祁自柏體外診斷試劑的分類和基本原理

祁自柏體外診斷試劑的分類和基本原理第1頁，共76頁，2023年，2月20日，星期一第十類）基因芯片（微陣列）類試劑基因芯片（微陣列）：α-地中海貧血基因芯片診斷試劑盒PCR-雜交：人乳頭瘤病毒基因分型檢測試劑盒（PCR-反向雜交法）（第十一類）

探針放大（原位雜交）類試劑bDNA類：HIV-1bDNA檢測試劑盒；mRNA檢測試劑盒(生物素原位雜交法)（第十二類）

普通生化類試劑（十萬級要求）（包括酶類化學(xué)試劑、凝血試劑類等試劑）酶類化學(xué)試劑:丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）測定試劑盒；堿性磷酸酶（ALP）測定試劑盒凝血試劑:凝血酶原時間（PT）測定試劑盒；組織纖溶酶原激活物（t-PT）測定試劑盒（第十三類）

普通生化類試劑（清潔環(huán)境）（包括一般化學(xué)試劑、血氣電解質(zhì)類、血液分析儀用試劑類等）一般化學(xué)試劑：無機離子（鋁、鎘等）測定試劑盒；白蛋白測定試劑盒（BCG法）；總膽固醇測定試劑盒（COD-CE-PAP法）血氣電解質(zhì):電解質(zhì)分析儀隨機試劑；生化分析儀用稀釋液、沖洗液血液分析儀用試劑:血液分析儀用稀釋液、溶血劑（第十四類）

干化學(xué)類試劑干化學(xué)試劑（條、卡或盒）：干化學(xué)尿液分析試紙條；尿微量白蛋白（UALB）測試卡（第十五類）

藥敏類試劑藥敏紙片（卡）：抗生素藥敏紙片；隨機專用藥敏試劑（盒）（卡）（第十六類）

培養(yǎng)基類馬丁干粉培養(yǎng)基；人胚胎干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基第2頁，共76頁，2023年，2月20日，星期一

我國體外試劑的幾個發(fā)展階段

1七十年代末，乳膠凝集，血球凝(PHA,RPHA）

2八十年代初期，放射免疫測定(RIA)，

抗HBs單克隆抗體

3八十年代中期，酶聯(lián)免疫試劑，基因工程表達(dá)乙肝

病毒核心抗原和e抗原

4九十年代，聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，丙肝，戊肝

病毒基因被克隆，各種基因工程抗

原被應(yīng)用

5近期，發(fā)光免疫,生物芯片技術(shù)(基因芯片，

蛋白芯片)

第3頁，共76頁，2023年，2月20日，星期一（第一類）

酶聯(lián)免疫（酶標(biāo)板、磁珠、微粒子）類試劑酶聯(lián)免疫法：乙型肝炎病毒e抗體診斷試劑盒（酶聯(lián)免疫法）；癌胚抗原定量測定試劑盒(免疫熒光法)化學(xué)發(fā)光法：人生長激素（GH）定量測定試劑盒增強化學(xué)發(fā)光免疫分析法：巨細(xì)胞病毒抗體檢測試劑盒時間分辨熒光法：游離甲狀腺素（FT4）定量測定試劑盒電化學(xué)發(fā)光法：甲型肝炎病毒抗體診斷試劑盒微粒子酶免法：丙型肝炎病毒抗體診斷試劑盒第4頁，共76頁，2023年，2月20日，星期一酶聯(lián)免疫試劑抗原抗體之間的特異反應(yīng)與酶的高效催化反應(yīng)有機的結(jié)合。固相樣品放大抗原抗體抗抗體-酶-底物-顯色抗體抗原抗體-酶-底物-顯色第5頁，共76頁，2023年，2月20日，星期一酶標(biāo)板樣品中HCV抗原HRP酶標(biāo)記抗HCV抗體抗HCV抗體HRP酶單克隆抗體

