植物組織培養(yǎng)外植體的選擇與建立

植物組織培養(yǎng)外植體的選擇與建立第1頁/共52頁第二節(jié)外植體（培養(yǎng)物）的選擇根據(jù)細胞全能性學說，植物體的每一個細胞都含有全部的遺傳信息，都能再生出一個新植株。但是，要使每個細胞的全能性都表現(xiàn)出來，在目前還是不易做到的事。因而，外植體（初始培養(yǎng)物）的選擇非常重要。第2頁/共52頁1、基因型：再生能力（1）、雙子葉>單子葉；（2）、被子植物>裸子植物；（3）、雙子葉植物中：茄科（Solanacea）；秋海棠科（Begoniaceae）；景天科（Crassulaceae）；苦苣苔科（Gesneriaceae）；十字花科（Cruciferae）再生力特強；郁金香（Tulip）再生力較弱。（4）、同一種植物中：活體（invivo）再生力強者，離體（invitro）再生力也強。第二節(jié)外植體（培養(yǎng)物）的選擇第3頁/共52頁杜鵑花‘Rhodoendron’第二節(jié)外植體（培養(yǎng)物）的選擇第4頁/共52頁2、根據(jù)母株的年齡和生長發(fā)育階段選擇：生長開花童年期轉(zhuǎn)變年期成年期年齡階段發(fā)育第二節(jié)外植體（培養(yǎng)物）的選擇第5頁/共52頁2、根據(jù)母株的年齡和生長發(fā)育階段選擇：植株的生長與發(fā)育第二節(jié)外植體（培養(yǎng)物）的選擇第6頁/共52頁2、根據(jù)母株的年齡和生長發(fā)育階段選擇：年齡或幼化程度外植體建立母株年齡和幼化程度與外植體建立階段發(fā)育外植體建立母株階段發(fā)育與外植體建立第二節(jié)外植體（培養(yǎng)物）的選擇第7頁/共52頁杜鵑花‘vanWeerdenPoelman’第二節(jié)外植體（培養(yǎng)物）的選擇第8頁/共52頁第二節(jié)外植體（培養(yǎng)物）的選擇第9頁/共52頁3、根據(jù)時間和季節(jié)取材生長物質(zhì)含量時間或季節(jié)抑制物質(zhì)含量時間或季節(jié)第二節(jié)外植體（培養(yǎng)物）的選擇第10頁/共52頁3、根據(jù)時間和季節(jié)取材物質(zhì)含量時間或季節(jié)抑制物質(zhì)生長物質(zhì)取材時間取材時間第二節(jié)外植體（培養(yǎng)物）的選擇第11頁/共52頁4、根據(jù)母株位置選擇：具原基結(jié)構(gòu)的外植體：莖尖、側(cè)芽、原球莖、鱗芽、分生組織不具原基結(jié)構(gòu)的外植體：根、莖、葉、花、果等器官，需要脫分化。第二節(jié)外植體（培養(yǎng)物）的選擇第12頁/共52頁第二節(jié)外植體（培養(yǎng)物）的選擇第13頁/共52頁第二節(jié)外植體（培養(yǎng)物）的選擇第14頁/共52頁第二節(jié)外植體（培養(yǎng)物）的選擇第15頁/共52頁第二節(jié)外植體（培養(yǎng)物）的選擇第16頁/共52頁第二節(jié)外植體（培養(yǎng)物）的選擇4、根據(jù)外植體的大小選擇：外植體大小外植體建立外植體大小與外植體建立第17頁/共52頁第二節(jié)外植體（培養(yǎng)物）的選擇第18頁/共52頁4、污染（Infection）能否有效地控制微生物污染是植物離體培養(yǎng)是否成功的關(guān)鍵技術(shù)之一。對于離體培養(yǎng)的探索性研究實驗，污染會導致實驗失?。粚τ诖笠?guī)模的離體繁殖生產(chǎn)來說，污染使生產(chǎn)成本大大增加。因此，無論是科研機構(gòu)還是生產(chǎn)廠家都十分重視微生物污染問題。植物離體培養(yǎng)中的污染可分為外植體、培養(yǎng)基、無菌操作和培養(yǎng)環(huán)境四個方面。其中培養(yǎng)基和無菌操作方面的污染，目前已得到十分有效的控制。外植體方面污染最復雜，也最難控制，其可能是細菌引起的，也可能是真菌引起的；微生物可能是附生性的，也可能是內(nèi)生性的。