生物工藝發(fā)酵液的預(yù)處理和固液分離方法

生物工藝發(fā)酵液的預(yù)處理和固液分離方法第1頁，共75頁，2023年，2月20日，星期一214發(fā)酵液預(yù)處理和固液分離技術(shù)手段沉降離心凝聚絮凝過濾固液分離其它手段第2頁，共75頁，2023年，2月20日，星期一Bioseparationsusuallybeginwiththeseparationofbiomassfrombroth.Theseparationcommonlyusesfiltrationorcentrifugationasdescribed.Inmanycases,thedesiredproductisinthebroth.Antibiotics,arecommonlyinthebroth;soareextracellularenzymes,manypolysaccharides,andmostaminoacids.Inallthesecases,theseparatedbrothcanbetreatedtoisolateandpurifytheproduct,asabyproduct.第3頁，共75頁，2023年，2月20日，星期一生物反應(yīng)過程第4頁，共75頁，2023年，2月20日，星期一預(yù)處理的目的①分離細(xì)胞、菌體和其他懸浮顆粒（細(xì)胞碎片、核酸和蛋白質(zhì)沉淀物）。②除去部分可溶性雜質(zhì)。③改變?yōu)V液的性質(zhì)（以提高過濾速度）。第5頁，共75頁，2023年，2月20日，星期一2.1 發(fā)酵液的預(yù)處理發(fā)酵液預(yù)處理原因？

⑴發(fā)酵液中菌體細(xì)小、粘度大。粘性雜質(zhì)多，難直接過濾。對(duì)細(xì)菌和某些放線菌菌體細(xì)小，發(fā)酵液粘度大，不能直接過濾。由于菌體自溶，核酸、蛋白質(zhì)及其他有機(jī)粘性物質(zhì)的存在會(huì)造成濾液渾濁，濾速極慢。第6頁，共75頁，2023年，2月20日，星期一⑵發(fā)酵液中高價(jià)無機(jī)離子及雜蛋白的存在。影響離交法的交換容量。影響離交法及大網(wǎng)格樹脂的吸附能力。產(chǎn)生乳化。影響膜過濾。文獻(xiàn)：青霉素發(fā)酵液中可溶性蛋白質(zhì)的沉降及其在溶劑萃取中的乳化作用第7頁，共75頁，2023年，2月20日，星期一2.1.1 高價(jià)無機(jī)離子的去除方法：(1)去Ca2+，加草酸。作用：⑴生成草酸鈣沉淀，同時(shí)也生成MgC2O4↓⑵草酸鈣沉淀，能促使蛋白質(zhì)凝固。(2)去Mg2+，加三聚磷酸鈉Na5P3O10，同時(shí)也可去除Ca2+Na5P3O10+Mg2+→MgNa3PO10+2Na+

（絡(luò)合物）(3)去Fe3+，加黃血鹽，形成普魯士蘭沉淀。Fe3++[Fe2+(CN)6]4-+K+=K[Fe2+(CN)6Fe3+]第8頁，共75頁，2023年，2月20日，星期一2.1.2雜蛋白的去除方法：(1)酸化，調(diào)pH值至等電點(diǎn)。（HCO2、H2SO4、HCl、H3PO4）(2)加鹽，形成沉淀。酸性溶液：Protein+陰離子→↓堿性溶液：Protein+陽離子→↓

第9頁，共75頁，2023年，2月20日，星期一(3)加熱，使蛋白質(zhì)變性沉淀，同時(shí)μ↓，加快過濾速度。缺點(diǎn)：原液的色素增多，影響原液質(zhì)量，只適用于對(duì)熱不敏感的生化物質(zhì)。