丙肝抗原ELISA試劑第6頁，共76頁，2023年，2月20日，星期一HIV-1p24抗原檢測試劑的原理第7頁，共76頁，2023年，2月20日，星期一

1雙抗體夾心法應(yīng)用HBsAg,HBeAg,HBcAg,pres1,pres2

2雙抗原夾心法應(yīng)用抗HBs，抗HIV

3競爭法 應(yīng)用抗HBc,抗pres24中和抑制法應(yīng)用抗Hbe5捕獲法應(yīng)用抗HBcIgM6間接法應(yīng)用抗HCV,抗HEV,幾種主要的酶聯(lián)免疫方法模式第8頁，共76頁，2023年，2月20日，星期一發(fā)光免疫試劑1.抗原抗體反應(yīng)的基本原理及方法模式與酶聯(lián)免疫試劑完全相同2.檢測光信號，其光信號可因酶催化而產(chǎn)生也可用其他方法使其產(chǎn)生第9頁，共76頁，2023年，2月20日，星期一酶促化學(xué)發(fā)光以酶為催化劑，通過氧化反應(yīng)，使底物發(fā)光。過氧化物酶（HRP)促發(fā)光，底物——魯米諾堿性磷酸酶(AP)促發(fā)光，底物——螺旋金剛烷環(huán)氧化物苯磷酸酯（AMPPD)第10頁，共76頁，2023年，2月20日，星期一

魯米諾及其衍生物的增敏化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)（HRP）商業(yè)化產(chǎn)品中常見的化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)（一）第11頁，共76頁，2023年，2月20日，星期一ROHRBOHOHROHSN魯米諾及其衍生物的增強劑（Enhancer）第12頁，共76頁，2023年，2月20日，星期一AMPPD及其衍生物的化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)（AP）

光子(477nm)APOOOCH3OPO32-O-OOOCH3+*OO-OOCH3商業(yè)化產(chǎn)品中常見的化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)（二）第13頁，共76頁，2023年，2月20日，星期一非酶促化學(xué)發(fā)光及電化學(xué)發(fā)光非酶促化學(xué)發(fā)光：以吖啶酯、過氧化氫為發(fā)光系統(tǒng)，不需要酶的催化。儀器成本高，技術(shù)復(fù)雜，尚未國產(chǎn)化（Abbott)電化學(xué)發(fā)光：氧化反應(yīng)是通過電極上的電化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生，標(biāo)記物為三氯聯(lián)吡啶釕。儀器成本高，技術(shù)復(fù)雜，尚未國產(chǎn)化。（Roche）第14頁，共76頁，2023年，2月20日，星期一CH3C=OORN+OH-H+H2O2+H2O+ROH光子+CO2+CH3C=OORNHOCH3C=OORNHOOCH3ONCH3ONC=OO商業(yè)化產(chǎn)品中常見的化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)（三）吖啶酯化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)/非酶促第15頁，共76頁，2023年，2月20日，星期一e-TPATPATPA+H+e-e-PlatinumelectrodeMagnet發(fā)光Ru2+基態(tài)Ru2+激發(fā)態(tài)Ru3+++電化學(xué)發(fā)光法原理第16頁，共76頁，2023年，2月20日，星期一

在電場的作用下，三丙胺（TPA）被氧化成陽離子自由基TPA+，后者很不穩(wěn)定，可自發(fā)失去一個質(zhì)子（H+），形成自由基TPA，這是一種很強的還原劑，可將一個電子給三價的三聯(lián)吡啶釕衍生物[Ru(bpy)3]3+，使其形成激發(fā)態(tài)的[Ru(bpy)3]2+，而TPA自身被氧化成二丙胺和丙醛。激發(fā)態(tài)的[Ru(bpy)3]2+通過熒光機制衰減，發(fā)射出一個波長620nm的光子，重新生成基態(tài)的[Ru(bpy)3]2+。該過程在電極表面周而復(fù)始地進(jìn)行，產(chǎn)生許多光子，光電倍增管檢測光強度，光強度與[Ru(bpy)3]2+的濃度呈線性關(guān)系，故可測出待測抗原的含量。第17頁，共76頁，2023年，2月20日，星期一時間分辨熒光

