第五章電泳分析技術(shù)

第五章電泳分析技術(shù)第1頁(yè)，共58頁(yè)，2023年，2月20日，星期一

一、概述

1.電泳是指帶電荷的溶質(zhì)或粒子在電場(chǎng)中向著與其本身所帶電荷相反的電極移動(dòng)的現(xiàn)象。2.利用電泳現(xiàn)象將多組分物質(zhì)分離、分析的技術(shù)叫做電泳技術(shù)3.可以實(shí)現(xiàn)電泳分離技術(shù)的儀器稱之為電泳儀第2頁(yè)，共58頁(yè)，2023年，2月20日，星期一

目前，電泳技術(shù)已廣泛用于蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸、核苷酸、無(wú)機(jī)離子等成份的分離和鑒定，甚至還用于細(xì)胞與病毒的研究。臨床常用的電泳分析方法主要有醋酸纖維素薄膜電泳、凝膠電泳、等電聚焦電泳、雙向電泳和毛細(xì)管電泳等。

第3頁(yè)，共58頁(yè)，2023年，2月20日，星期一第一節(jié)電泳原理第二節(jié)常用電泳技術(shù)和電泳方法第三節(jié)常用電泳設(shè)備的基本結(jié)構(gòu)及技術(shù)指標(biāo)第四節(jié)毛細(xì)管電泳的基本結(jié)構(gòu)和分離模式第五節(jié)電泳儀的臨床應(yīng)用第六節(jié)電泳技術(shù)的質(zhì)量控制本章目錄第4頁(yè)，共58頁(yè)，2023年，2月20日，星期一第一節(jié)電泳原理第5頁(yè)，共58頁(yè)，2023年，2月20日，星期一

一、電泳的基本原理物質(zhì)分子在正常情況下一般不帶電，即所帶正負(fù)電荷量相等，故不顯示帶電性。但是在一定的物理作用或化學(xué)反應(yīng)條件下，某些物質(zhì)分子會(huì)成為帶電的離子，不同的物質(zhì)，由于其帶電性質(zhì)、顆粒形狀和大小不同，因而在一定的電場(chǎng)中它們的移動(dòng)方向和移動(dòng)速度也不同，因此可使它們分離。第6頁(yè)，共58頁(yè)，2023年，2月20日，星期一

若將帶凈電荷Q的粒子放入電場(chǎng)，則該粒子所受到的電荷引力為：

F引=EQ（6-1）在溶液中,運(yùn)動(dòng)粒子與溶液之間存在阻力F阻

F阻=6πrηV（6-2）第7頁(yè)，共58頁(yè)，2023年，2月20日，星期一

當(dāng)F引=F阻時(shí)EQ=6πrηVV=EQ/6πrη（6-3）由上式可以看出,粒子的移動(dòng)速度(泳動(dòng)速度V)與電場(chǎng)強(qiáng)度(E)和粒子所帶電荷量(Q)成正比,而與粒子的半徑(r)及溶液的粘度(η)成反比。第8頁(yè)，共58頁(yè)，2023年，2月20日，星期一

二、影響電泳的外界因素（一）電場(chǎng)強(qiáng)度

（二）溶液的pH值（三）溶液的離子強(qiáng)度（四）電滲作用（五）粒子的遷移率（六）吸附作用第9頁(yè)，共58頁(yè)，2023年，2月20日，星期一第二節(jié)常用電泳技術(shù)和電泳方法第10頁(yè)，共58頁(yè)，2023年，2月20日，星期一一、電泳技術(shù)的分類（一）根據(jù)工作原理的不同：可分為移界電泳、區(qū)帶電泳、等速電泳、等電聚焦電泳、免疫電泳等。（二）根據(jù)有無(wú)固體支持物可分為：自由電泳和支持物電泳第11頁(yè)，共58頁(yè)，2023年，2月20日，星期一（三）根據(jù)支持載體的位置或形狀可分成：水平電泳、垂直電泳、板狀電泳、柱狀電泳、U型管電泳、倒V字形電泳、毛細(xì)管電泳等。（四）根據(jù)支持物的特點(diǎn)又可分為：①無(wú)阻滯支持物電泳。②高密度的凝膠電泳。（五）根據(jù)電源控制的不同，一般可分為以下3類：

