第五講的提取原理及提取技術(shù)

第五講的提取原理及提取技術(shù)第1頁，共38頁，2023年，2月20日，星期一3質(zhì)粒DNA

很多微生物（大腸桿菌、農(nóng)桿菌和藍(lán)細(xì)菌）都含有質(zhì)粒DNA，主要用于構(gòu)建基因克隆載體，也可作為分離目的基因和基因表達(dá)調(diào)控因子的材料。4線粒體和葉綠體DNA

這是真核生物特有的染色體外遺傳物質(zhì)，分別含有與呼吸作用和光和作用相關(guān)的基因。主要用于分離目的基因。第2頁，共38頁，2023年，2月20日，星期一植物細(xì)胞的化學(xué)成分主要有:1水、糖類、蛋白質(zhì)、脂肪以及核酸是生物體所需的基本成分；2氨基酸是合成蛋白質(zhì)的基本原料；3果膠、纖維素、半纖維素是植物細(xì)胞壁的組成成分；4淀粉是光合作用的產(chǎn)物；5金屬離子主要用來調(diào)節(jié)細(xì)胞的滲透平衡等，比如鉀和鈉，鎂和錳是葉綠素的成分。第3頁，共38頁，2023年，2月20日，星期一植物總DNA提取原則保證DNA結(jié)構(gòu)的完整性排除有機(jī)溶劑和金屬離子的污染蛋白質(zhì)、多糖、酚類等降低到最低程度排除其他核酸分子的污染第4頁，共38頁，2023年，2月20日，星期一植物DNA提取的基本原理DNA特點(diǎn)：

DNA是極性化合物，溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有機(jī)溶劑。在酸性溶液中，DNA易水解，在中性或弱堿性溶液中較穩(wěn)定。

DNP在鹽溶液中的溶解度隨著鹽濃度的增加而增加。

第5頁，共38頁，2023年，2月20日，星期一植物DNA提取的基本原理DNA提取基本步驟：1細(xì)胞裂解和DNA的溶解

主要任務(wù)：破碎細(xì)胞并對DNA實(shí)施保護(hù)。

采取措施：

⑴利用液氮研磨，使酶失活；⑵快速加入緩沖液并迅速混勻，對細(xì)胞溶漿中DNA進(jìn)行保護(hù)。第6頁，共38頁，2023年，2月20日，星期一

EDTA—螯合DNA酶的輔助因子Mg2+和Ca2+,使DNA酶活性降低；

SDS—使蛋白質(zhì)變性并降解蛋白質(zhì)，也可降低DNA酶的活性；

抗氧化劑—降低酚類氧化對DNA的干擾；

PVP—與多酚形成復(fù)雜的聚合體，與多糖結(jié)合，有效去除多糖；

。。。。。。第7頁，共38頁，2023年，2月20日，星期一植物DNA提取的基本原理2與核酸結(jié)合的蛋白質(zhì)及RNA等雜質(zhì)的去除；主要利用DNA與蛋白質(zhì)、多糖等在生化性質(zhì)上的差別，通過加入離子變性劑，去污劑使蛋白質(zhì)或多糖變性，核蛋白解聚。

CTAB

SDS第8頁，共38頁，2023年，2月20日，星期一除蛋白質(zhì)氯仿/異戊醇抽提（氯仿可使蛋白質(zhì)變性并有助于液相與有機(jī)相的分離；異戊醇則有助于消除抽提過程中出現(xiàn)的氣泡）。使用變性劑變性（SDS、異硫氰酸胍等）高鹽洗滌(當(dāng)溶液中的中性鹽的濃度大于1mol/L時，蛋白質(zhì)會沉淀析出.)蛋白酶處理第9頁，共38頁，2023年，2月20日，星期一除多糖高鹽法：用乙醇沉淀時，在待沉淀溶液中加入1/2體積的5MNaCl，高鹽可溶解多糖。用多糖水解酶將多糖降解。在提取緩沖液中加一定量的氯苯(1/2體積)，氯苯可以與多糖的羥基作用，從而去除多糖。第10頁，共38頁，2023年，2月20日，星期一

除酚類物質(zhì)在抽提液中加入防止酚類氧化的試劑：β-巰基乙醇、抗壞血酸、半胱氨酸、二硫蘇糖醇等加入易與酚類結(jié)合的試劑：如PVP、PEG(聚乙二醇)，它們與酚類有較強(qiáng)的親和力，可防止酚類與DNA的結(jié)合第11頁，共38頁，2023年，2月20日，星期一

除各種離子

70％的乙醇洗滌注意：我們在提取某種植物DNA時，需要考慮以上各種雜質(zhì)的存在，根據(jù)某種植物DNA的具體情況采取相應(yīng)的去除雜質(zhì)的方法。

