實驗二-堿性磷酸酶提取與其比活性測定

材料選擇細胞的破碎分離純化鑒定第一頁，共34頁。

堿性磷酸酶(ALP,AKP)

Alkalinephosphatase第二頁，共34頁。一、實驗?zāi)康?、掌握以有機溶劑分離技術(shù)提取蛋白質(zhì)及酶的原理和方法；2、掌握酶蛋白純化過程中的活性、比活性、得率及純化倍數(shù)的概念及計算；3、了解AKP的臨床意義及純化蛋白質(zhì)的一般方法。第三頁，共34頁。二、實驗原理1、AKP概述

①催化有機單磷酸酯水解，并有轉(zhuǎn)移磷酸基的作用②最適pH：8.6～10.3③

特點：特異性低第四頁，共34頁。④體內(nèi)位置：細胞膜表面-腎小管的篩狀緣-腸粘膜的微絨毛-膽小管的細胞膜緣-肝竇狀腺表面-胎盤合體細胞滋養(yǎng)層細胞外表面第五頁，共34頁。⑤正常血清：ALP主要來自肝（或膽管）和骨骼，約各占總活性的一半。⑥臨床意義：血清ALP活力增高常見于

-肝膽疾病（膽道阻塞等）

-骨骼疾?。ㄘE病等）

-甲狀腺功能亢進

-妊娠和生長期兒童第六頁，共34頁。2、AKP的分離、提取、及純化整個制備過程可分為5個階段：①材料的選擇和預(yù)處理，②細胞的破碎，③提取，④純化（包括鹽析、有機溶劑提取、層析、電泳等），⑤濃縮、干燥及保存。第七頁，共34頁。①取材取酶含量豐富、容易提取、新鮮的組織本次實驗：肝臟第八頁，共34頁。②生物組織與細胞的破碎機械破碎法：高速組織搗碎機、勻漿器、研缽滲透破碎法：低滲條件使細胞溶脹而破碎反復(fù)凍融法：超聲波法：超聲波震蕩器使細胞膜上所受張力不均而使細胞破碎酶法：如用溶菌酶破壞微生物細胞

第九頁，共34頁。③選擇合適分離提取方法把混在酶制劑中的大量雜蛋白及其它大分子物質(zhì)（核酸、脂類、多糖）去除掉把酶從溶液中提取出來第十頁，共34頁。有機溶劑方法——

有機溶劑分段沉淀法原理：利用不同的蛋白質(zhì)在不同濃度的有機溶劑中有不同的溶解度而進行分離。第十一頁，共34頁。有機溶劑：①正丁醇能去除與pro結(jié)合的脂類物質(zhì)，使pro溶解在溶液中②乙醇30%AKP溶解狀態(tài)60%AKP沉淀狀態(tài)③丙酮33%AKP溶解狀態(tài)50%AKP沉淀狀態(tài)通過離心，去除部分雜蛋白通過離心，進一步去除雜蛋白第十二頁，共34頁。④保護酶活性措施低溫條件下操作所有試管均需洗干凈選擇合適的pH及合適的緩沖體系，以穩(wěn)定酶活性Mg(Ac)2~NaAc混合液提取AKPpH8.8Tris緩沖液測AKP活性保護和穩(wěn)定AKP第十三頁，共34頁。

2g新鮮兔肝剪碎→勻漿管

加0.01MMg(Ac)2-0.01MNaAc混合液2ml，勻漿

勻漿液入離心管

用4ml上述混合液沖洗勻漿器，并倒入離心管，混勻，記體積VA

A液A1管A2管剩余A液0.1mlA液+0.1mlA液+4.9ml0.01MpH8.8Tris4.9ml生理鹽水

三、操作步驟（待測酶活性）（待測蛋白質(zhì)含量）加2ml正丁醇，攪拌3-5'，室溫放置30'，過濾，入離心管第十四頁，共34頁。

上述濾液

加等體積冷丙酮，混勻，

離心2000rpm、5分鐘上清入回收瓶沉淀

加4.0ml0.5MMg(Ac)2,攪拌，記體積VB

B液0.10mlB液

+4.9ml0.01MpH8.8Tris

B1管B2管

剩余B液VB'0.1mlB液+4.9ml生理鹽水

加

0.45VB'

冷乙醇96%→30%，混勻，

離心2500rpm,5分鐘

（待測酶活性）（待測蛋白質(zhì)含量）第十五頁，共34頁。上清

棄沉淀入離心管

，記體積VB‘’，加

0.83

VB‘’冷乙醇

96%（30%→

60%）混勻，

離心

2500rpm,5分鐘

上清入回收瓶

沉淀加0.01MMg(Ac)2-0.01MNaAc混合液4ml，攪拌，記體積Vc

C液C1管C2管

剩余C液Vc'