近年來，國外較重視各種微生物的鑒定，并根據(jù)不同的微生物種類采取相應(yīng)的控制措施，這方面的研究進展較快。第三節(jié)外植體（培養(yǎng)物）的建立第19頁/共52頁（1）、產(chǎn)生污染的因素：①外植體：通常多年生的木本材料比一二年生的草本材料帶菌多；老的材料比幼嫩的帶菌多；田間生長的材料比溫室的帶菌多；帶泥土的材料比清潔的帶菌多。一年中以雨季的材料帶菌多，一天中以中午陽光最強時的材料帶菌少。②培養(yǎng)基：高壓蒸汽滅菌的溫度、壓力、時間和正確使用情況，以及過濾滅菌中過濾膜孔徑、過濾滅菌器械的滅菌處理、過濾滅菌操作等均影響培養(yǎng)基的滅菌效果。③操作環(huán)節(jié)：接種室是否清潔、干燥、密閉，是否經(jīng)常用紫外線燈照射、甲醛熏蒸、70％酒精噴霧殺菌等，操作是否等熟練。④培養(yǎng)環(huán)境：培養(yǎng)室要求清潔、密閉。每天用70％酒精噴霧除菌、降塵，每周用少量甲醛熏蒸滅菌。如有空氣過濾裝置效果更好。培養(yǎng)室相對濕度太高時，污染加重。第三節(jié)外植體（培養(yǎng)物）的建立第20頁/共52頁（2）、污染的防止：母株保護：保持母株清潔，減少噴灌。溫室種植，噴施殺菌（蟲）劑，減少病原菌含量。材料選擇：選取生長發(fā)育健壯，病蟲危害少的材料。嚴格清洗、消毒與無菌操作。小容器、分散接種。第三節(jié)外植體（培養(yǎng)物）的建立第21頁/共52頁（3）、污染估算及對策：污染估算：首次接種通常污染率40—60%按40%計：接種100個材料1個材料/容器：污染量=100X40%=40獲得量=100-40=60。2個材料/容器：2污染：1X40%X40%=16%1污染：2X40%X40%=32%2未污染：60%X60%=36%污染率=100-36=62%污染量=100X62%=62獲得量=100-62=483個材料/容器：污染率=100-（60%）3=78.4%污染量=100X78.4%=79獲得量=100X（60%）3=214個材料/容器：獲得量=100X（60%）4=135個材料/容器：獲得量=100X（60%）5=8防止污染的對策：小容器、多數(shù)量、盡量分散、相互隔離棄掉第三節(jié)外植體（培養(yǎng)物）的建立第22頁/共52頁（4）、附生菌控制：采用化學殺菌劑可以有效地殺死附生菌，但是一些較特殊的外植體材料，如密披絨毛的葉片或幼果、花芽或帶苞片的葉芽，附生菌可能潛伏在外植體上，無法徹底清除。這時，必須采取一些特殊的措施，才能有效控制附生菌。取材來源：從保護條件下生長的植株上取材，可有效地控制微生物污染。保護條件指溫室、培養(yǎng)箱、生長室等。從溫室、培養(yǎng)箱里取材，可有效減少附生菌的群體數(shù)量。從栽培于溫室中的植株上取材和從露地取材相比，前者污染率更低。所取植株的生長土壤，是組織培養(yǎng)中的一個重要污染源。如果采用溫室栽培，事先應(yīng)進行土壤滅菌。此外，灌溉水也可能成為污染源。取材于用過濾水和用緘市飲用水灌溉的植株，前者大大降低了微生物污染.材料預(yù)處理：在對外植體進行常規(guī)化學滅菌之前，對特殊材料進行特殊預(yù)處理，可以收到很好的效果。例如，在對密披絨毛的枇杷幼果進行滅菌之前，先把絨毛刮去，滅菌效果很好。對于密披絨毛的葉片，可先連枝帶葉放在自來水下沖洗，去除污物后，用0.5％Tween20浸1h（其間換新鮮液2～3次），然后進行常規(guī)滅菌，就可起到徹底殺菌的作用。對蘭花花芽常規(guī)滅菌之前，先用10％的殺藻銨（BenzalkoniumChloride）溶液浸漬材料10min，效果很好。第三節(jié)外植體（培養(yǎng)物）的建立第23頁/共52頁（5）、內(nèi)源菌防治：植物組織培養(yǎng)中對材料只能進行表面滅菌，而對材料組織內(nèi)部所帶的細菌往往難以對付。