氧化應(yīng)激損傷的生物化學(xué)診斷

氧化應(yīng)激損傷的生物化學(xué)診斷第1頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期五教學(xué)目標(biāo)與要求

掌握：自由基、活性氧、氧化應(yīng)激、歧化反應(yīng)的概念及脂質(zhì)過氧化作用。氧化應(yīng)激指標(biāo)的種類。

熟悉：氧化應(yīng)激的損傷效應(yīng)；主要活性氧、過氧化脂質(zhì)、抗氧化酶、NO與NOS以及常用抗氧化劑的常用檢測(cè)方法的原理及方法學(xué)評(píng)價(jià)。

了解：心肌缺血再灌注、衰老的概念；氧化應(yīng)激的原因，抗氧化損傷的防御系統(tǒng)組成與作用。2第2頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期五目錄

氧化應(yīng)激的生物化學(xué)基礎(chǔ)

1氧化應(yīng)激的生物學(xué)效應(yīng)

2抗氧化應(yīng)激損傷的防御系統(tǒng)3氧化應(yīng)激與臨床疾病的關(guān)系4氧化應(yīng)激指標(biāo)的檢測(cè)方法及評(píng)價(jià)5小結(jié)與展望6返回總目錄3第3頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期五第一節(jié)氧化應(yīng)激的生物化學(xué)基礎(chǔ)一、氧化應(yīng)激的概念氧化應(yīng)激（oxidativestress,OS）是指多種原因致使體內(nèi)的活性氧(ROS)

、活性氮(RNS)等相關(guān)物質(zhì)產(chǎn)生過多，氧化程度超出氧化物的清除，氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)失衡，從而導(dǎo)致分子、細(xì)胞和機(jī)體的損傷。4第4頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期五活性氧(reactiveoxygenspecies,ROS)如：超氧陰離子(O2)、過氧化氫（H2O2）、單線態(tài)氧（1O2）、氫過氧化物（ROOH）

氧自由基（oxygenradical）活性氮(reactivenitrogenspecies,RNS)如：一氧化氮（NO）、過氧亞硝酸根（ONOO－）5第5頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期五(一)外源性因素1．電離輻射及大氣污染γ和X射線等；2．藥物解熱鎮(zhèn)痛藥、抗結(jié)核藥；3．其他環(huán)境污染的鎘、水銀、鉛等重金屬離子。二、氧化應(yīng)激產(chǎn)生的原因6第6頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期五(二)內(nèi)源性因素1．O2的產(chǎn)生·2．·OH的產(chǎn)生3．吞噬細(xì)胞中活性氧的產(chǎn)生4．脂質(zhì)過氧化作用7第7頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期五1.O2的產(chǎn)生·SQ·+O2Q+O2·通過線粒體的輔酶Q·半醌、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上細(xì)胞色素P450和Hb、肌紅蛋白、腎上腺素等自氧化作用均可產(chǎn)生O2

·

8第8頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期五黃嘌呤氧化酶黃嘌呤＋2O2＋H2O尿酸＋2O2＋2H+·

酶促氧化過程中均可產(chǎn)生O2·

胞液中的黃嘌呤氧化酶與醛氧化酶

線粒體中的黃素蛋白酶

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的NADPH-細(xì)胞色素P450還原酶

質(zhì)膜上的NADPH氧化酶等9第9頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期五2．·OH的產(chǎn)生O2+O2+2H+H2O2+O2(歧化反應(yīng))··過渡金屬離子O2＋H2O2O2＋·OH＋OH－(Fenton反應(yīng))·主要是通過Fenton反應(yīng)由O2直接衍生形成：·

歧化反應(yīng)是指反應(yīng)中的某種底物既能作為還原劑供應(yīng)電子，又可作為氧化劑接受電子。上述反應(yīng)中的O2就承擔(dān)這種角色，故屬于歧化反應(yīng)?！?0第10頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期五過氧化物酶體中多種需氧脫氫酶催化生成的H2O2，如不迅速被分解，在Fe2+的催化下也可生·OH。H2O2＋Fe2++H+

·OH＋H2O＋Fe3+11第11頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期五

3．吞噬細(xì)胞中活性氧的產(chǎn)生

H2O2除可生成·OH外，在Cl－存在時(shí)，經(jīng)髓過氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)的作用，生成活性很強(qiáng)的次氯酸(HOCl)和1O2，1O2是一個(gè)強(qiáng)的親電子性的氧化劑。MPOH2O2＋Cl－H2O＋OCl－OCl－＋H2O2H2O＋1O2＋Cl－MPO12第12頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期五4．脂質(zhì)過氧化作用(lipidperoxidation)在過氧化條件下，脂過氧化物

LOOH是不穩(wěn)定的，能分解成一系列復(fù)雜產(chǎn)物。通常以小分子降解產(chǎn)物的數(shù)量來表示脂質(zhì)過氧化的程度。定義：機(jī)體產(chǎn)生的活性氧，攻擊生物膜磷脂中的多聚不飽和脂肪酸(polyunsaturatedfattyacid,PUFA)引發(fā)一種自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，鏈?zhǔn)降禺a(chǎn)生脂質(zhì)過氧化物，這種作用就稱～。返回章目錄13第13頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期五一、氧化應(yīng)激對(duì)機(jī)體的生理作用第二節(jié)氧化應(yīng)激的生物學(xué)效應(yīng)