1.恒壓電泳;2.恒流電泳;3.恒功率電泳。第12頁(yè)，共58頁(yè)，2023年，2月20日，星期一

（六）根據(jù)自動(dòng)化程度的不同，可分為半自動(dòng)和全自動(dòng)型。（七）根據(jù)其功能的不同，可分為制備型、分析型、轉(zhuǎn)移型、濃縮型等。（八）根據(jù)用法的類型可分為：雙向電泳、交叉電泳、連續(xù)紙電泳、電泳－層析相結(jié)合技術(shù)等。（九）根據(jù)不同的使用目的可分為：核酸電泳、血清蛋白電泳、制備電泳、DNA測(cè)序電泳等。第13頁(yè)，共58頁(yè)，2023年，2月20日，星期一

二、電泳方法簡(jiǎn)介

（一）紙電泳指用濾紙作為支持載體的電泳方法。是最早使用的區(qū)帶電泳。

06-02平臥式電泳槽裝置示意圖第14頁(yè)，共58頁(yè)，2023年，2月20日，星期一

將濾紙條水平地架設(shè)在兩個(gè)裝有緩沖溶液的容器之間，樣品點(diǎn)于濾紙中央。當(dāng)濾紙條被緩沖液潤(rùn)濕后，再蓋上絕緣密封罩，即可由電泳電源輸入直流電壓（100V～1000V）進(jìn)行電泳。

第15頁(yè)，共58頁(yè)，2023年，2月20日，星期一（二）醋酸纖維素薄膜電泳電泳時(shí)經(jīng)過(guò)膜的預(yù)處理、加樣、電泳、染色、脫色與透明即可得到滿意的分離效果。此電泳的特點(diǎn)是分離速度快、電泳時(shí)間短、樣品用量少。因此特別適合于病理情況下微量異常蛋白的檢測(cè)。06-03血清蛋白的電泳圖譜第16頁(yè)，共58頁(yè)，2023年，2月20日，星期一

（三）凝膠電泳

由區(qū)帶電泳中派生出一種用凝膠物質(zhì)作支持物進(jìn)行電泳的方式，被稱為凝膠電泳。普通的凝膠電泳在板上進(jìn)行，以凝膠作為介質(zhì)。電泳中常用的凝膠為葡聚糖、交聯(lián)聚丙烯酰胺和瓊脂糖。它具有機(jī)械強(qiáng)度好、彈性大、透明、化學(xué)穩(wěn)定性高、無(wú)電滲作用、設(shè)備簡(jiǎn)單、樣品量小

(1～100μg）、分辨率高等優(yōu)點(diǎn)。

06-04凝膠電泳圖第17頁(yè)，共58頁(yè)，2023年，2月20日，星期一（四）等電聚焦電泳

1．等電聚焦電泳過(guò)程

一種利用有pH值梯度的介質(zhì)，分離等電點(diǎn)不同的蛋白質(zhì)的電泳技術(shù)。

06-05凈電荷與PH的關(guān)系曲線第18頁(yè)，共58頁(yè)，2023年，2月20日，星期一

將等電點(diǎn)不同的蛋白質(zhì)混合物加入有pH值梯度的凝膠介質(zhì)中，在電場(chǎng)內(nèi)經(jīng)過(guò)一段時(shí)間后，各組分將分別聚焦在各自等電點(diǎn)相應(yīng)的pH值位置上，最后，樣品的各組分在各自的等電點(diǎn)聚焦成一條清晰而穩(wěn)定的窄帶。