第12頁，共38頁，2023年，2月20日，星期一植物DNA提取的基本原理3DNA的沉淀和純化

沉淀：無水乙醇

TE緩沖液(10mmol/LTris-HCl,1mMEDTA.pH8.0）

作用：①TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+離子，抑制DNase

②PH值為8.0，可防止DNA發(fā)生酸解第13頁，共38頁，2023年，2月20日，星期一DNA的純化技術(shù)瓊脂糖凝膠電泳洗脫法主要用于小劑量DNA的純化和酶切片段的回收。1DNA樣品在瓊脂糖凝膠電泳分帶后，切取含有待純化DNA帶的瓊脂糖凝膠電泳塊，裝入透析袋中；2透析袋中加入適量經(jīng)稀釋的電泳緩沖液，并置于稀釋的電泳緩沖液中電泳1-2h，使DNA脫離瓊脂糖凝膠；第14頁，共38頁，2023年，2月20日，星期一DNA的純化技術(shù)瓊脂糖凝膠電泳洗脫法3再反向電泳30s-1min，使附著在透析袋膜上的DNA重新進(jìn)入緩沖液中；4吸取透析袋中的洗脫液置于離心管中，以10000r/min離心5min,轉(zhuǎn)移上清液到另一個離心管中，加入3MNaAc，再加入2體積無水乙醇，-20℃放置1.5min以上；第15頁，共38頁，2023年，2月20日，星期一DNA的純化技術(shù)瓊脂糖凝膠電泳洗脫法

54℃，12000r/min離心20min，棄上清，沉淀在空氣中晾干，溶于TE中，-20℃保存?zhèn)溆?。?6頁，共38頁，2023年，2月20日，星期一DNA提取技術(shù)一、染色體DNA的提取

CTAB法

（hexadecyltrimethylammoniumbromide，十六烷基三甲基溴化銨）

SDS法

（十二烷基磺酸鈉，Sodiumdodecylsulfate,簡稱SDS）

第17頁，共38頁，2023年，2月20日，星期一二、非染色體DNA的提取

質(zhì)粒DNA的提取堿裂解法煮沸法線粒體、葉綠體DNA的提取差速離心結(jié)合SDS裂解法第18頁，共38頁，2023年，2月20日，星期一CTAB法（植物DNA提取經(jīng)典方法）原理：

CTAB（hexadecyltrimethylammoniumbromide，十六烷基三甲基溴化銨），是一種陽離子去污劑，可溶解細(xì)胞膜，并與核酸形成復(fù)合物。第19頁，共38頁，2023年，2月20日，星期一

該復(fù)合物在高鹽溶液中（0.7mol/LNaCl）是可溶的，當(dāng)降低溶液鹽的濃度到一定程度（0.3mol/LNaCl）時從溶液中沉淀。通過離心就可將CTAB與核酸的復(fù)合物同蛋白、多糖類物質(zhì)分開，然后將CTAB與核酸的復(fù)合物沉淀溶解于高鹽溶液中，再加入乙醇使核酸沉淀，CTAB能溶解于乙醇中。第20頁，共38頁，2023年，2月20日，星期一

CTAB提取緩沖液的配方

組份Tris-HCl（pH8.0）

EDTA（pH8.0）NaClCTABβ-巰基乙醇

終濃度100mM20mM1.4M2%(W/V)0.1%（V/V）使用前加入

Tris-HCl（pH8.0）提供一個緩沖環(huán)境，防止核酸被破壞；

Tris(三羥甲基氨基甲烷

)EDTA螯合Mg2+或Mn2+離子，抑制DNase活性；NaCl

提供一個高鹽環(huán)境，使DNP充分溶解，存在于液相中；CTAB溶解細(xì)胞膜，并結(jié)合核酸，使核酸便于分離；β-巰基乙醇是抗氧化劑，有效地防止酚氧化成醌，避免褐變，使酚容易去除第21頁，共38頁，2023年，2月20日，星期一CTAB提取緩沖液的改進(jìn)配方

組份Tris-HCl（pH8.0）

EDTA（pH8.0）NaClCTABPVP40β-巰基乙醇

終濃度100mM20mM1.4M3%(W/V)5%(W/V)2%（V/V）使用前加入PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的絡(luò)合物，能與多酚形成一種不溶的絡(luò)合物質(zhì)，有效去除多酚，減少DNA中酚的污染；同時它也能和多糖結(jié)合，有效去除多糖。第22頁，共38頁，2023年，2月20日，星期一CTAB法提取植物DNA的操作步驟