將三價稀土離子銪（Eu）等通過絡(luò)合物標(biāo)記到抗原或抗體分子上，通過檢測銪等的熒光實現(xiàn)免疫分析

應(yīng)注意環(huán)境及樣品中同類元素導(dǎo)致的本底干擾，特別是北方地區(qū)第18頁，共76頁，2023年，2月20日，星期一時間分辨熒光增強原理第19頁，共76頁，2023年，2月20日，星期一發(fā)光信號檢測光敏二極管、光敏電池、光電偶合器（CCD）結(jié)構(gòu)簡單、性能穩(wěn)定但靈敏度低、線性范圍較窄。主要特點原理：光信號光電轉(zhuǎn)換器件電壓或電流信號放大第20頁，共76頁，2023年，2月20日，星期一單光子計數(shù)器是目前高靈敏度發(fā)光分析儀的核心部件光電倍增管高壓高速放大器高速比較器高速分頻器發(fā)光樣品產(chǎn)生光子激發(fā)光陰極產(chǎn)生光電子在陽極上形成較強信號脈沖信號相對發(fā)光單位數(shù)字脈沖(RLU)在各打拿極之間得到能量和數(shù)目的倍增第21頁，共76頁，2023年，2月20日，星期一流動池檢測方式示意圖檢測器檢測池負(fù)壓泵廢液四通閥沖洗液樣品管計量泵干燥空氣原位進(jìn)樣泵氧化劑優(yōu)點：結(jié)構(gòu)簡單，運行成本低缺點：明顯的易產(chǎn)生交叉污染，工作效率受限。第22頁，共76頁，2023年，2月20日，星期一常見進(jìn)口發(fā)光免疫分析產(chǎn)品

生產(chǎn)廠商產(chǎn)品技術(shù)類型反應(yīng)體系產(chǎn)品特點儀器類型ROCHE電化學(xué)發(fā)光、磁微珠腫瘤標(biāo)志物E170ABBOTT化學(xué)發(fā)光、磁微珠堿性磷酸酶、吖啶酯乙肝項目I2000Bayer化學(xué)發(fā)光、磁微珠吖啶酯內(nèi)分泌項目ADVIACentaurBeckman化學(xué)發(fā)光、磁微珠堿性磷酸酶UniCelDxI800DPC化學(xué)發(fā)光、塑料球堿性磷酸酶藥物分析Immuline2000

強生化學(xué)發(fā)光辣根過氧化物酶丙肝

生物梅里?；瘜W(xué)發(fā)光堿性磷酸酶HIVPE(Wallac)時間分辨熒光第23頁，共76頁，2023年，2月20日，星期一（第二類）

膠體金（硒、乳膠）類試劑膠體金法：梅毒抗體-乙肝表面抗原診斷試劑盒膠體硒法：HIV(1+2+0)試劑盒第24頁，共76頁，2023年，2月20日，星期一膠體金試劑原理

硝酸纖維膜加樣

檢測區(qū)對照區(qū)(HBsAg)-----------------------------玻璃纖維膜

-------------------

抗HBs羊抗鼠鼠抗HBs第25頁，共76頁，2023年，2月20日，星期一膠體金免疫層析法反應(yīng)示意圖吸樣墊膠體金墊包被T線包被C線上樣墊NC膜支撐物第26頁，共76頁，2023年，2月20日，星期一HIV膠體金類快速診斷試劑檢測結(jié)果第27頁，共76頁，2023年，2月20日，星期一第三類）

免疫印跡試劑免疫印跡試劑盒:風(fēng)濕病自身抗體檢測試劑盒（免疫印跡法）第28頁，共76頁，2023年，2月20日，星期一免疫印跡法示意圖第29頁，共76頁，2023年，2月20日，星期一