第19頁(yè)，共58頁(yè)，2023年，2月20日，星期一2．等電聚焦電泳的特點(diǎn)①使用兩性載體電解質(zhì)，在電極之間形成穩(wěn)定、連續(xù)、線性的pH梯度；②由于“聚焦效應(yīng)”，即使很小的樣品也能獲得清晰、鮮明的區(qū)帶界面；③電泳速度快;④分辨率高;⑤加入樣品的位置可任意選擇；⑥可用于測(cè)定蛋白質(zhì)類物質(zhì)的等電點(diǎn);⑦適用于中、大分子量（如蛋白質(zhì)、肽類、同工酶等）生物組分的分離分析。第20頁(yè)，共58頁(yè)，2023年，2月20日，星期一（五）等速電泳采用兩種不同濃度的電解質(zhì)組成，一種為前導(dǎo)電解質(zhì)，充滿整個(gè)毛細(xì)管柱；另一種為尾隨電解質(zhì)，置于一端的電泳槽中。前導(dǎo)電解質(zhì)的遷移率高于任何樣品組分，后者則低于任何樣品組分，被分離的組分按其不同的遷移率夾在中間，在強(qiáng)電場(chǎng)的作用下，各被分離組分在前導(dǎo)電解質(zhì)與尾隨電解質(zhì)之間的空隙中移動(dòng)，實(shí)現(xiàn)分離。06-06等速電泳示意圖第21頁(yè)，共58頁(yè)，2023年，2月20日，星期一（六）雙向凝膠電泳（二維電泳）第一向采用等電聚焦根據(jù)復(fù)雜的蛋白質(zhì)成分中各個(gè)蛋白質(zhì)的PI的不同，將蛋白質(zhì)進(jìn)行分離。第二向采用了十二烷基硫酸鈉一聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）就是按蛋白質(zhì)分子量的大小使其在垂直方向進(jìn)行分離。其結(jié)果不再是條帶狀，而是呈現(xiàn)為斑點(diǎn)狀。第22頁(yè)，共58頁(yè)，2023年，2月20日，星期一膠性PH9中電加解入質(zhì)了溶雙液

PH3加上電場(chǎng)后建立穩(wěn)定PH梯度蛋白質(zhì)溶液加入，建立電場(chǎng)染色后，蛋白質(zhì)因PI值不同，沿PH梯度分離開(kāi)第一向等電聚焦PI逐漸降低等電聚焦膠放在SDS－聚丙烯酰胺凝膠上

第二向SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳分子量逐漸降低PI逐漸降低

06-07雙向凝膠電泳示意圖第23頁(yè)，共58頁(yè)，2023年，2月20日，星期一

(七）免疫電泳

免疫電泳是瓊脂平板電泳和雙相免疫擴(kuò)散兩種方法的結(jié)合。將抗原樣品在瓊脂平板上先進(jìn)行電泳，使其中的各種成分因電泳遷移率的不同而彼此分開(kāi)，然后加入抗體做雙相免疫擴(kuò)散，把已分離的各抗原成分與抗體在瓊脂中擴(kuò)散而相遇，在二者比例適當(dāng)?shù)牡胤?，形成肉眼可?jiàn)的沉淀弧。第24頁(yè)，共58頁(yè)，2023年，2月20日，星期一第三節(jié)常用電泳設(shè)備的基本結(jié)構(gòu)及技術(shù)指標(biāo)第25頁(yè)，共58頁(yè)，2023年，2月20日，星期一一、常用電泳設(shè)備的基本結(jié)構(gòu)（一）電泳電源（二）電泳槽（三）附加裝置06-08平臥式電泳槽裝置示意圖第26頁(yè)，共58頁(yè)，2023年，2月20日，星期一二、電泳儀的主要技術(shù)指標(biāo)