第10頁，共75頁，2023年，2月20日，星期一如：鏈霉素生產(chǎn)中，采用調(diào)pH至酸性（pH3.0），加熱至70℃，維持半個(gè)小時(shí)的方法來去除蛋白質(zhì)，能使過濾速度增大10-100倍，濾液粘度可降低1/6。檸檬酸發(fā)酵液，采用加熱至80℃以上，使蛋白質(zhì)變性凝固和降低發(fā)酵液粘度，從而大大提高了過濾速度。第11頁，共75頁，2023年，2月20日，星期一(4)加有機(jī)溶劑，表面活性劑。所處理的量較小。(5)大幅度改變pH值。第12頁，共75頁，2023年，2月20日，星期一(6)吸附作用幾種反應(yīng)劑相互作用，或和某些溶解鹽類發(fā)生反應(yīng)生成不溶解的沉淀[CaSO4、AlPO4]。生成的沉淀的作用：能防止菌絲體粘連，使菌絲具有塊狀結(jié)構(gòu)。沉淀本身可作為助濾劑。使膠狀物和懸浮物凝集。第13頁，共75頁，2023年，2月20日，星期一如：四環(huán)類抗生素生產(chǎn)中，采用黃血鹽和硫酸鋅的協(xié)同作用生成亞鐵氰化鋅鉀K2Zn3[Fe(CN)5]2的膠狀沉淀來吸附蛋白質(zhì)。環(huán)絲氨酸發(fā)酵液用氧化鈣和磷酸處理，生成的磷酸鈣沉淀，能使懸浮物凝固。多余的磷酸根離子，還能除去鈣、鎂離子。第14頁，共75頁，2023年，2月20日，星期一15(7)凝聚和絮凝凝聚：在中性鹽作用下，由于雙電層排斥電位的降低，而使膠體體系不穩(wěn)定的現(xiàn)象。絮凝：在高分子絮凝劑存在下，基于架橋作用，使膠粒形成粗大絮凝團(tuán)的過程，是以物理集合為主的過程。第15頁，共75頁，2023年，2月20日，星期一凝聚：膠體粒子中性鹽促進(jìn)下脫穩(wěn)相互聚集成大粒子（1mm）。

機(jī)理：

a中和粒子表面電荷

b消除雙電層結(jié)構(gòu)

絮凝：大分子聚電解質(zhì)將膠體粒子交聯(lián)成網(wǎng)狀，形成10mm大小絮凝團(tuán)的過程

。機(jī)理：架橋作用

第16頁，共75頁，2023年，2月20日，星期一2.1.3.4 凝聚作用：⑴發(fā)酵液的帶電特性：①發(fā)酵液中的膠體粒子表面，一般都帶有負(fù)電荷。②發(fā)酵液中的膠粒子在界面上形成雙電層。⑵擴(kuò)散雙電層結(jié)構(gòu)模型：第17頁，共75頁，2023年，2月20日，星期一18第18頁，共75頁，2023年，2月20日，星期一由于①吸附作用正離子被吸附②熱運(yùn)動(dòng)正離子有離開表面的趨勢(shì)①②兩相反作用的影響：形成吸附層或緊密層：距離膠核表面約一個(gè)離子半徑的stern平面以內(nèi)，正離子被緊密束縛在膠核表面。第19頁，共75頁，2023年，2月20日，星期一20幾個(gè)名詞：stern層：相距膠核表面約一個(gè)離子半徑的平面?；疲▌?dòng)）面：當(dāng)膠粒在溶液中作相對(duì)運(yùn)動(dòng)時(shí)，總有一薄層液體，隨著它一起滑移，這一薄層，厚度比吸附層稍大。φs：膠核表面的電位

φd：stern平面上的電位ξ：滑移面上的電位，可測(cè)定，控制膠粒間電排斥作用的電位，表征雙電層的特征第20頁，共75頁，2023年，2月20日，星期一⑷膠粒能保持分散狀態(tài)的原因：帶有相同電荷和擴(kuò)散雙電層的結(jié)構(gòu)。水化層的形成:依賴于膠體帶電。第21頁，共75頁，2023年，2月20日，星期一22擴(kuò)散層的有效厚度，即stern面上的電位φ降低到其值為1/e處的距離，不能直接測(cè)定。水的介電常數(shù)膠體的電動(dòng)電荷密度即滑移面電荷密度(5)膠粒發(fā)生凝聚的機(jī)理第22頁，共75頁，2023年，2月20日，星期一第23頁，共75頁，2023年，2月20日，星期一24凝聚價(jià)（凝聚值）①定義：膠粒發(fā)生凝聚作用的最小電解質(zhì)濃度（毫摩爾/升）。②規(guī)律性：陽離子對(duì)帶負(fù)電荷的膠粒凝聚能力的次序?yàn)椋篈l3+

