生物化學(xué)與分子生物學(xué)試驗(yàn)步驟總結(jié)

本文格式為Word版，下載可任意編輯——生物化學(xué)與分子生物學(xué)試驗(yàn)步驟總結(jié)試驗(yàn)步驟：

一：RT-PCR檢測(cè)

1、用冷的PBS沖細(xì)胞2次，參與1mLTrizol(12孔板每孔參與0.5ml)，靜置3-4min。將裂

解液轉(zhuǎn)入已標(biāo)記好相應(yīng)批次的滅酶EP管中，參與氯仿0.2ml（1/5Trizol體積），用手猛烈震搖15s，置室溫5min可見(jiàn)分層。將離心機(jī)預(yù)冷至4°C，12000rpm，30min，可見(jiàn)分層。

2、防備吸上層水相約0.5ml，置于另一1.5ml滅酶EP管，此操作確保不要吸入中間層和有

機(jī)相，降低蛋白質(zhì)等污染。各管分別參與0.5ml（等體積）異丙醇，搖勻，置于-80°C，過(guò)夜放置。4°C，12000rpm，30min，可見(jiàn)白色片狀RNA沉淀。

3、倒棄上清液，參與1ml預(yù)冷的75TPC乙醇，用手指輕彈管壁使RNA飄起，充分清

洗RNA沉淀，4°C12000rpm，15min。洗滌2遍。

4、棄上清后，將管底余液盡量吸凈。室溫枯燥沉淀約20min，參與20μlDEPC水，充分溶

解離心。取1μl測(cè)OD值確定RNA濃度ng/μl，其余-80°C保存?zhèn)溆谩?、依照羅氏逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，體系為20μl。

反應(yīng)體系

試劑RTReactionBuffer(5×)dNTPPrimer(Random)逆轉(zhuǎn)錄酶RNase抑制劑RNAH2O

6、用7900儀器進(jìn)行RT-PCR，采用SYBRGreen法。

RT-PCR體系如下：試劑SYBRGreenmixddH2O上游引物下游引物cDNA體積（μl）53.60.20.21體積（μl）4220.50.51000/RNA濃度（ng/μl）11-RNANote:逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程中，需建立無(wú)RNAse環(huán)境，避免RNA的降解。在冰排上進(jìn)行相關(guān)操作。二：HUVEC細(xì)胞培養(yǎng)

（一）人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的分開(kāi)

提前準(zhǔn)備好溶于PBS溶液的I型膠原酶液并過(guò)濾除菌。

1、選取健康孕婦無(wú)病毒感染、無(wú)扭曲、打折的新生兒新鮮臍帶（15-20cm），用0.9%的生

理鹽水檢查臍帶的完整、并沖洗內(nèi)壁血細(xì)胞等；

2、雙向確認(rèn)臍帶無(wú)破損后，將臍帶兩頭都用止血鉗和注射器針頭插入靜脈夾緊，將I型膠

原酶液注入臍帶內(nèi)，把臍帶靜置于存有生理鹽水的培養(yǎng)皿內(nèi)15min，可輕柔按摩血管以增加細(xì)胞脫落，同時(shí)控制消化時(shí)間在20min以內(nèi)。

3、消化完成后，將臍帶內(nèi)的消化液打出到一個(gè)清白的50ml離心管內(nèi)，用鹽水沖洗臍帶內(nèi)

剩余消化液至離心管20ml處，將離心管800g，8min，再取一根臍帶進(jìn)行一致步驟；

4、離心后，棄上清，用5ml培養(yǎng)基吹吸兩管沉淀混勻后，將全部液體轉(zhuǎn)移至T25細(xì)胞培養(yǎng)

皿內(nèi)，標(biāo)記細(xì)胞種類、日期、姓名，松口放入37°C，5%的CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)細(xì)胞，其次天細(xì)胞貼壁后，觀測(cè)。Note:

0.9%生理鹽水在取臍帶細(xì)胞前兩天配好高壓滅菌；止血鉗、剪刀等也用75%乙醇浸泡過(guò)夜，用蒸餾水洗滌3遍，晾干，高壓滅菌備用；提前備好一定數(shù)量的注射器即可。（二）復(fù)蘇

1、將凍存管從液氮中取出，馬上投入37°C水浴鍋中，微弱搖動(dòng)，均勻受熱。2、將上述細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至15ml離心管中，800g離心8min。

3、棄掉上清，參與1ml培養(yǎng)基把細(xì)胞懸浮起來(lái)，吸入裝有4mlECM培養(yǎng)的T25培養(yǎng)皿中微弱晃動(dòng)使皿中細(xì)胞分布均勻。標(biāo)記好細(xì)胞種類和日期姓名等，松口瓶蓋放入5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)細(xì)胞。