(一)吞噬細(xì)胞殺滅外來病原微生物吞噬作用所產(chǎn)生的活性氧如H2O2、O2、·OH、1O2和HOCl等可用來殺滅外來病原微生物?！?4第14頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期五合成凝血酶原時(shí)，凝血酶原前體的羧化過程需要O2和CO2反應(yīng)形成的“活性碳”?！?二)參與合成某些重要的生物活性物質(zhì)合成前列腺素時(shí)需要H2O2和O2的參與?！⑴c第二信使cAMP和cGMP的激活等過程。15第15頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期五氨基酸的氧化脫氨作用需自由基的參與；核糖核苷的還原過程需自由基的參與。(三)參與許多酶促反應(yīng)羥脯氨酸、羥賴氨酸的酶促羥化作用需要O2，·OH，H2O2或1O2的參與；·(四)參與解毒作用外來物質(zhì)通過細(xì)胞色素P450的羥化作用達(dá)到解毒作用，O2

參與了羥化作用?！?6第16頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期五自由基參與一系列的連鎖反應(yīng)，能引起細(xì)胞生物膜上的脂質(zhì)過氧化，引起細(xì)胞損傷。其機(jī)制比較復(fù)雜，主要有三方面：膜脂改變導(dǎo)致膜功能的障礙和膜酶的損傷；脂質(zhì)過氧化過程中生成的活性氧對(duì)酶和其他成分的損傷；LOOH的分解產(chǎn)物特別是醛類產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞及其成分的毒性作用。二、氧化應(yīng)激對(duì)機(jī)體的損害效應(yīng)17第17頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期五(一)氧化應(yīng)激對(duì)脂類和細(xì)胞膜的破壞膜內(nèi)不飽和脂肪酸減少；膜結(jié)構(gòu)遭到破壞，使其流動(dòng)性、通透性、離子轉(zhuǎn)運(yùn)及屏障功能受損；溶酶體酶釋放，線粒粒膨脹、酶失活等損傷；紅細(xì)胞膜破裂導(dǎo)致溶血；LOOH進(jìn)一步分解產(chǎn)生醛類，尤其是丙二醛(MDA)可作為交聯(lián)劑導(dǎo)致分子間的交聯(lián)聚合。胞膜的損害則會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞代謝、功能和結(jié)構(gòu)的改變，后者是許多疾病的病理基礎(chǔ)，從而可引起許多病變。18第18頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期五(二)氧化應(yīng)激對(duì)蛋白質(zhì)和酶的損害直接作用于蛋白質(zhì)（Pr），與最鄰近的氨基酸（AA）發(fā)生Pr過氧化；通過LOOH間接作用于Pr，使多肽鏈斷裂或與個(gè)別AA發(fā)生氧化或使Pr交聯(lián)，從而使Pr的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，導(dǎo)致細(xì)胞功能紊亂。

19第19頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期五脂質(zhì)過氧化、電離輻射、其他產(chǎn)生的自由基的反應(yīng)可通過多種途徑影響酶活性:通過自由基鏈反應(yīng)，使酶分子發(fā)生聚合；通過LOOH中的MDA使酶分子發(fā)生交聯(lián)；通過破壞酶分子中AA以及與酶分子中的金屬離子反應(yīng)。20第20頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期五使DNA鏈斷裂或堿基破壞、缺失，使核酸分子的完整性和構(gòu)型受到破壞，造成遺傳信息改變；(三)氧化應(yīng)激對(duì)核酸和染色體的損害自由基對(duì)DNA的破壞可導(dǎo)致染色體變異；電離輻射和化學(xué)物質(zhì)使受損細(xì)胞的染色體斷裂。輻射作用于核酸環(huán)境中的水分子，使其電解產(chǎn)生·OH和O2，輻射可使DNA主鏈斷裂、堿基降解和氫鍵破壞；·21第21頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期五(四)氧化應(yīng)激對(duì)糖分子的損害使核糖、脫氧核糖形成脫氫自由基，從而造成DNA主鏈斷裂或堿基破壞；使細(xì)胞膜中的糖分子羥基化，破壞細(xì)胞膜上的多糖結(jié)構(gòu)，影響細(xì)胞功能的發(fā)揮；通過氧化降解使多糖破壞，影響組織功能。

脂類、蛋白質(zhì)、核酸、糖類一旦受損，生命活動(dòng)將受到威脅，導(dǎo)致細(xì)胞受損，機(jī)體患病，如動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病、腫瘤、胃腸道功能失調(diào)、感染、免疫失調(diào)等。返回章目錄22第22頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期五一、抗氧化酶類第三節(jié)抗氧化應(yīng)激損傷的防御系統(tǒng)超氧化物歧化酶（SOD）過氧化氫酶（CAT）硒谷胱甘肽過氧化物酶（SeGSHPx）谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶（GST）與抗氧化作用相關(guān)的其他酶（如醛酮還原酶）23第23頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期五超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,SOD)SOD是金屬酶，包括三種同工酶CuZn-SOD在真核細(xì)胞胞液中，以Cu2+-Zn2+為輔基Mn-SOD在原核和真核細(xì)胞的線粒體中，以Mn2+為輔基Fe-SOD在原核細(xì)胞中，以Fe3+為輔基SOD2O2+2H+H2O2+O2（歧化反應(yīng)）·24第24頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期五2.過氧化氫酶(catalase,CAT)CAT2H2O2H2O+O2可清除O2的歧化產(chǎn)物H2O2

·25第25頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期五3.硒谷胱甘肽過氧化物酶(seleniumdependent

glutathioneperoxidase,SeGSHPx)還發(fā)現(xiàn)一新的硒酶：PHGSHPx，稱磷脂氫過氧化物谷胱甘肽過氧化物酶，能清除生物膜上的磷脂氫過氧化物，防止生物膜的脂質(zhì)過氧化PHGSHPx是單體酶SeGSHPx是由4個(gè)相同亞基構(gòu)成的寡聚酶LOOH(H2O2)＋2GSH

