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文檔簡(jiǎn)介
目的基因需要克隆的DNA片段。編碼某種蛋白質(zhì)研究某基因結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系研究某基因與疾病的關(guān)系1目的基因的獲取/制備人工合成cDNA文庫(kù)基因組文庫(kù)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)1.基因文庫(kù)2.cDNA文庫(kù)3.人工合成4.PCR2基因組文庫(kù)(genomiclibrary)3
以l噬菌體制作基因組文庫(kù),在一個(gè)基因組文庫(kù)面,所有可能的基因皆被大量復(fù)制。利用探針篩選特定基因。5組織或細(xì)胞染色體DNA基因片斷克隆載體重組DNA分子含重組分子的轉(zhuǎn)化菌限制性內(nèi)切酶受體菌基因組文庫(kù)
存在于轉(zhuǎn)化細(xì)胞內(nèi)由克隆載體所攜帶的所有基因組DNA片段的集合.從基因組文庫(kù)獲取目的基因每個(gè)細(xì)胞含有一個(gè)基因組DNA片段與載體的重組DNA分子,許多細(xì)胞組成一個(gè)含有基因組各DNA片段克隆的集合體.genomiclibrary6基因庫(kù)是通過(guò)重組技術(shù)轉(zhuǎn)化篩選而建立,利用低等生物如細(xì)菌、病毒、噬菌體等生長(zhǎng)快、繁殖能力強(qiáng)的特點(diǎn)作為一種核酸擴(kuò)增的載體,把人類等高等生物的基因或其片段重組其中,成為便于保存、取用方便的基因庫(kù)。建立基因庫(kù)的目的是為了便于目的基因的保存、擴(kuò)增和純化。7基因組文庫(kù)的質(zhì)量評(píng)價(jià)和完備性基因組文庫(kù)必須包括一定數(shù)量的重組子才可能克隆基因組中的任何序列?;蚪M文庫(kù)完備性是指從基因組文庫(kù)中篩選出含有某一目的基因的重組克隆的概率。如果滿足兩個(gè)條件:生物體染色體DNA片段被全部克隆,用于構(gòu)建基因文庫(kù)的DNA片段含有完整的基因,則此基因文庫(kù)的完備性就是1。用基因組文庫(kù)的克隆數(shù)表示基因組文庫(kù)的大小即庫(kù)容量。82.經(jīng)驗(yàn)值
ln(1-f/g)N=ln(1-P)P為從文庫(kù)中選出任一基因或DNA序列的概率即完備性,一般設(shè)為99%(0.99);f為載體容量(kb);g為基因組大?。╧b);N為基因組文庫(kù)的克隆總數(shù),表示文庫(kù)中以P概率出現(xiàn)某段DNA,理論上應(yīng)具有的最少克隆數(shù);10人單倍體DNA總長(zhǎng)為3×109bp若載體裝載量為15kb則構(gòu)建完備性為0.9的基因組文庫(kù)大約需要個(gè)重組克隆.完備性0.990.9990.999946萬(wàn)庫(kù)容量92萬(wàn)138萬(wàn)184萬(wàn)?11選擇載體的主要參數(shù)是基因組大小構(gòu)建大腸桿菌(4.6×106bp)等基因組較小生物的基因組文庫(kù)時(shí),按每個(gè)DNA片段平均長(zhǎng)5kb計(jì)算,一個(gè)包括5000個(gè)DNA片段克隆的基因文庫(kù)就能夠代表一個(gè)完整的大腸桿菌基因組序列,采用質(zhì)粒作為載體便可得到滿意的結(jié)果。構(gòu)建較大基因組的文庫(kù)時(shí),噬菌體、粘粒及YAC常選作克隆載體?;蚪M文庫(kù)分為:質(zhì)粒文庫(kù)、噬菌體文庫(kù)、粘粒文庫(kù)、人工染色體文庫(kù)(細(xì)菌人工染色體文庫(kù)、酵母人工染色體文庫(kù)等)。13可獲得的基因HGP對(duì)比分析內(nèi)含子、外顯子及調(diào)控區(qū)域基因原始結(jié)構(gòu)功能的研究應(yīng)用范圍該種生物所有基因◆◆◆14cDNA文庫(kù)(cDNAlibrary)15逆轉(zhuǎn)錄病毒細(xì)胞內(nèi)的逆轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象:
