(cè)血清樣品中的HCV核心抗原。該方法不受被檢測(cè)樣品中抗-HCV的干擾，檢測(cè)結(jié)果精確?????牢靠?？捎糜贖CV早期急性丙型肝炎診斷，抗-HCV陽性感染者的病毒血癥分析以及HCV感染者治療前后病毒血癥追蹤分析[18].目前已有兩家商品化的試劑盒面世，但是這兩種試劑盒都使用兩步檢測(cè)，而且檢測(cè)時(shí)間都較長(zhǎng)（超過2h），不利于快速的篩查和POCT工作。另外這兩種試劑盒都不能區(qū)分陽性樣本中抗原和抗體的存在狀況，不利于進(jìn)一步分析病情。

綜上所述，無論HCV檢測(cè)技術(shù)的怎么進(jìn)展，都必需秉著快速、精確?????和有效這些原則。由此可以猜測(cè)將來HCV檢測(cè)技術(shù)會(huì)朝著兩個(gè)方向進(jìn)展，一方面是要求技術(shù)上的快速、精確反應(yīng)HCV感染狀況的檢測(cè)，降低假陽性的概率，使人們盡早發(fā)覺病情。另一方面是有助于治療HCV和療效觀看的檢測(cè)，不斷優(yōu)化治療HCV的方法，爭(zhēng)取早日討論出治療HCV的疫苗。對(duì)于第一種方向，人們較為簡(jiǎn)單理解，由于隨著試驗(yàn)技術(shù)的不斷進(jìn)步，HCV檢測(cè)的靈敏度逐步提高，HCV感染的“窗口期”將不斷縮短。其次種方向也是當(dāng)前分子診斷領(lǐng)域的方向，人們可以通過新的檢測(cè)方法或是幾種HCV檢測(cè)方法的綜合應(yīng)用來推斷病人的病情，從而賜予臨床治療供應(yīng)準(zhǔn)時(shí)關(guān)心和指導(dǎo)。

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