LOH(H2O)+H2O＋GSSGSeGSHPx可清除LOOH或H2O2，抑制自由基的生成26第26頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期五如醛酮還原酶，可催化脂肪醛和脂肪醛-谷胱甘肽加成物的還原，以清除脂質(zhì)過氧化作用的毒性產(chǎn)物。4．谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(glutathioneS-transferase,GST)屬不含硒的谷胱甘肽過氧化物酶，只清除LOOH，而不能清除H2O2。LOOH＋2GSHLOH＋H2O＋GSSGGST5．與抗氧化作用相關(guān)的其他酶27第27頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期五脂溶性抗氧化劑水溶性小分子抗氧化劑蛋白性抗氧化劑二、抗氧化劑28第28頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期五1.維生素E

清除O2、·OH、脂過氧基

LOO·及1O2，防止脂質(zhì)過氧化?！?.β-胡蘿卜素清除1O2、LOO·、O2、及·OH，防止脂質(zhì)過氧化?！?.輔酶Q既參與自由基的生成也具有抗氧化作用，CoQH2較氧化型的抗氧化作用強(qiáng)。4.固醇類激素雌激素可能與結(jié)構(gòu)中的酚基相關(guān)，但大劑量可生成O2，誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生。·(一)脂溶性抗氧化劑29第29頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期五VC還可與維生素E自由基(VE·)反應(yīng)，使其恢復(fù)為還原型維生素E，而本身變成VC·，后者可由依賴于NADH的氧化還原酶系統(tǒng)還原成VC。VC與VE兩者有協(xié)同作用。因此VC的總效果與其濃度有關(guān)。VC的不利作用：將Fe3+還原成Fe2+，H2O2存在時(shí)，可通過Fenton反應(yīng)形成·OH；但它又可清除·OH。維生素C(又稱抗壞血酸)

能直接與·OH、O2和1O2作用，是機(jī)體重要的活性氧清除劑?！?二)水溶性小分子抗氧化劑30第30頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期五

H2O2＋2GSH──→GSSG＋2H2O

LOOH＋GSH──→GSSG＋LOH＋H2O

·OH＋GSH──→H2O＋GS·2GS·──→GSSG4.色氨酸代謝產(chǎn)物

3-羥犬尿酸，黃尿酸和3-羥鄰氨基苯甲酸等均含有酚羥基，抑制脂質(zhì)過氧化作用。2.谷胱甘肽(GSH)

為H2O2、LOOH、·OH和1O2重要清除劑。3.尿酸

清除1O2和·OH，抑制脂質(zhì)過氧化。31第31頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期五1.銅藍(lán)蛋白具有亞鐵氧化酶活性，能催化Fe2+氧化成Fe3+，抑制由Fe2+催化H2O2生成·OH的反應(yīng)，從而防止·OH引發(fā)的脂質(zhì)過氧化作用。銅藍(lán)蛋白還是吞噬細(xì)胞呼吸爆炸生成的氧代謝產(chǎn)物O2和OCl－的主要清除劑。·(三)蛋白性抗氧化劑32第32頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期五2.清蛋白結(jié)合的膽紅素有效地清除1O2、O2和LOO·。保護(hù)與清蛋白結(jié)合的不飽和脂肪酸和清蛋白本身免受活性氧損傷。腸道的抗氧化劑，保護(hù)維生素A和不飽和脂肪酸免受氧化破壞。膽紅素在mol/L濃度時(shí)即能保護(hù)血漿蛋白免受過氧亞硝酸致的氧化修飾，或通過清除自由基減輕血漿蛋白損傷。33第33頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期五3.其他血漿蛋白清蛋白可結(jié)合銅離子抑制·OH形成和有效清除OCl－

。結(jié)合珠蛋白和血液結(jié)合素(hemopexin)能與Hb結(jié)合，促使Hb由受損組織和炎癥局部排出，以減輕Hb對(duì)組織的損傷作用。轉(zhuǎn)鐵蛋白和乳鐵蛋白，對(duì)鐵催化的脂質(zhì)過氧化作用是強(qiáng)氧化劑。轉(zhuǎn)鐵蛋白還能清除OCl－

。上述抗氧化酶與抗氧化劑均屬于機(jī)體的抗氧化防御系統(tǒng)34第34頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期五2.二甲亞砜及甘露醇兩者均有清除·OH的作用。二甲亞砜近來已用于抗腦水腫。1.

別嘌呤醇黃嘌呤氧化酶的抑制劑，能降低O2的生成，是心肌缺血再灌注氧自由基抑制劑，但只有在灌注前用藥，才能收到明顯效果。(四)近年來發(fā)現(xiàn)的抗氧化劑35第35頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期五4.白細(xì)胞功能抑制劑前列環(huán)素(PGI2)是血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的花生四烯酸主要代謝物，能抑制血小板聚集，保護(hù)冠狀動(dòng)脈。它還能抑制中性粒細(xì)胞激活，減少自由基生成。(四)近年來發(fā)現(xiàn)的抗氧化劑3.鈣拮抗劑尼可地平、硝苯啶、維拉帕米和硫氮卓銅等有保護(hù)細(xì)胞和升高GSH的作用。36第36頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期五5.N-乙酰半胱氨酸它本身是抗氧化劑，而且還是胞內(nèi)合成GSH的原料。6.普羅布可(Probucol)是一種很強(qiáng)的脂溶性抗氧化劑或自由基清除劑,該藥有延緩泡沫細(xì)胞發(fā)生的的能力，可用于AS的輔助治療。(四)近年來發(fā)現(xiàn)的抗氧化劑返回章目錄37第37頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期五一、氧化應(yīng)激與心血管疾病第四節(jié)氧化應(yīng)激與臨床疾病的關(guān)系動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)AS的發(fā)病機(jī)制尚未明了。脂肪浸潤(rùn)、血小板聚集、血栓形成和克隆等多種學(xué)說從不同角度闡明了其發(fā)病機(jī)制。近年來自由基與LOOH在AS發(fā)病機(jī)制中的作用受到普遍關(guān)注。高血壓、高血脂、糖尿病、吸煙等易患因素均可增加細(xì)胞的脂質(zhì)過氧化損傷，促進(jìn)AS形成。(一)氧化應(yīng)激與動(dòng)脈粥樣硬化38第38頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期五自由基和LOOH可引起血管內(nèi)皮細(xì)胞(EC)腫脹和破損，導(dǎo)致動(dòng)脈硬化發(fā)生。LDL受到自由基作用，形成過氧化低密度脂蛋白(Ox-LDL)，大量沉積于EC，最終形成AS。Ox-LDL可導(dǎo)致血小板聚集，促使自由基大量產(chǎn)生，從而加速AS發(fā)展。氧化應(yīng)激與LOOH在AS發(fā)病機(jī)制中的作用：39第39頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期五近年研究進(jìn)展：