1．輸出電壓8．連續(xù)工作時(shí)間

2．輸出電流9．保護(hù)措施

3．輸出功率10．顯示方式

4．電壓穩(wěn)定度11．定時(shí)方式

5．電流穩(wěn)定度12．電源電壓

6．功率穩(wěn)定度13．電源頻率

7．輸出組數(shù)14．功耗

第27頁(yè)，共58頁(yè)，2023年，2月20日，星期一一、毛細(xì)管電泳的相關(guān)概念

1.電場(chǎng)強(qiáng)度（ElectricFieldStrength）

2.電泳淌度(ElectrophoreticMobility)3.遷移時(shí)間（MigrationTime）

4.電泳速度(ElectrophoreticVelocity)5.電滲流（ElectroosmoticFlow，EOF）

6.焦耳熱（JouleHeating）

第28頁(yè)，共58頁(yè)，2023年，2月20日，星期一

二、毛細(xì)管電泳的基本工作原理溶液中的帶電粒子以高壓電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力，沿毛細(xì)管通道，以不同速度向與其所帶電荷相反的電極方向遷移，并依據(jù)樣品中各組分之間淌度和分配行為上的差異而實(shí)現(xiàn)分離。第29頁(yè)，共58頁(yè)，2023年，2月20日，星期一06-09毛細(xì)管電泳儀裝置示意圖

第30頁(yè)，共58頁(yè)，2023年，2月20日，星期一三、毛細(xì)管電泳的特點(diǎn)

1.高靈敏度2.高速度3.高分辨率

4.樣品少5.自動(dòng)化程度高

6.應(yīng)用范圍廣

06-10

英特雷勃——全自動(dòng)電泳儀第31頁(yè)，共58頁(yè)，2023年，2月20日，星期一四、毛細(xì)管電泳的分離模式（一）毛細(xì)管區(qū)帶電泳

它是通過(guò)在充滿電解質(zhì)溶液的毛細(xì)管中，不同質(zhì)荷比大小的組分在電場(chǎng)的作用下，依遷移速度的不同而進(jìn)行分離的。根據(jù)組分的遷移時(shí)間進(jìn)行定性，根據(jù)電泳峰的峰面積或峰高進(jìn)行定量分析。

06-11毛細(xì)血管區(qū)帶電泳原理圖第32頁(yè)，共58頁(yè)，2023年，2月20日，星期一（二）毛細(xì)管凝膠電泳將板上的凝膠移到毛細(xì)管中作支持物進(jìn)行的電泳。

凝膠具有多孔性，起類似分子篩的作用，能根據(jù)待測(cè)組分的質(zhì)荷比和分子體積的不同而進(jìn)行分離。適用于分離、測(cè)定肽類、蛋白質(zhì)、DNA類物質(zhì)的分離。

第33頁(yè)，共58頁(yè)，2023年，2月20日，星期一（三）毛細(xì)管膠束電動(dòng)色譜(MECC)

使MECC系統(tǒng)中存在兩個(gè)相：流動(dòng)的水相和起到固定相作用的膠束相。在含有膠束的流動(dòng)相中，溶質(zhì)在“水相”和“膠束相”(準(zhǔn)固定相)之間進(jìn)行分配，即使是中性溶質(zhì)，因其本身疏水性不同，在二者之間的分配也會(huì)有差異，疏水性強(qiáng)的溶質(zhì)在“膠束相”中停留時(shí)間長(zhǎng)，遷移速度就慢。反之，親水性強(qiáng)的溶質(zhì)遷移速度就快，最終中性溶質(zhì)將依其疏水性不同而得以分離。

第34頁(yè)，共58頁(yè)，2023年，2月20日，星期一06-12毛細(xì)管膠束電動(dòng)色譜原理圖第35頁(yè)，共58頁(yè)，2023年，2月20日，星期一（四）毛細(xì)管等電聚焦電泳不同等電點(diǎn)的分子分別聚集在不同的位置上，不作遷移而彼此分離，這就是等電聚焦分離過(guò)程。毛細(xì)管的等電聚焦是在毛細(xì)管內(nèi)實(shí)現(xiàn)的等電聚焦過(guò)程，具有極高的分辨率，通常可以分離等電點(diǎn)差異小于0.01pH單位的兩種蛋白質(zhì)，例如肽類、蛋白質(zhì)的分離。第36頁(yè)，共58頁(yè)，2023年，2月20日，星期一（五）毛細(xì)管等速電泳毛細(xì)管內(nèi)首先導(dǎo)入具有比被分離各組分高電泳淌度的前導(dǎo)電解質(zhì)，然后進(jìn)樣，隨后再導(dǎo)入比各分離組份低電泳淌度的尾隨電解質(zhì)，在強(qiáng)電場(chǎng)的作用下，各被分離組分在前導(dǎo)電解質(zhì)與尾隨電解質(zhì)之間的空隙中發(fā)生分離。