用于RR樣品的HCV抗體確認(rèn)獨特的IgG（I/II）及hSOD內(nèi)部質(zhì)控設(shè)計用于檢測的固相化抗原

重組表達(dá)蛋白：c33c，NS5

合成肽抗原：c100p（5-1-1p），c22pIgGcontrolIIIgGcontrolIIDc100(p)5-1-1(p)c33cc22(p)hSODNS5RIBA?HCV3.0第30頁，共76頁，2023年，2月20日，星期一c100-3NS5c33cc22-3SOD3+Control1+ControlPosINDPosNegINDRIBA模式圖第31頁，共76頁，2023年，2月20日，星期一3+controlband(serumaddition)CapsidNS3-1NS3-2NS4NS51+controlband(reagentaddition)

GLDHCVBLOT3.0第32頁，共76頁，2023年，2月20日，星期一（第四類）

蛋白芯片（微陣列）類試劑蛋白芯片（微陣列）：丙型肝炎病毒抗體檢測試劑盒（蛋白芯片法）；多腫瘤標(biāo)志物檢測試劑盒（蛋白芯片法）第33頁，共76頁，2023年，2月20日，星期一

每張芯片檢測48個樣本，每個樣本同時檢測5個指標(biāo)，

丙型肝炎病毒分片斷抗體檢測蛋白芯片NS4NS4NS3NS3CC總總NS5NS5（C代表核心,NS3,NS4,NS5代表非結(jié)構(gòu)區(qū)抗原）陽性對照陰性對照空白對照第34頁，共76頁，2023年，2月20日，星期一（第五類）

單抗類試劑血型定型類試劑：血型定型試劑盒（單克隆抗體）免疫組化：ImmuChem免疫組化試劑盒（單抗）免疫比濁：血清載脂蛋白A1免疫比濁試劑盒乳膠凝集：D-dimer二聚體乳膠凝集試劑盒第35頁，共76頁，2023年，2月20日，星期一（第六類）

多抗類試劑血型定型類試劑：血型定型試劑盒（人血清/馬血清）免疫組化：癌胚抗原檢測試劑盒（多抗）免疫比濁：β-微球蛋白測定試劑盒（免疫比濁法）乳膠凝集：沙門氏菌乳膠凝集試劑盒第36頁，共76頁，2023年，2月20日，星期一抗原抗原：指進(jìn)入有免疫活性的組織（宿主）而引發(fā)免疫應(yīng)答的物質(zhì)?；螂m不能引發(fā)免疫，但可以同抗體結(jié)合的物質(zhì)。蛋白質(zhì)，多糖，核酸，糖脂，青霉素全抗原性具有多個抗原決定族第37頁，共76頁，2023年，2月20日，星期一抗體宿主對體內(nèi)存在的外來分子，微生物或其他因子的應(yīng)答而產(chǎn)生的蛋白質(zhì)（免疫球蛋白，丙種球蛋白）根據(jù)抗體性質(zhì)：多克隆抗體，單克隆抗體根據(jù)抗體分子結(jié)構(gòu)：IgA,D,E,G,M第38頁，共76頁，2023年，2月20日，星期一IgGIgM抗體模式圖第39頁，共76頁，2023年，2月20日，星期一單克隆抗體由一株淋巴細(xì)胞產(chǎn)生，針對一種抗原決定族抗原免疫小鼠-取脾臟-與瘤細(xì)胞融合-克隆篩選-單克隆抗體細(xì)胞株擴(kuò)增細(xì)胞-注射入小鼠腹腔-采腹水-純化抗體第40頁，共76頁，2023年，2月20日，星期一流程雜交瘤技術(shù)第41頁，共76頁，2023年，2月20日，星期一第42頁，共76頁，2023年，2月20日，星期一多克隆抗體針對多個抗原決定族抗原免疫動物-采集動物血清純化抗體第43頁，共76頁，2023年，2月20日，星期一