＞Fe３+＞H+＞Ca2+＞Mg2+＞K+＞Na+＞Li+凝聚的缺點(diǎn)：凝聚體顆粒較細(xì)小，有時(shí)不能有效分離。第24頁，共75頁，2023年，2月20日，星期一25絮凝預(yù)處理方法中的除雜效率最高的方法。絮凝劑：有機(jī)高分子水溶性聚合物，具有長(zhǎng)鏈線狀的結(jié)構(gòu)，分子量可達(dá)數(shù)萬至一千萬以上，在長(zhǎng)的鏈節(jié)上含有相當(dāng)多的活性功能團(tuán)，可以帶有多價(jià)電荷（如陰離子或陽離子），也可以不帶電性（如非離子型）⑵絮凝作用機(jī)理。第25頁，共75頁，2023年，2月20日，星期一26第26頁，共75頁，2023年，2月20日，星期一第27頁，共75頁，2023年，2月20日，星期一28⑶作為絮凝劑的條件：分子中必須必須有長(zhǎng)鏈線狀的分子結(jié)構(gòu)，含有較多的活性基團(tuán)，可以帶多價(jià)電荷，能和懸浮顆粒表面相結(jié)合。水溶性的聚合物，分子量可以很高。不影響產(chǎn)物的性能。無毒。第28頁，共75頁，2023年，2月20日，星期一29⑷絮凝劑的類型：細(xì)胞絮凝的種類：自身絮凝（酵母）、絮凝劑絮凝絮凝劑類型：化學(xué)結(jié)構(gòu)：高聚物、無機(jī)鹽（硫酸鋁、氯化鈉、磷酸鈉、氯化鈣和明膠等）、有機(jī)溶劑（乙醇、丙酮、甲醛）、表面活性劑官能團(tuán)：陰、陽離子、非離子來源：天然和人工合成第29頁，共75頁，2023年，2月20日，星期一30聚丙烯酰胺優(yōu)點(diǎn)：

用量少10－6g/L絮凝體粗大，分離效果好。絮凝速度快種類多。主要用于雜質(zhì)為蛋白質(zhì)或菌絲體的發(fā)酵液缺點(diǎn)：存在毒性（尤其陽離子）。第30頁，共75頁，2023年，2月20日，星期一31聚丙烯酸類陰離子絮凝劑。無毒。聚苯乙烯類衍生物無機(jī)高分子聚合物天然有機(jī)高分子絮凝劑殼聚糖、葡聚糖、明膠、骨膠、海藻酸鈉等。微生物絮凝劑

微生物產(chǎn)生的具有絮凝細(xì)胞功能的物質(zhì)。主要成分是糖蛋白、粘多糖、纖維素及核酸等高分子物質(zhì)。第31頁，共75頁，2023年，2月20日，星期一32⑸混凝包括凝聚和絮凝機(jī)理的過程，稱為混凝。對(duì)帶負(fù)電性菌體或蛋白質(zhì)：①加入無機(jī)電解質(zhì)，凝聚起作用成微粒：②再加入非離子型和陰離子型高分子絮凝劑，架橋作用（絮凝）：，第32頁，共75頁，2023年，2月20日，星期一33絮凝劑濃度影響絮凝因素第33頁，共75頁，2023年，2月20日，星期一34pH值第34頁，共75頁，2023年，2月20日，星期一絮凝劑分子量與攪拌速度，時(shí)間有關(guān)。第35頁，共75頁，2023年，2月20日，星期一文獻(xiàn)：新型絮凝劑F－717對(duì)抗生素M－90發(fā)酵液預(yù)處理研究微生物細(xì)胞的絮凝與微生物絮凝劑肌苷發(fā)酵液絮凝除菌體的研究第36頁，共75頁，2023年，2月20日，星期一37最新的發(fā)展趨勢(shì)親和絮凝第37頁，共75頁，2023年，2月20日，星期一發(fā)酵液的固液分離38第38頁，共75頁，2023年，2月20日，星期一39發(fā)酵液的過濾：

過濾：液固分離的過程。要求：濾速快，濾液澄清，產(chǎn)品高收率。第39頁，共75頁，2023年，2月20日，星期一40發(fā)酵液的過濾特性和濾餅的重量比阻：發(fā)酵液大多數(shù)屬于非牛頓型液體，濾渣為可壓縮性。rB：濾餅的重量比阻。衡量不同發(fā)酵液過濾的難易程度。1.不可壓縮性濾餅，rB常數(shù)，m=02.可壓縮性濾餅：(發(fā)酵液屬于此類)rB=r(△p)m