0.10mlC

液

+

1.9ml0.01MpH8.8Tris

0.1mlC液+0.4ml生理鹽水

加0.5Vc'冷丙酮→33%，混勻,離心2000rpm,5分鐘

（待測酶活性）（待測蛋白質(zhì)含量）上述離心結(jié)果第十六頁，共34頁。上清

棄沉淀上清入回收瓶沉淀加5ml0.01MpH8.8Tris，攪拌，記體積VD

D液D1管

D2管

0.10mlD

液

+

0.9ml0.01MpH8.8Tris

入離心管

，記體積Vc'',加1/3Vc''冷丙酮→

50%，混勻，

離心2000rpm,5分鐘

剩余D液（待測酶活性）（直接待測蛋白質(zhì)含量）上述離心結(jié)果第十七頁，共34頁。比活性：指單位質(zhì)量的蛋白質(zhì)制劑中所含的酶活性單位

比活性=酶活性單位數(shù)/mg蛋白二、實驗原理

3、建立測定酶比活性的方法

①②第十八頁，共34頁。磷酸苯二鈉法原理：磷酸苯二鈉AKP苯酚K3Fe(CN)64-氨基-安替比林醌類化合物λ=510nm①測定酶活性

第十九頁，共34頁。AKP活性單位定義:37℃,反應(yīng)15分鐘,產(chǎn)生1ug苯酚

一個AKP活性單位（u）第二十頁，共34頁。試劑(ml)B1234A1稀釋液0.10B1稀釋液0.10C1稀釋液0.10D1稀釋液0.10pH8.8Tris緩沖液0.10復(fù)合基質(zhì)液33333

立即混勻。將各管置于37℃水浴精確保溫15分鐘0.5%K3Fe(CN)622222

立即混勻。終止酶促反應(yīng)，室溫靜置10分鐘。H2O調(diào)零，

λ=510nm比色，記錄各管OD。第二十一頁，共34頁。計算酶活性：各制劑總AKP單位數(shù)（U）=查表所得值×稀釋倍數(shù)×總體積注：A1、B1、C1、D液分別稀釋50、50、20、10倍（標(biāo)準(zhǔn)曲線）第二十二頁，共34頁。

考馬斯亮藍法

（CoomassieBrilliantBlueG-250，Bradford法）

考馬斯亮藍G-250——紅色和藍色

酸性游離狀態(tài)棕紅色465nm+蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)-染料復(fù)合物595nm②測定蛋白質(zhì)含量第二十三頁，共34頁。試劑(ml)B1234生理鹽水0.10A2稀釋液0.10B2稀釋液0.10C2稀釋液0.10溶液D0.10考馬斯亮蘭試劑55555

混勻。2分鐘后，H2O調(diào)零，λ=595nm比色，記錄各管OD。第二十四頁，共34頁。計算蛋白質(zhì)含量：各制劑總蛋白含量（mg）=查表所得值×稀釋倍數(shù)×總體積注：A2、B2、C2液分別稀釋50、50、5

倍第二十五頁，共34頁。③各制劑的比活性，得率及純化倍數(shù)的計算1、AKP比活性：AKP比活性（U/mg）=每ml制劑中AKP活性單位數(shù)（U）每ml制劑中蛋白質(zhì)含量（mg）第二十六頁，共34頁。2、得率得率=每一制劑中總的酶活性單位溶液A中總的酶活性單位×100%第二十七頁，共34頁。3、純化倍數(shù)純化倍數(shù)=每一制劑AKP比活性（U/mg）溶液A制劑AKP比活性（U/mg）第二十八頁，共34頁。勻漿A液第一次丙酮提?。˙液）第二次乙醇提?。–液）第三次丙酮提?。―液）總體積（ml）蛋白含量（mg/ml）總蛋白量（mg）AKP活性單位（u/ml）總AKP活性單位（u）比活性（u/mg）純化倍數(shù)得率AKP分離純化小結(jié)表：第二十九頁，共34頁。有機溶劑體積的計算——96%乙醇VB/中加乙醇96%30%（VB/+VX）×30%=96%×VXVX

=

0.45VB/VB//中加乙醇（96%）從30%60%（VB//+VX）×60%-

VB//×30%

=96%×VXVX

=5/6（0.83）VB//第三十頁，共34頁。注意事項低溫條件進行有機溶劑邊加邊攪拌加完有機溶劑后，立即離心，分析沉淀加有機溶劑的量計算精確乙醇上層液入回收瓶第三十一頁，共34頁。比色分析的原理有色溶液設(shè)：T

(透光度)A=lg=-lg=-lgT

IO

I

I

IO(吸光度)

IIO代表：有色物質(zhì)對光的吸收能力第三十二頁，共34頁。入射光

IO透過光

ICL

Beer定律：

A∝C合并Lambert-Beer定律：

A∝C?L即：A＝K?C?L

Lambert定律：A∝L摩爾吸光系數(shù)第三十三