RNA模板逆轉(zhuǎn)錄酶DNA-RNA
雜化雙鏈RNA酶單鏈DNA雙鏈DNA
逆轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象說(shuō)明:至少在某些生物,RNA同樣具有遺傳物質(zhì)的傳代與表達(dá)功能。17逆轉(zhuǎn)錄酶的應(yīng)用:應(yīng)用于基因工程基因mRNA蛋白質(zhì)多肽鏈18尿素-氯化鋰法硫氰酸胍法polyT親和層析法密度梯度離心分級(jí)法探針篩選法mRNA的提取與純化19基因重組反轉(zhuǎn)錄酶mRNAcDNAcDNA文庫(kù)的組建1.mRNA提取2.cDNA合成cDNA第一鏈的合成cDNA第二鏈的合成3.雙鏈cDNA的分子克隆4.雙鏈cDNA克隆進(jìn)質(zhì)?;蚴删w載體并導(dǎo)入宿主中繁殖.21mRNA分離純化反轉(zhuǎn)錄合成cDNA構(gòu)建cDNA文庫(kù)篩選目的基因22反轉(zhuǎn)錄合成單鏈cDNA23引物-銜接頭法合成cDNA第二鏈25包含著細(xì)胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合稱該組織細(xì)胞的cDNA文庫(kù).基因組基因在特定的組織細(xì)胞中只有一部分表達(dá),且在不同條件、不同分化時(shí)期的細(xì)胞其基因表達(dá)的種類和強(qiáng)度也不盡相同,cDNA文庫(kù)具有組織細(xì)胞特異性。26經(jīng)驗(yàn)值計(jì)算構(gòu)建一個(gè)完整的cDNA文庫(kù),不論mRNA豐度高低,都要包含任一種mRNA的cDNA克隆,最低要求的cDNA文庫(kù)的庫(kù)容量公式:N=ln(1-P)/ln(1-n/T)n為細(xì)胞中某種(常指最稀少)mRNA的拷貝數(shù);T為細(xì)胞中表達(dá)出的所有mRNA的總拷貝數(shù)。P為文庫(kù)中任何一種mRNA序列信息的概率,通常設(shè)為99%;N為文庫(kù)中以P概率出現(xiàn)在細(xì)胞中任何一種mRNA序列理論上應(yīng)具有的最少克隆數(shù);292.序列的完整性除代表性外,文庫(kù)中基因或cDNA片段的序列完整性(所含基因是否完整、是否是全長(zhǎng))也是反映文庫(kù)質(zhì)量的一個(gè)重要因素。在細(xì)胞中表達(dá)出的各種mRNA盡管具體序列不同,但基本上都是由3部分組成,即5′端非翻譯區(qū),中間的編碼區(qū)和3′端非翻譯區(qū)。非翻譯區(qū)的序列特征對(duì)基因的表達(dá)具有重要的調(diào)控作用,編碼序列則是合成基因產(chǎn)物—蛋白質(zhì)模板。要求文庫(kù)中的重組cDNA片段足夠長(zhǎng)以便盡可能地反應(yīng)出天然基因的結(jié)構(gòu)。30cDNA文庫(kù)的改良311.均一化cDNA文庫(kù)cDNA文庫(kù)的均一化,是指某一特定組織或細(xì)胞的所有表達(dá)基因均包含其中,且在cDNA文庫(kù)中表達(dá)基因?qū)?yīng)的cDNA的拷貝數(shù)相等或接近。均一化cDNA文庫(kù)是克服基因轉(zhuǎn)錄水平上巨大差異給文庫(kù)篩選和分析帶來(lái)障礙的有效措施,有利于研究基因的表達(dá)和序列分析。32基因組DNA飽和雜交法mRNA水平上,基因之間豐度差異極大;基因組水平上,基因之間拷貝數(shù)差異不大,即基因在基因組上具有拷貝數(shù)相對(duì)一致的性質(zhì)。通過(guò)cDNA與基因組DNA飽和雜交降低高豐度mRNA在文庫(kù)中高拷貝存在的cDNA的豐度。將隨機(jī)打斷的基因組總DNA片段標(biāo)記為探針,與總cDNA單鏈飽和雜交,棄除未雜交的總cDNA,從cDNA-DNA雜交體上變性釋放已均一化后的總cDNA,轉(zhuǎn)化宿主。332.二級(jí)復(fù)性動(dòng)力學(xué)處理二級(jí)復(fù)性動(dòng)力學(xué)是指高豐度的cDNA在退火條件下復(fù)性速度快,而低豐度的cDNA復(fù)性要很長(zhǎng)時(shí)間,可以通過(guò)控制復(fù)性時(shí)間來(lái)降低豐度。