第37頁(yè)，共58頁(yè)，2023年，2月20日，星期一

（六）毛細(xì)管電色譜它包含了電泳和色譜兩種機(jī)制，是在毛細(xì)管中填充或在毛細(xì)管壁上鍵合（或涂壁）固定相，從而構(gòu)成毛細(xì)管色譜柱，依靠電滲流推動(dòng)流動(dòng)相，攜帶樣品遷移，根據(jù)樣品分子的質(zhì)荷比、分子尺寸及分配系數(shù)的差別而分離。

06-13

CEC-加壓毛細(xì)管電色譜儀第38頁(yè)，共58頁(yè)，2023年，2月20日，星期一五、毛細(xì)管電泳儀的基本結(jié)構(gòu)毛細(xì)管電泳儀的結(jié)構(gòu)并不復(fù)雜，主要有高壓源、毛細(xì)管柱、檢測(cè)器，以及兩個(gè)供毛細(xì)管兩端插入而又可和電源相連的緩沖液槽。

（一）毛細(xì)管柱（二）檢測(cè)器（三）毛細(xì)管電泳法的進(jìn)樣技術(shù)

06-14毛細(xì)管電泳儀第39頁(yè)，共58頁(yè)，2023年，2月20日，星期一

六、常用各種電泳儀簡(jiǎn)介（一）穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀是中壓電泳儀。其輸出電壓的調(diào)節(jié)范圍為0V～600V、輸出電流為0mA～100mA。該機(jī)工作穩(wěn)定性好、調(diào)節(jié)范圍寬，并設(shè)有完善的短路保護(hù)電路和過(guò)流保護(hù)電路，是目前國(guó)內(nèi)中、低壓電泳實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用最廣泛的電泳儀之一。

06-15穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀第40頁(yè)，共58頁(yè)，2023年，2月20日，星期一（二）全自動(dòng)醋纖膜電泳儀全自動(dòng)醋纖膜電泳儀為全自動(dòng)電泳儀，有可見(jiàn)光單系統(tǒng)，使用醋酸纖維薄膜電泳片，優(yōu)點(diǎn)為自動(dòng)化程度高。只需將樣品、試劑、電泳片放好，人員可離機(jī)完成實(shí)驗(yàn)并得到結(jié)果。

第41頁(yè)，共58頁(yè)，2023年，2月20日，星期一（三）全自動(dòng)熒光/可見(jiàn)光雙系統(tǒng)電泳儀全自動(dòng)熒光/可見(jiàn)光雙系統(tǒng)電泳儀為全自動(dòng)電泳儀，具有熒光/可見(jiàn)光雙系統(tǒng)，在使用熒光試劑項(xiàng)目如CK、LD同工酶時(shí)為全自動(dòng)。只需將樣品、試劑、瓊脂糖凝膠電泳膠片放好后，操作人員可離機(jī)完成實(shí)驗(yàn)并得到結(jié)果。

第42頁(yè)，共58頁(yè)，2023年，2月20日，星期一（四）全自動(dòng)瓊脂糖電泳儀全自動(dòng)電泳儀，有可見(jiàn)光單系統(tǒng)，使用瓊脂糖凝膠電泳膠片，優(yōu)點(diǎn)為靈敏度高，可適用于低濃度蛋白檢驗(yàn)。該儀器自動(dòng)化程度較差，當(dāng)電泳結(jié)束和染色脫色完成后，工作人員必須將電泳片由機(jī)器中取出。