AS的發(fā)生與·OH和次氯酸致的蛋白氧化修飾存在相關(guān)性

AS病灶中EC、平滑肌細(xì)胞(SMC)及單核細(xì)胞的SiS基因表達(dá)↑↑氧化應(yīng)激刺激血管SMC的增殖，參與了原癌基因的激活及異常表達(dá)從基因水平揭示:氧化應(yīng)激與AS之間的密切關(guān)系40第40頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期五

(二)氧化應(yīng)激與心肌缺血再灌注損傷缺血再灌注損傷

在缺血的基礎(chǔ)上恢復(fù)血流后，組織器官的損傷反而加重的現(xiàn)象。目前心肌缺血再灌注損傷的確切機(jī)制仍不明了,與自由基作用有關(guān)的機(jī)制有:

脂質(zhì)過氧化↑細(xì)胞內(nèi)鈣超載細(xì)胞成分間的交聯(lián)PGI2/TXA2失調(diào),微循環(huán)障礙TXA2：血栓素A2（thromboxaneA2）41第41頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期五氧化應(yīng)激致癌與促癌機(jī)制：

1.氧化應(yīng)激對(duì)DNA的作用2.氧化應(yīng)激對(duì)蛋白質(zhì)的作用3.氧化應(yīng)激對(duì)脂質(zhì)的作用4.基因損傷與致癌、促癌的關(guān)系

42第42頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期五1.氧化應(yīng)激對(duì)DNA的作用電離輻射可直接作用于DNA，產(chǎn)生自由基；電離輻射也可間接產(chǎn)生羥基DNA自由基；在有氧條件下DNA自由基與氧作用成為過氧由基；這些自由基是造成DNA鏈斷裂的原因。43第43頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期五主要是修飾氨基酸殘基，引起結(jié)構(gòu)和構(gòu)象的改變，造成肽鍵斷裂，聚合和交聯(lián)，造成細(xì)胞選擇性生長(zhǎng)和改變基因表達(dá)。2.氧化應(yīng)激對(duì)蛋白質(zhì)的作用44第44頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期五

3.氧化應(yīng)激對(duì)脂質(zhì)的作用氧化應(yīng)激不但可通過生物膜中的PUFA的過氧化引起細(xì)胞損傷，而且還可通過LOOH的分解產(chǎn)物引起細(xì)胞的損傷。45第45頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期五4.基因損傷與致癌、促癌的關(guān)系致癌物和促癌物均可造成基因損傷?；驌p傷主要為DNA單鏈或雙鏈的斷裂，重排或堿基修飾?；瘜W(xué)致癌物的最終致癌形成包括某些自由基可選擇性作用于DNA的核苷酸而激活原癌基因。46第46頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期五它是生物體隨著增齡而發(fā)生的退行性變化的總和，表現(xiàn)為機(jī)體功能活動(dòng)的進(jìn)行性下降，機(jī)體維持內(nèi)環(huán)境恒定和對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力逐漸降低。人的生命周期中有一個(gè)隨時(shí)間進(jìn)展而表現(xiàn)出不斷惡化，直到死亡的過程，老年醫(yī)學(xué)將該過程稱為衰老(aging或senscence)。三氧化應(yīng)激與衰老47第47頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期五1956年Harman的衰老的自由基學(xué)說：機(jī)制：隨著年齡增長(zhǎng)，體內(nèi)有大量過剩的自由基積累。過多的自由基引發(fā)胞膜脂質(zhì)氧化，其產(chǎn)物MDA造成細(xì)胞內(nèi)核酸變性及功能障礙。脂褐素(lipofuscin)是衰老的基本特征脂褐素的形成涉及脂質(zhì)過氧化體內(nèi)過量的自由基及其所誘導(dǎo)的氧化反應(yīng)長(zhǎng)期使細(xì)胞受到損害，導(dǎo)致人體衰老和死亡。48第48頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期五1978年Zs-Nagy提出的衰老膜學(xué)說