表面污染與內(nèi)源污染的區(qū)別：第三節(jié)外植體（培養(yǎng)物）的建立第24頁/共52頁常見內(nèi)源菌：芽孢桿菌（rodbacteria）為主，尤其是Baciluslicheniformis和B.subtilis（“whiteghost”）。真菌中主要是鐮刀菌(Fusarium)、輪枝孢菌(Verticillium)、瓶霉菌(Phialophora)和絲核菌(Rhizoctonia)。內(nèi)源菌的檢測：通常情況下，通過觀察培養(yǎng)瓶就可看到一些污染的跡象；但是對于生長緩慢的細菌或內(nèi)生菌來說，僅靠肉眼觀察是不夠的，必須通過指示培養(yǎng)，即采用微生物特別容易生長的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，讓外植體上的微生物快速生長，然后予以鑒定[培養(yǎng)基中加入蛋白胨（peptone）、胰蛋白胨（trypone）或酵母汁(YE)]。第三節(jié)外植體（培養(yǎng)物）的建立第25頁/共52頁第三節(jié)外植體（培養(yǎng)物）的建立防止方法：在培養(yǎng)基中加入抗生素。利用莖尖培養(yǎng)。利用無菌材料。第26頁/共52頁抗生素防治內(nèi)源菌：外植體頂芽培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)的污染、不同采收期外植體存在的污染和表面徹底消毒后的細菌污染都可能是內(nèi)生菌造成的。內(nèi)生菌的污染，無論用何種表面消毒方法都不能徹底消除，因此，必須使用抗生素進行間接防治處理。選用適當?shù)目股靥貏e重要。理想的抗生素應(yīng)該具備以下特性：可溶性、穩(wěn)定性、不受pH高低和培養(yǎng)基差異的影響、無邊界效應(yīng)、廣譜性、殺菌性、不產(chǎn)生抗性誘導、既廉價又對人體無害。第三節(jié)外植體（培養(yǎng)物）的建立第27頁/共52頁常用如下抗生素：鏈霉素(10mg／L)、青霉素(20mg／L)、地霉素(5mg／L)、夾竹桃霉素(20mg／L)、桿菌肽(50mg／L)、新霉素(1mg／L)。例如：用奧復星（氧氟沙星注射液）40～80mg／L、注射用的青霉素96～192mg／L可有效抑制棗樹試管苗的細菌污染，而鏈霉素40～800mg／L和硫酸慶大霉素20～60mg／L抑制棗樹細菌效果不明顯。第三節(jié)外植體（培養(yǎng)物）的建立第28頁/共52頁單獨使用一種抗生素，通常效果很差，幾種抗生素的配合使用，可以起到協(xié)同增益作用，但有時也可能使個別藥物相互作用而失效。幾種高濃度殺菌劑配合使用很可能對植物有毒害。對于某一特定細菌，確定抗生素的最低殺菌劑量是很重要的，這種最低劑量可以通過不同濃度的抗生素與細菌進行液體共同培養(yǎng)來確定。若找到有效濃度，則在實驗處理前就可確定對植物材料的毒性范圍。第三節(jié)外植體（培養(yǎng)物）的建立第29頁/共52頁抗生素對植物材料的毒性因植物類型不同差異很大，因此，用植物離體培養(yǎng)進行基本的測試是實驗成功的重要一步。由于植物毒性影響或抗生素滲透性差，在處理污染實驗中，抗生素對分離組織也可能失效。了解抗生素對細菌和植物二者的效應(yīng)，是消除污染和保護培養(yǎng)物的關(guān)鍵。此外，抗生素常作為預(yù)防污染作用而加入到培養(yǎng)基中，或者在已鑒定出細菌污染的情況下，用于抑制細菌生長或消滅細菌?？股氐目咕饔迷谥行耘囵B(yǎng)基(pH6.5—7.5)中比常規(guī)狀態(tài)提高許多，而在酸性條件下則失效，而且抗生素具有熱敏感性，不能采用高溫高壓滅菌，只能采用過濾滅菌的方法加入培養(yǎng)基。第三節(jié)外植體（培養(yǎng)物）的建立第30頁/共52頁（6）、特殊污染源：污染中特別注意一種呈乳白色的細菌污染，這種細菌為芽孢桿菌。法國林木育種協(xié)會鑒定為遲緩芽孢桿菌(Bacilluslenlus)，它外被莢膜，耐高溫，一般滅菌劑難以殺死。它可以隨培養(yǎng)材料、用具等傳播；它可出現(xiàn)在培養(yǎng)基表面，或呈滴形云霧狀存在于培養(yǎng)基內(nèi)。