第43頁(yè)，共58頁(yè)，2023年，2月20日，星期一（五）雙向電泳及雙向電泳-液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用雙向電泳是將樣品進(jìn)行電泳后，在它的直角方向再進(jìn)行一次電泳。雙向電泳第一向?yàn)榈入娋劢?，第二向?yàn)樘荻萐DS電泳。樣品經(jīng)過(guò)電荷與質(zhì)量?jī)纱畏蛛x后可得到分子的等電點(diǎn)、分子量等信息。這是目前所有電泳技術(shù)中分辨率最高，信息量最多的技術(shù)，已成為分析復(fù)雜蛋白混合物的基本工具。

第44頁(yè)，共58頁(yè)，2023年，2月20日，星期一（六）高效毛細(xì)管電泳及高效毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜聯(lián)用高效毛細(xì)管電泳是以彈性石英毛細(xì)管為分離通道，以高壓直流電場(chǎng)為推動(dòng)力，依據(jù)樣品中各組分之間淌度和分配行為上的差異而實(shí)現(xiàn)分離的電泳分離分析方法。高效毛細(xì)管電泳是一種迅速發(fā)展的分離技術(shù)，儀器簡(jiǎn)單、操作簡(jiǎn)便、分析速度快、分離效率高、操作模式多、開(kāi)發(fā)分析方法容易、實(shí)驗(yàn)成本低、消耗少、應(yīng)用范圍極廣。

第45頁(yè)，共58頁(yè)，2023年，2月20日，星期一（七）毛細(xì)管電泳芯片利用毛細(xì)管電泳芯片可以進(jìn)行DNA長(zhǎng)度分析、序列分析和基因分型等研究。是利用芯片分離熒光標(biāo)記的寡核苷酸，整個(gè)分離過(guò)程在45s之內(nèi)，而芯片的長(zhǎng)度僅為3.8cm。因?yàn)槠淇沙休d高電壓（2300V/cm）并具有較小的樣品體積，故有利于得到較好的分離效果。

第46頁(yè)，共58頁(yè)，2023年，2月20日，星期一（八）DNA測(cè)序系統(tǒng)

該系統(tǒng)利用凝膠毛細(xì)管的原理，將多道毛細(xì)管陣列設(shè)計(jì)，用四種不同的熒光染色標(biāo)記4種核苷酸，在模板上合成DNA單鏈，然后在DNA外切酶的作用下進(jìn)行堿基的連續(xù)水解和釋放，用激光識(shí)別和記錄釋放的堿基。

06-16

DNA測(cè)序系統(tǒng)第47頁(yè)，共58頁(yè)，2023年，2月20日，星期一第五節(jié)電泳儀的臨床應(yīng)用第48頁(yè)，共58頁(yè)，2023年，2月20日，星期一

一、血清蛋白電泳

新鮮血清經(jīng)醋酸纖維薄膜或瓊脂糖電泳、染色后，通?？梢?jiàn)5條帶，即清蛋白、1、2、和球蛋白。許多疾病總血清蛋白濃度和各蛋白組分的比例有所改變，通過(guò)血清蛋白電泳圖譜能幫助我們對(duì)某些疾病進(jìn)行診斷及鑒別診斷。

06-17血清蛋白電泳圖譜第49頁(yè)，共58頁(yè)，2023年，2月20日，星期一二、尿蛋白電泳臨床進(jìn)行尿蛋白電泳的主要目的是：①確定尿蛋白的來(lái)源；②了解腎臟病變的嚴(yán)重程度（選擇性蛋白尿與非選擇性蛋白尿），從而有助于診斷和預(yù)后的判斷。當(dāng)不能進(jìn)行腎活檢時(shí)，尿蛋白電泳結(jié)果能很好地協(xié)助臨床判斷腎臟的主要損害。

06-18尿蛋白電泳圖譜第50頁(yè)，共58頁(yè)，2023年，2月20