血型抗原/RBC抗體/外周血

AAanti-BBBanti-A

O noneanti-A&anti-B

ABA&BnoneABO血型測定第44頁，共76頁，2023年，2月20日，星期一空氣柱微柱玻璃珠反應(yīng)艙試劑第45頁，共76頁，2023年，2月20日，星期一結(jié)果判讀第46頁，共76頁，2023年，2月20日，星期一（第七類）

診斷血清（菌液）診斷血清：侵襲性大腸埃希氏菌診斷血清；志賀氏菌屬四種混合多價血清診斷菌液：傷寒沙門菌菌體（O）抗原、鞭毛（H）抗原診斷菌液第47頁，共76頁，2023年，2月20日，星期一診斷血清工藝流程采集血清收集抗體（離心機）效價檢測等分裝、凍干免疫動物免疫抗原制備分離血清滅活處理吸收非特異性抗體吸收用抗原制備第48頁，共76頁，2023年，2月20日，星期一診斷菌液工藝流程效價檢測等分裝、包裝細(xì)菌培養(yǎng)滅活處理第49頁，共76頁，2023年，2月20日，星期一（第八類）

血球凝集類試劑抗體致敏血球：破傷風(fēng)抗體診斷試劑（血凝法）；白喉抗體診斷試劑（血凝法）第50頁，共76頁，2023年，2月20日，星期一間接凝集試驗示意圖+

用可溶性抗原致敏紅細(xì)胞或其它顆粒性介質(zhì)，可以用來測定細(xì)菌、病毒等微生物的抗體。第51頁，共76頁，2023年，2月20日，星期一間接血凝試劑基本生產(chǎn)工藝流程

醛化紅細(xì)胞的制備致敏抗原或抗體的制備紅細(xì)胞的采集致敏抗原（或抗體）的制備

紅細(xì)胞的醛化（洗滌、離心、醛化）致敏抗原（或抗體）的檢定對照血球的制備

紅細(xì)胞的致敏（鞣化、致敏、封閉）稀釋液的制備半成品檢定分裝、凍干、包裝成品檢定第52頁，共76頁，2023年，2月20日，星期一（第九類）

核酸擴(kuò)增類試劑熒光PCR：乙型肝炎病毒核酸定量測定試劑盒PCR-ELISA：結(jié)核分支桿菌檢測試劑盒（核酸擴(kuò)增酶聯(lián)免疫法）PCR-毛細(xì)管電泳：性染色體多倍體（分型與突變）檢測試劑盒；PCR-電泳：α-地中海貧血基因診斷試劑盒（gap-PCR法）轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴(kuò)增（TMA）：沙眼衣原體與結(jié)核分枝桿菌檢測試劑盒第53頁，共76頁，2023年，2月20日，星期一PCR基本原理示意圖第54頁，共76頁，2023年，2月20日，星期一PCR過氧化物酶聯(lián)物96孔酶標(biāo)法加樣分析觀察數(shù)據(jù)PCR產(chǎn)物的檢測

96孔酶標(biāo)法

第55頁，共76頁，2023年，2月20日，星期一Taqman法的原理Polymerization5‘5‘3‘3‘5‘ForwardPrimer5‘ReversePrimerStrandDisplacement5‘5‘3‘3‘5‘5‘P3‘RQRQProbeP3‘RQCleavage5‘5‘3‘3‘5‘5‘P3‘RQPolymerizationCompleted5‘5‘3‘3‘5‘5‘P3‘RQReporterQuencher第56頁，共76頁，2023年，2月20日，星期一ContinuouscyclingDegradeRNAwithRNaseHactivityandprimer2hybridizesChironProcleixHIV-1/HCVAssay

Step2:Transcription-MediatedAmplificationRNAtranscriptionbyRNApolymeraseRNAamplificationproductIsothermalincubation>109foldamplificationinonehourcDNAsynthesisbyreversetranscriptaseDNAsynthesisbyreversetranscriptaseTargetRNAPromoter-primerhybridizes第57頁，共76頁，2023年，2月20日，星期一（第十類）