(themembranehypothesisofaging,MHA)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)脂質(zhì)和蛋白質(zhì)交聯(lián)以及質(zhì)膜上所產(chǎn)生的殘熱可引起胞膜物理-化學(xué)特性的改變，且這種改變是通過隨著年齡的增長(zhǎng)而變化，從而使整個(gè)細(xì)胞產(chǎn)生退行性變化。49第49頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期五1972年Harman又提出線粒體衰老概念20世紀(jì)80年代Miquel和Fleming提出了“衰老的氧自由基－線粒體損傷”的二階段學(xué)說1990年Bandy等闡明線粒體DNA突變可增加線粒體內(nèi)氧應(yīng)激水平由此引發(fā)衰老的出現(xiàn)1992年Wallace等提出氧化磷酸水平下降與衰老和退行性病變，如阿爾茨海默氏病(AD,亦稱早老性癡呆)與帕金森病等有關(guān)。返回章目錄50第50頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期五第五節(jié)氧化應(yīng)激指標(biāo)的檢測(cè)方法及評(píng)價(jià)一、主要活性氧的檢測(cè)二、一氧化氮與一氧化氮合酶的測(cè)定三、抗氧化酶活性的檢測(cè)四、常用抗氧化劑的測(cè)定五、氧化應(yīng)激損傷的標(biāo)志物檢測(cè)51第51頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期五(二)·OH檢測(cè)(三)H2O2的檢測(cè)(一)O2的檢測(cè)·一、主要活性氧的檢測(cè)52第52頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期五NBT還原法高鐵細(xì)胞色素C還原法羥胺氧化法較為常用1.物理檢測(cè)方法(一)O2的檢測(cè)·電子自旋共振(ESR)波譜分析法——直接法電子順磁共振(EPR)波譜分析法——間接法優(yōu)點(diǎn)：操作均較簡(jiǎn)單缺點(diǎn)：需昂貴的儀器，應(yīng)用均受到限制2.化學(xué)檢測(cè)方法——間接法53第53頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期五一種較靈敏檢測(cè)O2的方法，其檢測(cè)限量可達(dá)1μg/L。·具有設(shè)備簡(jiǎn)單，試劑便宜易購(gòu)，操作簡(jiǎn)便，專一性好，結(jié)果較為準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，適合于一般實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)。羥胺氧化法

O2能與羥胺溶液反應(yīng)生成NO2－，NO2－與對(duì)氨基苯磺酸和α-萘胺顯色，在波長(zhǎng)530nm處有專一吸收峰，其顏色深淺與產(chǎn)生的O2呈量效關(guān)系?！ぁぁ痉椒▽W(xué)評(píng)價(jià)】【注意事項(xiàng)】嚴(yán)格控制反應(yīng)系統(tǒng)pH＜8.0，盡可能降低反應(yīng)中的溶解氧及鐵含量，這樣測(cè)出的O2產(chǎn)生速率才更接近實(shí)際水平?！?4第54頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期五(二)·OH檢測(cè)

原理是無(wú)熒光的對(duì)苯二甲酸與·OH反應(yīng)形成強(qiáng)熒光的羥-對(duì)苯二甲酸加成物，315nm激發(fā)，可發(fā)射425nm熒光，可檢測(cè)受物理因素及化學(xué)因素處理后水溶液中產(chǎn)生的·OH。自旋捕捉法氣相色譜法(GC)高效液相色譜(HPLC)優(yōu)點(diǎn)：準(zhǔn)確度較高

缺點(diǎn)：操作繁瑣，儀器昂貴，不便推廣優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)便，測(cè)定快速，靈敏度較高，穩(wěn)定性較好。缺點(diǎn)：特異性不太高，需化學(xué)發(fā)光儀分光光度法熒光分析法——方法簡(jiǎn)便，易為一般實(shí)驗(yàn)室采用

化學(xué)發(fā)光法55第55頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期五

【原理】利用H2O2/Fe2+體系通過Fenton反應(yīng)產(chǎn)生的·OH，使鄰二氮菲-Fe2+在536nm處的最大吸收峰消失，根據(jù)反應(yīng)前后A536下降值進(jìn)行計(jì)算。分光光度法溴鄰苯三酚紅光度法【原理】利用H2O2/Fe2+體系通過Fenton反應(yīng)產(chǎn)生的·OH與溴鄰苯三酚紅形成有560nm處吸收峰的有色化合物，根據(jù)反應(yīng)前后A560的升高值進(jìn)行計(jì)算。鄰二氮菲-Fe2+氧化法細(xì)胞色素C氧化法水楊酸比色法這兩種方法穩(wěn)定性好、操作簡(jiǎn)便、測(cè)定快速。56第56頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期五(三)H2O2的檢測(cè)碘滴定法分光光度法化學(xué)發(fā)光法熒光法通過測(cè)定CAT和過氧化物酶的活性也可估測(cè)H2O2的水平H2O2是最穩(wěn)定的活性氧檢測(cè)方法:57第57頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期五1.分光光度法過氧化物酶-氧化酶法Fe2+-鄰二氮菲分光光法碘化鉀比色法58第58頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期五碘化鉀比色法快速、簡(jiǎn)便、重復(fù)性好，適合于溶液中μmol/L水平的日常測(cè)定?！驹怼縃2O2+KII2鉬酸銨藍(lán)色化合物淀粉【方法學(xué)評(píng)價(jià)】59第59頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期五過氧化物酶-氧化酶法經(jīng)典的比色法，整個(gè)反應(yīng)過程約20min，是一種操作簡(jiǎn)便、靈敏度較高(可達(dá)10-9μmol/L水平)的方法?！驹怼吭谌跛嵝原h(huán)境下，過氧化物酶-氧化酶反應(yīng)中的NADH往往被完全消耗。而在較高pH值環(huán)境下，NADH至少在反應(yīng)的開始階段并不完全被消耗，測(cè)定A340下降值,計(jì)算NADH被消耗量?！痉椒▽W(xué)評(píng)價(jià)】60第60頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期五2.NADPH氧化法