用羥基磷灰石柱將單鏈和雙鏈cDNA分開(kāi),保留單鏈cDNA后轉(zhuǎn)化宿主。34全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)mRNA發(fā)生降解,第二鏈合成中DNA聚合酶的外切核酶活性、反轉(zhuǎn)錄酶特性的RNaseH活性變化,反轉(zhuǎn)錄酶與mRNA模板的脫離(主要受mRNA復(fù)雜結(jié)構(gòu)影響)等都可能會(huì)導(dǎo)致cDNA不完整。保持mRNA的完整性是構(gòu)建全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)的核心。mRNA完整性的確定可通過(guò)直接檢測(cè)mRNA分子的大小,或測(cè)定mRNA的轉(zhuǎn)譯能力。35目的cDNA克隆的篩選和鑒定從cDNA文庫(kù)中篩選和鑒定目的cDNA的方法主要有核酸分子雜交和免疫學(xué)檢測(cè)分析等方法。差別雜交(differentialhybridization)又叫差別篩選(differentialscreening),適用于分離在特定組織細(xì)胞或發(fā)育階段表達(dá)的、受生長(zhǎng)因子調(diào)節(jié)的或藥物誘導(dǎo)表達(dá)的基因。36
37cDNA文庫(kù)與基因組文庫(kù)的比較(1)基因組文庫(kù)克隆的是所有基因,包括未知功能的DNA序列和調(diào)控基因等,cDNA文庫(kù)克隆的是所有表達(dá)的基因,即具有蛋白質(zhì)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)基因,包括調(diào)節(jié)基因。(2)基因組文庫(kù)克隆的是全部遺傳信息,不受時(shí)空影響;cDNA文庫(kù)克隆的是不完全的編碼DNA序列,受發(fā)育和調(diào)控因子的影響。(3)基因組文庫(kù)中編碼的基因是真實(shí)的基因,是帶有內(nèi)含子和外顯子的基因組基因;從cDNA文庫(kù)中獲得的是經(jīng)過(guò)剪切去除內(nèi)含子的基因。38可獲得的基因?qū)Ρ妊芯慨惓;蛏镞M(jìn)化與同源性分析基因表達(dá)基因的結(jié)構(gòu)功能調(diào)節(jié)研究所有正在表達(dá)的基因應(yīng)用范圍◆◆◆◆3940扣除文庫(kù)(subtractedlibrary)反應(yīng)不同組織細(xì)胞或同一組織細(xì)胞不同功能狀態(tài)下,基因表達(dá)差異的cDNA文庫(kù)。41差示文庫(kù)(differentiallibrary)差異顯示反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(differentialdisplayofreversetranscriptionalPCR,DDRT-PCR)(1)PCR擴(kuò)增:所有的mRNA(2)測(cè)序凝膠電泳:對(duì)比發(fā)現(xiàn)cDNA的差異mRNA差異顯示法42可獲得的基因:不同組織細(xì)胞或同一織細(xì)胞不同功能狀態(tài)下表達(dá)差異的基因。腫瘤等病因的分子機(jī)理細(xì)胞對(duì)外因的反應(yīng)研究細(xì)胞增殖分化機(jī)理應(yīng)用◆◆◆43IntronandExoninEukaryoticCellsmRNADNA5’3’cappolyAtailexonexonexonintronintronmaturemRNAProcessingTranscriptionSplicingpromotor3’5’TakeplaceinnucleusstartcodonstopcodonTocytoplasmIntrondeleted44cDNAIsReverseTranscribedfrommRNAmaturemRNApolyAtail5’3’TTTTReversetranscriptionCCC3’5’3’5’3’GGGDNApolymeraseRNAhydrolysis5’3’5’45TwoLibraries:cDNALibraryvsGenomicL
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