1稱取2～5g新鮮菠菜幼嫩組織或小麥黃花苗等植物材料，用自來水、蒸餾水先后沖洗葉面，用濾紙吸干水分備用。葉片稱重后剪成1cm長，置研缽中，經(jīng)液氮冷凍后研磨成粉末。待液氮蒸發(fā)完后，加入15mL預(yù)熱（60～65℃）的CTAB提取緩沖液，轉(zhuǎn)入一磨口錐形瓶中，置于65℃水浴保溫0.5~1h，不時地輕輕搖動混勻。第23頁，共38頁，2023年，2月20日，星期一CTAB法提取植物DNA的操作步驟

加等體積的氯仿/異戊醇(24:1)，蓋上瓶塞，溫和搖動，使成乳狀液。將錐形瓶中的液體倒入離心管中，在室溫下4000r/min離心5min，靜置，離心管中出現(xiàn)3層，小心地吸取含有核酸的上層清液于量筒中，棄去中間層的細(xì)胞碎片和變性蛋白以及下層的氯仿。第24頁，共38頁，2023年，2月20日，星期一CTAB法提取植物DNA的操作步驟

根據(jù)需要，上清液可用氯仿/異戊醇反復(fù)提取多次。收集上層清液，并將其倒入離心管中。慢慢加入1～2倍體積預(yù)冷的70%乙醇?？煽吹嚼w維狀的沉淀（主要為DNA）。離心，即得到DNA粗制品。

第25頁，共38頁，2023年，2月20日，星期一CTAB法提取植物DNA的操作步驟

6上述DNA粗制品含有一定量的RNA和其它雜質(zhì)。若要制取較純的DNA，可將粗制品溶于TE緩沖液中，加入10mg/mL的RNase溶液，使其終濃度達(dá)50μg/mL，混合物于37℃水浴中保溫30min除去RNA。第26頁，共38頁，2023年，2月20日，星期一CTAB法提取植物DNA的操作步驟

770％乙醇沉淀DNA。最后，將DNA溶于250μL的TE緩沖液中。第27頁，共38頁，2023年，2月20日，星期一

CTAB法流程圖植物材料裂解液上層溶液液氮研磨抽提細(xì)胞裂解干燥溶解離心洗滌酒精沉淀DNA溶液

第28頁，共38頁，2023年，2月20日，星期一

為了保證植物DNA的完整性，在吸取樣品、抽提過程中應(yīng)注意什么？（1）整個提取過程應(yīng)在較低溫度下進(jìn)行（一般利用液氮或冰?。?；這樣可防止和抑制內(nèi)源DNase對DNA的降解；（2）當(dāng)DNA處于溶解狀態(tài)時，要盡量減弱溶液的渦旋，動作要輕柔；在進(jìn)行DNA溶液轉(zhuǎn)移時用大口（或剪口）吸管，盡量減少對溶液中DNA的機(jī)械剪切破壞。第29頁，共38頁，2023年，2月20日，星期一

質(zhì)粒DNA的提取

－堿裂解法

第30頁，共38頁，2023年，2月20日，星期一原理：在堿性條件下線狀DNA發(fā)生變性，質(zhì)粒DNA維持環(huán)狀。在高鹽條件下作復(fù)性處理，變性的染色體DNA會形成沉淀，從而將質(zhì)粒DNA與染色體DNA分開。第31頁，共38頁，2023年，2月20日，星期一質(zhì)粒DNA的提?。瓑A裂解法

染色體DNA比質(zhì)粒DNA分子大得多，且染色體DNA為線狀分子，而質(zhì)粒DNA為共價閉合環(huán)狀分子；當(dāng)用堿處理DNA溶液時，線狀染色體DNA容易發(fā)生變性，共價閉環(huán)的質(zhì)粒DNA在回到中性pH時即恢復(fù)其天然構(gòu)象；變性染色體DNA片段與變性蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片結(jié)合形成沉淀，而復(fù)性的超螺旋質(zhì)粒DNA分子則以溶解狀態(tài)存在液相中，從而可通過離心將兩者分開。第32頁，共38頁，2023年，2月20日，星期一溶液I

（50mmol/L葡萄糖，10mmol/LEDTA，25mMTris-HClpH8.0）作用：分散細(xì)胞溶液II

(0.2mol/LNaOH,1%SDS)(SDS,十二烷基硫酸鈉）作用：細(xì)胞壁肽聚糖堿性下水解，核酸和蛋白質(zhì)變性。溶液III

（3mol/LKAc,PH4.6）作用：酸性下質(zhì)粒DNA復(fù)性，變性蛋白、線性DNA沉淀。第33頁，共38頁，2023年，2月20日，星期一提取大腸桿菌質(zhì)粒DNA的步驟1