兩方法靈敏度均較高。

前者無(wú)需制作H2O2的校正曲線，操作簡(jiǎn)便，適用于大批量樣品的同時(shí)測(cè)定。

后者適用于生物反應(yīng)體系中微量H2O2測(cè)定?！驹怼繙y(cè)定體系中NADPH的氧化與H2O2的含量成正比GSH-NADPH氧化法Scopoletin-NADPH氧化法【方法學(xué)評(píng)價(jià)】61第61頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期五二、一氧化氮與一氧化氮合酶的測(cè)定(一)一氧化氮(NO)測(cè)定NO含量少，且極不穩(wěn)定,較難直接測(cè)定其含量。常用測(cè)定NO含量的方法多利用NO的化學(xué)性質(zhì)，測(cè)定其終末產(chǎn)物NO3－和(或)NO2－的含量來反映組織細(xì)胞NO的含量。物理方法有微電極法和EPR法，優(yōu)點(diǎn)是靈敏度較高，可實(shí)時(shí)檢測(cè)，但需昂貴儀器限制了應(yīng)用?；瘜W(xué)方法有Griess試劑法、硝酸鹽還原酶法、熒光分光光度法、催化光度法、化學(xué)發(fā)光法，其中以Griess試劑法最為常用。62第62頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期五1.Griess試劑法：A550與NO2－或NO的產(chǎn)量成正比，據(jù)此測(cè)定NO2－+對(duì)氨基苯磺酸重氮化合物pH7.5～8.1重氮化合物+N-(1-萘基)-乙二胺紫紅色產(chǎn)物偶聯(lián)550nm本法稍加修改即可用于測(cè)定樣品中的總硝酸鹽含量(NO3－與NO2－濃度之和)。(一)一氧化氮(NO)測(cè)定63第63頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期五加合物+N-(1-萘基)-乙二胺Griess反應(yīng)NO3－NO2－銅離子活化鎘NO2－+對(duì)氨基苯磺酸加合產(chǎn)物H+測(cè)A550nm，即可求出[NO2－]測(cè)NO3－時(shí)可將其先還原成NO2－，再測(cè)。因血清中[NO3－]>>[NO2－]，[NO2－]很低，因而測(cè)定結(jié)果主要反映血清中NO3－的含量。64第64頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期五無(wú)需特殊的設(shè)備和昂貴試劑，操作簡(jiǎn)便迅速，在一般實(shí)驗(yàn)室、均可開展，是目前使用最普遍的方法，適用于大批量樣品測(cè)定。本法測(cè)的是NO2－含量,屬于間接測(cè)定NO量，其特異性較差。NO的還原可采用銅離子活化鎘還原法或硝酸鹽還原酶法?！痉椒▽W(xué)評(píng)價(jià)】

65第65頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期五測(cè)定光子量，可代表組織細(xì)胞NO的含量?？捎肗O氣體制作校正曲線，直接測(cè)定樣品中的NO。2.化學(xué)發(fā)光法通過酸化或/和加入還原劑，使樣品中的亞硝酸鹽釋放NONO+O3激發(fā)態(tài)NO2*發(fā)光返回基態(tài)

樣品用量較少，靈敏度較高，測(cè)定范圍50～250pmolNaNO2易受樣品中其他因素的干擾，測(cè)定的NO含量并不完全代表組織細(xì)胞實(shí)際的NO量?！痉椒▽W(xué)評(píng)價(jià)】

66第66頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期五一般的Griess法僅測(cè)定NO2－或NO3－的含量，且Pr的NO衍生物均被脫蛋白的步驟除去。本法基于所有NO相關(guān)復(fù)合物均可被熱裂解為硝酸鹽。血漿Pr可通過熱變性而除去，避免其干擾。3.全血NO代謝產(chǎn)物的測(cè)定血液中NO代謝產(chǎn)物除NO3－/NO2－外，還包括S-亞硝基血紅蛋白，亞硝酰血紅蛋白等S-亞硝基/亞硝?；衔?，其總稱為NO代謝產(chǎn)物。67第67頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期五激發(fā)波長(zhǎng)365nm，發(fā)射波長(zhǎng)426nm條件下測(cè)熒光強(qiáng)度NO2－+

2，3-二氨基萘1-(H)-萘三唑H+測(cè)定血中NO代謝產(chǎn)物總量，待測(cè)樣品可為溶血或全血標(biāo)本，測(cè)定結(jié)果可較全面反映NO代謝情況。其他方法因易受Hb或其他Pr影響，不宜用全血標(biāo)本測(cè)定?！痉椒▽W(xué)評(píng)價(jià)】68第68頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期五(二)NOS測(cè)定1.化學(xué)發(fā)光法2.血紅蛋白法3.NADP+檢測(cè)法69第69頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期五1.化學(xué)發(fā)光法加入去鐵乙胺可消除Hb對(duì)測(cè)定的干擾NO+L-瓜氨酸NOSO2·L-精氨酸+NO+

H2O2ONOO－化學(xué)發(fā)光

OH－魯米諾加入SOD可消除O2對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響·70第70頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期五2.血紅蛋白法HbO2和MHb光譜特性有pH依賴性，pH7.7時(shí)：HbO2于401nm有最大光吸收MHb與HbO2混合液在411nm有等位光吸收峰測(cè)定A401和A411的變化可監(jiān)測(cè)NO產(chǎn)量的變化，反映NOS活性NO+HbO2MHbNO+L-瓜氨酸NOSL-精氨酸+O2·71第71頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期五3.NADP+檢測(cè)法測(cè)定NADP+在370nm激發(fā)波長(zhǎng)下產(chǎn)生465nm發(fā)射波長(zhǎng)的熒光強(qiáng)度，可反映樣品中NOS活性。NADP+的量可依靠酶催化循環(huán)擴(kuò)增，可明顯提高對(duì)NADP+檢測(cè)靈敏度。SQ·+O2+NADPH+H+Q+O2+NADP+·優(yōu)勢(shì)是可用于檢測(cè)含有內(nèi)源性Arg的粗制品缺點(diǎn)是NADP+的生成缺乏特異性【方法學(xué)評(píng)價(jià)】NO+L-瓜氨酸NOSL-精氨酸+O2·72第72頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期五三、抗氧化酶活性的檢測(cè)(一)超氧化物歧化酶(SOD)測(cè)定(二)谷胱甘肽過氧化物酶測(cè)定(三)過氧化氫酶(CAT)測(cè)定73第73頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期五直接法一般化學(xué)法化學(xué)發(fā)光法