基因芯片（微陣列）類試劑基因芯片（微陣列）：α-地中海貧血基因芯片診斷試劑盒PCR-雜交：人乳頭瘤病毒基因分型檢測試劑盒（PCR-反向雜交法）第58頁，共76頁，2023年，2月20日，星期一基因芯片法聯(lián)合檢測HBVDNA－HCVRNA第59頁，共76頁，2023年，2月20日，星期一第60頁，共76頁，2023年，2月20日，星期一第61頁，共76頁，2023年，2月20日，星期一

乙型肝炎病毒基因多態(tài)性檢測芯片芯片外觀及點樣區(qū)示意圖如上：點陣信息：點陣信息：A1:1896野生型B1:1896突變型A2:1814野生型B2:1814突變型A3:1762野生型B3:1762突變型A4:1764野生型B4:1764突變型A5:P區(qū)528位野生型B5:P區(qū)528位突變型A6:P區(qū)552位野生型B6:P區(qū)552位突變型A7:P區(qū)552位突變型B7：陰性參照Ⅱ

第62頁，共76頁，2023年，2月20日，星期一檢測結(jié)果圖

1762/64位點聯(lián)合變異第63頁，共76頁，2023年，2月20日，星期一丙型肝炎病毒基因分型檢測

芯片示意圖

Ⅰ：陽性內(nèi)參照I；Ⅱ：陰性內(nèi)參照I；Ⅲ：陽性內(nèi)參照II；Ⅳ：陰性內(nèi)參照II。

A1:I型B1:I型A2:1a/2aB2:1a/1bA3:1bB3:1bA4:II型B4:II型A5:2aB5:2aA6:3a/3bB6:3bA7:3bB7:6aA8：陰性A8：陰性

第64頁，共76頁，2023年，2月20日，星期一丙型肝炎病毒基因分型芯片示意圖第65頁，共76頁，2023年，2月20日，星期一（第十一類）

探針放大（原位雜交）類試劑bDNA類：HIV-1bDNA檢測試劑盒；mRNA檢測試劑盒(生物素原位雜交法)第66頁，共76頁，2023年，2月20日，星期一探針放大類試劑--支鏈DNA技術(shù)病毒的RNA釋放后加入微孔板中——板孔中包被有可與病毒特異結(jié)合的一系列靶探針（TargetProbe），另一系列靶探針的一端可標(biāo)記在游離的病毒核酸鏈上，另一端可與bDNA結(jié)合——bDNA信號放大——加入酶標(biāo)記物對結(jié)合的bDNA進(jìn)行標(biāo)記——經(jīng)過清洗后加入底物進(jìn)行反應(yīng)，測定反應(yīng)強度。第67頁，共76頁，2023年，2月20日，星期一（第十二類）

普通生化類試劑（十萬級要求）（包括酶類化學(xué)試劑、凝血試劑類等試劑）酶類化學(xué)試劑:丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）測定試劑盒；堿性磷酸酶（ALP）測定試劑盒凝血試劑:凝血酶原時間（PT）測定試劑盒；組織纖溶酶原激活物（t-PT）測定試劑盒第68頁，共76頁，2023年，2月20日，星期一普通生化類試劑(十萬級要求)（1）★原理：臨床普通生化類試劑是一類用于測定人血液、尿液等中各項生化指標(biāo)的試劑。含有各種非特異性蛋白成分，要求在十萬級潔凈環(huán)境中生產(chǎn)。檢測方法均為比色法，方法學(xué)原理均為顯色反應(yīng)。

★產(chǎn)品涉及：

1、酶類：含酶、輔酶與牛血清白蛋白等、劑型為干粉或液體。

2、血凝類：試劑組分中含有其他活性類組分（如兔腦粉等）?！锷a(chǎn)工藝：原材料稱量、溶解、定容、中試、分裝、組裝、成品檢驗。★關(guān)鍵控制點：原料稱量、配制、物料平衡?！都?xì)則》要求：應(yīng)在10萬級凈化環(huán)境