若出現(xiàn)應(yīng)及時淘汰污染源，并對所用過的器皿和用具進行嚴格高溫滅菌處理。第三節(jié)外植體（培養(yǎng)物）的建立第31頁/共52頁5、褐變（Browning）：（1）、概念：外植體在培養(yǎng)容器中被氧化變褐而死亡的現(xiàn)象。第三節(jié)外植體（培養(yǎng)物）的建立第32頁/共52頁（2）、外植體材料褐化原理：植物組織的褐化是通過含銅的氧化酶如多酚氧化酶和酪氨酸酶起作用所致，其作用的底物通常是酪氨酸和鄰位羥酚類化合物如綠原酸等。酶和底物在植物正常生長的情況下是在組織內(nèi)的不同部位，當細胞受傷或組織垂死時，酶和底物就跑到一起發(fā)生作用，當酚被氧化為活性酸化物和環(huán)形多聚體氧化蛋白時便形成深色化合物，這些物質(zhì)又很快被氧化和變成復雜的抑制性物質(zhì)，從而導致外植體材料變褐死亡并使培養(yǎng)基變褐。第三節(jié)外植體（培養(yǎng)物）的建立第33頁/共52頁（3）、褐化發(fā)生的可能因素：與組培植物品種有關(guān)：不同的植物種與品種之間常有很大差異，有人把此歸結(jié)為基因型的不同。一般來說，植物材料中單寧類和多種羥酚類化合物的含量高，易引起外植體材料的嚴重褐化。多數(shù)木本植物比草本植物易引起褐化，多年生草本植物比一年生草本植物易引起褐化。第三節(jié)外植體（培養(yǎng)物）的建立第34頁/共52頁第三節(jié)外植體（培養(yǎng)物）的建立與取樣外植體年齡有關(guān)：引起褐化程度的輕重常與取樣外植體組織的年齡有關(guān)，通常是幼齡部位產(chǎn)生褐化較輕，隨著組織的老齡化而褐化加重。因此，在外植體接種時常需要剝?nèi)[片和大葉片，尤其是以切取幼嫩的芽尖或切取頂芽分生組織（或帶少量葉原基）接種更為理想。第35頁/共52頁與外植體取樣時間有關(guān)：外植體材料的褐化程度常與外植體的取樣時間有關(guān)。一般在春夏季，尤其是春季采取生長旺盛部位的外植體產(chǎn)生褐化較輕，已木栓化或木質(zhì)化的枝條和處于休眠狀態(tài)的休眠芽作為外植體時褐化嚴重。第三節(jié)外植體（培養(yǎng)物）的建立第36頁/共52頁第三節(jié)外植體（培養(yǎng)物）的建立與培養(yǎng)基有關(guān)：接種外植體的培養(yǎng)基的狀態(tài)（固體，半固體或液體培養(yǎng)基）、無機鹽濃度和激素種類及濃度，以及培養(yǎng)基的pH值，都與外植體接種后產(chǎn)生的褐化程度有關(guān)。一般在液體培養(yǎng)基上加濾紙橋和半固體培養(yǎng)基上褐化程度比在固體培養(yǎng)基上輕。低鹽培養(yǎng)基，尤其是Mn2+和Cu2+離子濃度較低時，外植體的褐化程度比在高鹽培養(yǎng)基上輕。培養(yǎng)基中的細胞分裂素（BA、KT），常常不僅能促進酚類化合物的合成，而且還能刺激酚氧化酶的活性，因此，較高濃度的BA反而會加重外植體的褐化程度。培養(yǎng)基的pH值較低時常有利于減輕外植體的褐化。第37頁/共52頁與溫度和光照有關(guān)：外植體接種后，開始培養(yǎng)的溫度和光照條件也常對外植體的褐化程度有一定的影響。第三節(jié)外植體（培養(yǎng)物）的建立第38頁/共52頁（4）、防止褐化產(chǎn)生的幾種途徑：根據(jù)外植體產(chǎn)生褐化的原理和有關(guān)的影響因素，可以采取以下途徑來防止或減輕褐化，提高外植體接種的成功率。移去法：流水沖洗材料：在外植體材料表面消毒前用流水沖洗一段時間（數(shù)小時或過夜），然后進行表面消毒和接種，接種后在短時間（一天后）內(nèi)多次轉(zhuǎn)移到新鮮的培養(yǎng)基上，直至褐化基本消失。多次轉(zhuǎn)移：在外植體開始接種時用液體培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)一段時間，并在短期內(nèi)更換幾次新鮮培養(yǎng)基，待褐化現(xiàn)象明顯減輕后再轉(zhuǎn)入固體培養(yǎng)基培養(yǎng)。