4、三天左右換一次培養(yǎng)基。（三）傳代

1、培養(yǎng)皿中細(xì)胞覆蓋率達(dá)到80%-90%后進(jìn)行傳代。

2、吸去原有培養(yǎng)基。參與適當(dāng)?shù)囊鹊鞍酌敢海═25-200μL，T75-600μL），37°C培養(yǎng)箱消化1-2min。

3、細(xì)胞變圓后參與培養(yǎng)基終止消化（T25-5ml，T75-10ml），用移液槍吹打細(xì)胞至細(xì)胞都懸浮起來(lái)。

4、鋪板：把細(xì)胞吸到培養(yǎng)皿中，吹打混勻。12孔板按每孔0.7ECM+0.3ml細(xì)胞重懸液，繼續(xù)培養(yǎng)。標(biāo)好細(xì)胞代數(shù)，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。（四）凍存

將細(xì)胞消化后用培養(yǎng)基懸浮起來(lái)細(xì)胞，分裝到滅菌的凍存管中，DMSO要緩慢參與，90%細(xì)胞懸液+10%DMSO，靜置幾分鐘，在管上注明細(xì)胞種類，代數(shù)，凍存日期。4°C30min，-20°C30min，-80°C過(guò)夜，之后放到液氮罐中保存即可。一、細(xì)胞siRNA轉(zhuǎn)染1、轉(zhuǎn)染前一天，將HUVEC細(xì)胞接種到12孔板上，0.7ml含F(xiàn)BS和抗生素的ECM和0.3ml

細(xì)胞重懸液。

2、選擇在24小時(shí)內(nèi)使細(xì)胞會(huì)集達(dá)到70%-90%，將細(xì)胞培養(yǎng)基換液0.9ml。48μLOpti-MEM，

參與2μLRNAimax，48μLOpti-MEM參與2μLsiRNA，將上述混合液合并為100μL，室溫放置5分鐘，參與1個(gè)12孔板中。3、將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞板放在37°C5%CO2培養(yǎng)箱中溫育48小時(shí)候，進(jìn)行其他檢測(cè)步驟。將轉(zhuǎn)

染后的同批次檢測(cè)eNOSmRNA水平和蛋白水平。三：DAF-FM1、裝載探針

①用20μLDMSO溶解DAF-FMDA原固體，DAF-FMDA儲(chǔ)存液（-20℃）濃度為5mM，

再用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋，DAF-FMDA工作液濃度為5μM；②除細(xì)胞培養(yǎng)液后，參與適當(dāng)體積稀釋好的DAF-FMDA

12孔板內(nèi)單孔1ml的DAF-FMDA工作液。37°C孵育20min。③去除工作液后，用新鮮培養(yǎng)基37°C孵育20-30min。PBS洗滌三次細(xì)胞，充分去除

未進(jìn)入細(xì)胞的DAF-FMDA。

2、檢測(cè)：在熒光倒置顯微鏡下用不同倍數(shù)的鏡頭直接觀測(cè)細(xì)胞，留片即可。

四：Westenblot檢測(cè)

1、收集蛋白樣品：使用蛋白裂解液70μL/孔，靜置于冰上20min，煮沸15min，充分變性蛋

白。

2、電泳：冷卻到室溫，把蛋白樣品直接上樣到SDS膠加樣孔內(nèi)即可。尋常濃縮膠使

用低電壓恒壓80V，在溴酚藍(lán)進(jìn)入分開(kāi)膠時(shí)，使用高電壓恒壓電泳120V。時(shí)間為90-120min，尋常電泳時(shí)溴酚藍(lán)到達(dá)膠的底端處附近便可以中止電泳。3、轉(zhuǎn)膜：選用硝酸纖維素膜（NC膜），濕式轉(zhuǎn)膜方法，層疊像三明治模式一樣將膜與膠放

置在一起，將膜與膠中間的氣泡趕走（重要?。ぐ啄z黑，設(shè)定轉(zhuǎn)膜電流為200mA，轉(zhuǎn)膜時(shí)間為90min。4、封閉：轉(zhuǎn)膜完成后，注意膜的保濕，避免其枯燥，參與western封閉液，室溫封閉60min。5、一抗孵育：依照比例1:1000稀釋一抗。4°C緩慢搖動(dòng)，過(guò)夜孵育，之后回收一抗，-20°C

保存。用1×TBST反復(fù)洗滌3次膜，每次10min。6、二抗：按比例1:3000稀釋二抗，室溫在搖床緩慢搖動(dòng)孵育1.5小時(shí)。回收二抗，用1×TBS