(一)SOD測(cè)定測(cè)酶活性免疫學(xué)方法測(cè)酶質(zhì)量電泳法74第74頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期五特異性強(qiáng)，所需樣本量少(僅50μl)，操作快速簡(jiǎn)單，重復(fù)性好，靈敏度高，試劑簡(jiǎn)單。1.一般化學(xué)法:鄰苯三酚自氧化法(改良Marklund法)在堿性條件下，鄰苯三酚自氧化成紅桔酚，用紫外-可見光譜跟蹤波長(zhǎng)為325nm、420nm或650nm(經(jīng)典為420nm)同時(shí)產(chǎn)生O2，SOD催化O2發(fā)生歧化反應(yīng)從而抑制鄰苯三酚的自氧化，樣品對(duì)鄰苯三酚自氧化速率的抑制率，可反映樣品中的SOD含量?！ぁぁ痉椒▽W(xué)評(píng)價(jià)】75第75頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期五屬間接法中的經(jīng)典方法，但本法靈敏度較低。1.一般化學(xué)法:細(xì)胞色素C還原法(McCord法)

【方法學(xué)評(píng)價(jià)】黃嘌呤-黃嘌呤氧化酶體系中產(chǎn)生的O2使細(xì)胞色素C氧化型還原為還原型，后者在550nm有最大光吸收?！⒁种品磻?yīng)的百分?jǐn)?shù)與SOD濃度作圖可得到抑制曲線，由此計(jì)算樣品中SOD活性。在SOD存在時(shí)，一部分O2被SOD催化而歧化，O2還原細(xì)胞色素C的反應(yīng)速度則相應(yīng)減少?！ぁ?6第76頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期五2.化學(xué)發(fā)光法可應(yīng)用于SOD的微量測(cè)定靈敏度高，簡(jiǎn)便易行特異性準(zhǔn)確性與細(xì)胞色素C還原法類似黃嘌呤或次黃嘌呤尿酸+O2黃嘌呤氧化酶[O]·O2+魯米諾化學(xué)發(fā)光·SOD能清除O2從而抑制魯米諾的化學(xué)發(fā)光·【方法學(xué)評(píng)價(jià)】77第77頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期五4.免疫學(xué)方法測(cè)定SOD質(zhì)量，特異性較好，是較理想的方法。只能測(cè)定Ab相應(yīng)的Ag，對(duì)于檢測(cè)不同種類的SOD，則須制備相應(yīng)的特異性Ab，手續(xù)繁瑣。放射免疫法化學(xué)發(fā)光免疫分析法ELISA法【方法學(xué)評(píng)價(jià)】78第78頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期五(二)谷胱甘肽過氧化物酶測(cè)定兩者的區(qū)別在于其活性結(jié)構(gòu)中是否含硒non-SeGSHPx只能催化除H2O2外的過氧化物還原SeGSHPx則可催化H2O2及其他過氧化物還原谷胱甘肽過氧化物酶(GSHPx)有兩種硒谷胱甘肽過氧化物酶(SeGSHPx)非硒谷胱甘肽過氧化物酶(non-SeGSHPx)79第79頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期五1.DTNB直接顯色法2.酶偶聯(lián)連續(xù)監(jiān)測(cè)法3.熒光測(cè)定法SeGSHPx的測(cè)定80第80頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期五1.DTNB直接顯色法

測(cè)定該離子的濃度即可計(jì)算出GSH減少量，以此求得SeGSHPx活性。LOOH(H2O2)＋2GSHLOH(H2O)+H2O＋GSSGSeGSHPx

GSH＋5，5'-二硫代雙，2-硝基苯甲酸黃色(DTNB)[5-硫代，2-硝基苯甲酸]－殘留的81第81頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期五2.酶偶聯(lián)連續(xù)監(jiān)測(cè)法LOOH(H2O2)＋2GSHLOH(H2O)＋H2O＋GSSGSeGSHPxGSSG+NADPH+H+2GSH+NADP+GSH還原酶特異性強(qiáng)、靈敏度高，適用酶含量不高的樣品GSH還原酶的成本高是本法缺點(diǎn)

【方法學(xué)評(píng)價(jià)】340nm

82第82頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期五源自GSH的熒光分析法2GSH+H2O2GSSG+2H2OGSH+OPA熒光復(fù)合物3.熒光測(cè)定法隨著反應(yīng)的進(jìn)行，GSH不斷被消耗，經(jīng)一定時(shí)間的酶反應(yīng)后，中止反應(yīng)。剩余的GSH與鄰苯二甲醛(OPA)在一定pH條件下生成較特異性的熒光復(fù)合物。通過測(cè)定其熒光強(qiáng)度即可測(cè)定SeGSHPx活性。83第83頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期五(三)過氧化氫酶(CAT)測(cè)定1.鉬酸銨比色法2.快速簡(jiǎn)便法3.改良比色法4.化學(xué)發(fā)光法84第84頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期五1.鉬酸銨比色法反應(yīng)迅速達(dá)到平衡，至少穩(wěn)定60min，生成的黃色化合物的A405取決于H2O2和鉬酸銨的濃度。CAT2H2O2H2O+O2+鉬酸銨黃色化合物405nm殘留的H2O2測(cè)定波長(zhǎng)為360nm，測(cè)定溫度為25℃。2.快速簡(jiǎn)便法85第85頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期五3.改良比色法在波長(zhǎng)570～610nm進(jìn)行比色測(cè)定鉻酸醋酸鉀的生成量，可反映H2O2的含量。CAT簡(jiǎn)便、快速、顯色穩(wěn)定、重復(fù)性好，不需特殊試劑及儀器設(shè)備，適用于一般實(shí)驗(yàn)室使用。2H2O2H2O+O2(加醋酸重鉻酸鉀迅速中止)570～610nm剩余的H2O2+醋酸重鉻酸鉀鉻酸醋酸鉀△【方法學(xué)評(píng)價(jià)】86第86頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期五4.化學(xué)發(fā)光法