結(jié)論：△P↑→γB↑

問：若在開始過濾時(shí)就迅速提高壓差嗎？第40頁，共75頁，2023年，2月20日，星期一41

對(duì)于可壓縮濾餅，如果過濾介質(zhì)的阻力相對(duì)較小，可以忽略不計(jì)，則恒壓下的過濾方程式為（1-2）式中q：到瞬間τ時(shí)，通過單位過濾面積的濾液量，m3/m2；△P：過濾壓力差，Pa；

rB：濾餅的質(zhì)量比阻，m/kg；

XB：通過單位體積濾液所形成的濾渣質(zhì)量，kg/m3；

τ：過濾時(shí)間，s；

μ：濾液粘度，Pa·s。第41頁，共75頁，2023年，2月20日，星期一42

利用圖解法求得，以τ/q為縱坐標(biāo)，以q為橫坐標(biāo)所得的直線斜率為M，則rB可按下式進(jìn)行計(jì)算：

（1-3）根據(jù)濾餅的質(zhì)量比阻，可以衡量各種不同發(fā)酵液過濾的難易程度。

第42頁，共75頁，2023年，2月20日，星期一43影響過濾速度的因素。

菌種真菌：過濾容易，濾渣呈緊密餅狀，易刮下。放線菌：菌絲細(xì)而分枝，交織成網(wǎng)狀，過濾較難，須經(jīng)預(yù)處理。細(xì)菌：菌體很細(xì)小，過濾十分困難，須絮凝處理，并用特殊的過濾設(shè)備。第43頁，共75頁，2023年，2月20日，星期一44

培養(yǎng)基組成

影響很大。用黃豆餅粉，花生粉作氮源，淀粉作碳源會(huì)使過濾困難。后期加用消沫油或大量未用完的培養(yǎng)基，使過濾困難。續(xù)第44頁，共75頁，2023年，2月20日，星期一45

發(fā)酵工藝

發(fā)酵時(shí)間：在菌絲自溶前必須放罐，否則過濾困難。

攪拌速度、通氣量，接種比例影響微生物的生長(zhǎng)特性。低接種量，高攪拌速度有利于生成塊狀和丸團(tuán)沉淀。第45頁，共75頁，2023年，2月20日，星期一46第46頁，共75頁，2023年，2月20日，星期一47改善過濾性能的方法若難過濾的發(fā)酵液，設(shè)法改善過濾性能，降低γB，提高過濾速度。方法：等電點(diǎn)法；蛋白質(zhì)變性法；吸附法；凝聚及絮凝法；加入助濾劑；酶解作用。第47頁，共75頁，2023年，2月20日，星期一48加入助濾劑：助濾劑：不可壓縮的多孔微粒，不吸附或很少吸附生化物質(zhì)，使濾餅疏松，有利于過濾。種類：硅酸鹽粉末，紙漿，珠光巖，珍珠巖（SiO2）助濾劑的加入有兩種方法：在濾布上預(yù)先鋪一層助濾劑(1~2mm)，該方法，會(huì)使濾速降低，但濾液透明度。直接加入發(fā)酵液中。第48頁，共75頁，2023年，2月20日，星期一49加入酶

發(fā)酵液中有不溶性的多糖存在，則最好用酶將它轉(zhuǎn)化為單糖，以提高過濾速度。如：萬古霉素發(fā)酵液，加0.0025%的細(xì)菌淀粉酶，攪拌0.5hr，2.5%硅藻土助濾劑，υ↑5倍。

發(fā)酵液染菌的處理：升高溫度，增加催化劑用量，加助濾劑。第49頁，共75頁，2023年，2月20日，星期一50固—液分離設(shè)備的選擇常用于發(fā)酵液的分離設(shè)備有：板框壓濾機(jī)鼓式真空過濾機(jī)離心沉降分離機(jī)第50頁，共75頁，2023年，2月20日，星期一51板框壓濾機(jī)優(yōu)點(diǎn)：板框壓濾機(jī)的過濾面積大；過濾推動(dòng)力(壓力差)能較大幅度地進(jìn)行調(diào)整，并能耐受較高的壓力差；結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，價(jià)格低，動(dòng)力消耗少等優(yōu)點(diǎn)。缺點(diǎn)不能連續(xù)操作，設(shè)備笨重，勞動(dòng)強(qiáng)度大，衛(wèi)生條件差，非生產(chǎn)的輔助時(shí)間長(zhǎng)，阻礙了過濾效率的提高。第51頁，共75頁，2023年，2月20日，星期一52鼓式真空過濾機(jī)優(yōu)點(diǎn)能連續(xù)操作，能實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化控制缺點(diǎn)壓差較小，主要適用于霉菌發(fā)酵液的過濾。第52頁，共75頁，2023年，2月20日，星期一53離心分離