第三節(jié)外植體（培養(yǎng)物）的建立第39頁/共52頁吸附法：用活性炭（AC）或聚乙烯毗咯烷酮（PVP）等吸收酚及其有害產(chǎn)物。通?？稍谂囵B(yǎng)基中附加2～3克／升的活性炭，或5～20克／升的PVP，或加倍Fe-EDTA(螯合鐵)的用量，均有減輕褐化傷害的效果。改變氧化一還原勢法：應(yīng)用還原劑可造成較低的氧化一還原勢，能有效地防止褐化的發(fā)生。常用的還原劑有維生素C、檸檬酸、半胱氨酸鹽酸鹽、谷胱甘肽和巰基乙醇等。使用方法可以在外植體材料消毒前快速浸入上述抗氧化劑溶液中，也可以用抗氧化劑溶液浸濕濾紙，在濕潤的濾紙上進行外植體材料的切割，這樣傷口很快就可以接觸抗氧化劑而防止材料褐化。第三節(jié)外植體（培養(yǎng)物）的建立第40頁/共52頁第三節(jié)外植體（培養(yǎng)物）的建立減少氧化機會：創(chuàng)傷是外植物體脫分化和形成愈傷組織的一個條件。由于被溶解的氧會提高氧化—還原勢，從而造成外植體傷口表面很快地氧化引起褐變。因此，應(yīng)盡可能地減少新鮮外植材料切割、接種操作過程中在空氣中暴露的時間，以便減輕外植體的褐變。第41頁/共52頁抑制酚氧化酶的活性法：銅是酚氧化酶的功能性金屬離子，利用螯合劑螯合銅離子對減輕褐化也是有效的。譬如乙二胺四乙酸（EDTA）、二乙基二硫代氨基甲酸脂和二甲基二硫代氨基甲酸脂等都是銅離子的螯合劑，同時這類螯合劑也可能是抗氧化劑，可以用來抑制酚氧化酶的活性。一定的低溫（18℃以下），降低多酚氧化酶的活性或減少底物，均能降低酚類物質(zhì)的氧化速率，從而減輕材料的褐化。第三節(jié)外植體（培養(yǎng)物）的建立第42頁/共52頁降低環(huán)境的pH值法：多酚氧化酶的活性在pH值6.5時最大，隨著pH值的降低而活性下降。上述的維生素C和檸檬酸等不僅是還原劑，同時也能降低pH值，降低多酚氧化酶的活性，從而減輕材料的褐化。熱激處理法：多酚氧化酶是一種不耐熱的酶，在45℃～50℃以上時活性迅速下降，在40℃以下保持較穩(wěn)定的活性。所以，如果外植體材料采用45℃～50℃高溫預(yù)處理45分鐘后進行外植體接種，也可有效地抑制褐變。第三節(jié)外植體（培養(yǎng)物）的建立第43頁/共52頁暗培養(yǎng)法：光線?？稍黾又参矬w內(nèi)酚的生物合成和加速傷口部位酚的氧化，故新接種的外值體可以先進行暗培養(yǎng)7～14天后再逐步移入光照培養(yǎng)。培養(yǎng)基的附加物法：一般來說，較高濃度的激動素水平對莖尖的生長和分化是需要的，但容易引起材料和培養(yǎng)基加深褐化。因此，可以在外植體接種開始的一周內(nèi)適當降低激動素水平來減輕材料和培養(yǎng)基的褐變。MS培養(yǎng)基中的高K含量也常容易引起褐化，可改用1／2的KNO3量。此外，碳水化合物也是酚化物生物合成所必需的，適當降低培養(yǎng)基中的蔗糖濃度至1％也常可以減輕褐化，有些植物可能在蔗糖培養(yǎng)基中褐化嚴重，而在葡萄糖或山梨糖培養(yǎng)基上褐化較輕。第三節(jié)外植體（培養(yǎng)物）的建立第44頁/共52頁第三節(jié)外植體（培養(yǎng)物）的建立6、培養(yǎng)反應(yīng)的觀察與統(tǒng)計：材料接種培養(yǎng)后要經(jīng)常進行觀察和調(diào)查統(tǒng)計。并根據(jù)培養(yǎng)材料的反應(yīng)決定下一步操作。（1）、污染率：（2）、褐變率：（3）、誘導（啟動）率：第45頁/共52頁第三節(jié)外植體（培養(yǎng)物）的建立愈傷組織：在離體培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)的植物細胞、組織或器官等材料由于切傷后分泌的創(chuàng)傷激素和培養(yǎng)基中添加的外源激素共同作用下，