CAT可引起化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度減弱，由此計(jì)算總CAT活性。

CAT2H2O2H2O+O2H2O2+魯米諾+Co2+發(fā)出強(qiáng)烈藍(lán)光87第87頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期五四、常用抗氧化劑的測(cè)定(三)維生素C測(cè)定(一)還原型谷胱甘肽(GSH)測(cè)定1．改良比色法2．熒光測(cè)定法3．HPLC法(二)維生素E測(cè)定1．熒光法2．HPLC-分光光度法3．HPLC-熒光分析法1．DNPH比色法2．熒光分析法3．氧化酶法4．HPLC法88第88頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期五測(cè)A412，即可測(cè)定巰基1.改良比色法本法適用于血紅細(xì)胞GSH含量的測(cè)定，采血量及試劑用量較少，更適用于兒童。DTNB+2GSH[2-硝基-5-巰基苯甲酸]－+GSSG黃色【方法學(xué)評(píng)價(jià)】DTNB：5，5'-二硫代雙，2-硝基苯甲酸(一)還原型谷胱甘肽(GSH)測(cè)定89第89頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期五2.熒光測(cè)定法靈敏度大大高于分光光度法本法適用于測(cè)定血小板中GSH鄰苯二醛(OPT)+GSHGSH-OPT【方法學(xué)評(píng)價(jià)】在激發(fā)波長(zhǎng)345nm及發(fā)射波長(zhǎng)425nm條件下測(cè)熒光，對(duì)GSH定量90第90頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期五3.HPLC法本法樣品用量少，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確，靈敏度高GSH最低檢出限為3ng。

缺點(diǎn)：需HPLC儀，在一般實(shí)驗(yàn)室較難完成。鄰苯二醛(OPT)+GSHGSH-OPT【方法學(xué)評(píng)價(jià)】HPLC可有效地用于分離樣品液中的GSH根據(jù)OPT熒光法檢測(cè)GSH的原理，通過分離的GSH峰測(cè)定樣品GSH。熒光檢測(cè)激發(fā)波長(zhǎng)338nm，發(fā)射波長(zhǎng)425nm。91第91頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期五(二)維生素E測(cè)定維生素E是一族維生素的總稱，目前已知有7種常見的有α、β、γ和δ4種本法靈敏度較高，是測(cè)定維生素E的經(jīng)典方法?！痉椒▽W(xué)評(píng)價(jià)】維生素E同系物的分子結(jié)構(gòu)中存在相同的共軛雙鍵體系，檢測(cè)在激發(fā)波長(zhǎng)296nm，發(fā)射波長(zhǎng)340nm條件下的熒光，可對(duì)維生素E定量。1.熒光法92第92頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期五α-生育酚于292nm有特異性光吸收胡蘿卜素于450nm有較大光吸收2.HPLC-分光光度法生物樣品中α-生育酚及胡蘿卜素可經(jīng)過HPLC法較好地分離開來，通過檢測(cè)不同波長(zhǎng)下的光吸收值可測(cè)定樣品中的它們的含量。93第93頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期五HPLC分離樣品中維生素E維生素E在激發(fā)波長(zhǎng)296nm下可發(fā)射340nm的熒光根據(jù)測(cè)試對(duì)樣品純度要求選擇不同的樣品處理方法3.HPLC-熒光分析法HPLC法大大提高了分析的準(zhǔn)確度，且能同時(shí)分離和測(cè)定各種維生素E同系物。

缺點(diǎn)是儀器設(shè)備較昂貴，分析成本高,不適應(yīng)于常規(guī)檢測(cè)的要求。

【方法學(xué)評(píng)價(jià)】94第94頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期五1.2，4-二硝基苯肼(DNPH)比色法抗壞血酸脫氫抗壞血酸脫氫抗壞血酸+DNPH2，4-二硝基苯腙硫脲及硫酸銅H+520nm本法測(cè)的是樣品中抗壞血酸和脫氫抗壞血酸總量如省去氧化步驟，樣品穩(wěn)定，則可測(cè)脫氫抗壞血酸含量是分光光度法較為理想的方法之一特異性不高，其他碳?xì)浠衔锟筛蓴_，加入硫脲可增加DNPH反應(yīng)的特異性?！痉椒▽W(xué)評(píng)價(jià)】(三)維生素C的測(cè)定95第95頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期五2.熒光分析法抗壞血酸脫氫抗壞血酸脫氫抗壞血酸+鄰苯二胺脫氫抗壞血酸對(duì)-氮雜萘測(cè)定在激發(fā)波長(zhǎng)350nm，發(fā)射波長(zhǎng)430nm的熒光本法測(cè)定的是抗壞血酸與脫氫抗壞血酸的總量96第96頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期五3.氧化酶法抗壞血酸脫氫抗壞血酸抗壞血酸氧化酶脫氫抗壞血酸+Fe3++2，4，6-三(2-吡啶基)-S-三嗪生色物593nm優(yōu)點(diǎn)是不必對(duì)生物樣品進(jìn)行過多的純化處理，甚至不用脫蛋白樣品中的脫氫抗壞血酸須用其他方法測(cè)定【方法學(xué)評(píng)價(jià)】97第97頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期五4.HPLC法最好的方法，先層析法將樣品中的成分分離，再用柱后檢測(cè)器檢測(cè)。HPLC-紫外分光光度法(2)HPLC-電化學(xué)檢測(cè)法是此類方法中最為簡(jiǎn)單的一種

最為理想的測(cè)定生物樣品中抗壞血酸含量的方法返回章目錄98第98頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期五（一）脂質(zhì)過氧化標(biāo)志物檢測(cè)（丙二醛、脂氫過氧化物）（二）蛋白質(zhì)氧化損傷指標(biāo)檢測(cè)（三）DNA/RNA損傷檢測(cè)五、氧化應(yīng)激損傷的標(biāo)志物檢測(cè)