優(yōu)點(diǎn)分離速度快，效率高，操作時(shí)衛(wèi)生條件好等優(yōu)點(diǎn)，適合于大規(guī)模的分離過程。缺點(diǎn)投資費(fèi)用高，能耗較大。第53頁，共75頁，2023年，2月20日，星期一54離心，與過濾比較優(yōu)點(diǎn)：分離速度快、效率高、液相澄清度好，操作時(shí)衛(wèi)生條件好優(yōu)點(diǎn)，適于大規(guī)模分離過程缺點(diǎn)：投資設(shè)備高，能耗大，固相干燥程度不如壓濾操作。第54頁，共75頁，2023年，2月20日，星期一第55頁，共75頁，2023年，2月20日，星期一第56頁，共75頁，2023年，2月20日，星期一第57頁，共75頁，2023年，2月20日，星期一有哪些形式離心呢？重力沉降（自己離心自己）離心過濾離心沉降離心分離58第58頁，共75頁，2023年，2月20日，星期一59 重力沉降以液固沉降為例，重力沉降過程中固體顆粒受到重力，浮力和摩擦力的作用對(duì)球形的固體顆粒，當(dāng)10-4<Re<1時(shí)(滯流區(qū)),當(dāng)重力，浮力和摩擦力達(dá)到平衡時(shí)，球形固體顆粒沉降，沉降速度為第59頁，共75頁，2023年，2月20日，星期一60離心沉降1、離心力

F=ma∵

其中：r：旋轉(zhuǎn)體離旋轉(zhuǎn)軸距離

ω：旋轉(zhuǎn)角速度

v：旋轉(zhuǎn)線速度

n：每秒鐘轉(zhuǎn)數(shù)第60頁，共75頁，2023年，2月20日，星期一61相對(duì)離心力（離心分離因數(shù)，離心力強(qiáng)度）懸浮粒子受到離心力的作用，將向離心管底部移動(dòng)，沉降，這個(gè)粒子所受到的離心力與它受到的地球重力相比較，稱為相對(duì)離心力（RCF），也稱為分離因子。

從以上公式可看出RCF是與沉降的粒子質(zhì)量無關(guān)的值。第61頁，共75頁，2023年，2月20日，星期一62沉降速度及沉降系數(shù)

s為單位離心場(chǎng)力作用下的粒子的沉降速度。從以上得知：s是溶劑物性的函數(shù)，與溫度及溶劑有關(guān)。S=10-13秒第62頁，共75頁，2023年，2月20日，星期一63一些蛋白質(zhì)的沉降系數(shù)第63頁，共75頁，2023年，2月20日，星期一64 沉降時(shí)間下列積分：圓形顆粒完全沉降需要的時(shí)間第64頁，共75頁，2023年，2月20日，星期一65K是轉(zhuǎn)子的效率因子（通常K值為10—1,000或更大）。與轉(zhuǎn)子大小和速度有關(guān)。根據(jù)廠家提供的最大K值就可估計(jì)在一定的轉(zhuǎn)速時(shí)具有一定沉降系數(shù)的某種顆粒的沉降時(shí)間。BACK第65頁，共75頁，2023年，2月20日，星期一66按離心形式分①離心過濾：在有孔轉(zhuǎn)鼓的離心機(jī)中通過過濾介質(zhì)分離懸浮液的過程為離心過濾②離心沉降：利用固液兩相比重的差異在離心機(jī)無孔轉(zhuǎn)鼓或管子中進(jìn)行懸浮液沉降分離者為離心沉降。③離心分離：分離不同比重液體的過程為離心分離。第66頁，共75頁，2023年，2月20日，星期一67按離心的轉(zhuǎn)速分第67頁，共75頁，2023年，2月20日，星期一離心方法差速離心區(qū)帶離心68第68頁，共75頁，2023年，2月20日，星期一69差速離心法：

采用逐漸增加離心速度或低速和高速交替進(jìn)行離心，使沉降速度不同的顆粒，在不同離心速度及不同離心時(shí)間下分批離心的方法。它是利用各種粒子密度的不同，因而在離心力場(chǎng)中其沉降速度亦不同，從而達(dá)到分離的目的。第69頁，共75頁，2023年，2月20日，星期一70缺點(diǎn)：每次沉