第九章核酸類藥物的分析

第九章核酸類藥物的分析第1頁，共58頁，2023年，2月20日，星期一基本要求掌握：核酸的結(jié)構(gòu)和分類；嘌呤類藥物和嘧啶類藥物鑒別、檢查、含量測定的原理熟悉：核酸的理化性質(zhì)；反義寡核苷酸藥物鑒別、檢查、含量測定的原理第2頁，共58頁，2023年，2月20日，星期一第一節(jié)概述結(jié)構(gòu)和分類理化性質(zhì)第3頁，共58頁，2023年，2月20日，星期一什么是核酸？1869年核酸最早分離自外科繃帶膿細(xì)胞的細(xì)胞核，當(dāng)時發(fā)現(xiàn)這種物質(zhì)含磷量之高超過當(dāng)時發(fā)現(xiàn)的任何一種有機(jī)物，并且含有很強(qiáng)的酸性，故得名核酸。1909年其組成被研究清楚，1944年生物功能初步澄清，在X射線衍射技術(shù)支持下1953年結(jié)構(gòu)澄清。核酸是脫氧核糖核酸（DNA）與核糖核酸（RNA）的通稱。第4頁，共58頁，2023年，2月20日，星期一核酸核苷酸磷酸核苷戊糖堿基水解一、結(jié)構(gòu)和分類第5頁，共58頁，2023年，2月20日，星期一核酸代表戊糖，對DNA而言為脫氧核糖，對RNA而言為核糖；

代表堿基

代表磷酸基核苷酸第6頁，共58頁，2023年，2月20日，星期一核苷酸磷酸堿基戊糖第7頁，共58頁，2023年，2月20日，星期一H2OH2O堿基磷酸戊糖糖苷鍵酯鍵第8頁，共58頁，2023年，2月20日，星期一核苷酸堿基連接（糖苷鍵）酯鍵（對DNA為H）1`2`3`4`5`第9頁，共58頁，2023年，2月20日，星期一戊糖核糖(inRNA)2｀－脫氧核糖(inDNA)第10頁，共58頁，2023年，2月20日，星期一核苷第11頁，共58頁，2023年，2月20日，星期一DNA&RNA第12頁，共58頁，2023年，2月20日，星期一堿基RNADNA

嘧啶環(huán)

嘌呤環(huán)尿嘧啶U胸腺嘧啶T胞嘧啶C鳥嘌呤G腺嘌呤A第13頁，共58頁，2023年，2月20日，星期一類別DNARNA基本單位脫氧核糖核苷酸核糖核苷酸核苷酸腺嘌呤脫氧核苷酸

鳥嘌呤脫氧核苷酸

胞嘧啶脫氧核苷酸

胸腺嘧啶脫氧核苷酸腺嘌呤核苷酸

鳥嘌呤核苷酸

胞嘧啶核苷酸

尿嘧啶核苷酸堿基腺嘌呤（A)

鳥嘌呤（G)

胞嘧啶（C)

胸腺嘧啶（T)腺嘌呤（A)

鳥嘌呤（G)

胞嘧啶（C)

尿嘧啶（U）五碳糖脫氧核糖核糖酸磷酸磷酸第14頁，共58頁，2023年，2月20日，星期一稀有堿基嘌呤——次黃嘌呤、1-甲基次黃嘌呤、N2、N2-二甲基鳥嘌呤。嘧啶——5-甲基胞嘧啶、5-羥甲基胞嘧啶、二氫尿嘧啶、4-巰尿嘧啶都是基本堿基的化學(xué)修飾型。第15頁，共58頁，2023年，2月20日，星期一鳥嘌呤次黃嘌呤1-甲基次黃嘌呤第16頁，共58頁，2023年，2月20日，星期一二、理化性質(zhì)（一）兩性性質(zhì)：磷酸基；堿基（通常：酸性）

pH影響堿基間氫鍵穩(wěn)定：DNApH4.0~11.0（二）水解性：微溶于水，不溶于一般的有機(jī)溶劑（三）UV：λmax=260nm蛋白質(zhì)280nmA260/A280純DNA＞1.8

純RNA應(yīng)達(dá)到2.0

混有雜蛋白比值降低第17頁，共58頁，2023年，2月20日，星期一第18頁，共58頁，2023年，2月20日，星期一（四）變性和復(fù)性1.變性：在某些理化因素影響下，DNA雙螺旋區(qū)的氫鍵斷裂和堿基堆積力破壞，有規(guī)律的雙螺旋結(jié)構(gòu)變成單鏈無規(guī)律的“線團(tuán)”，但不發(fā)生共價鍵的斷裂，這過程稱之。變性原因：高溫（一般＞75℃）、強(qiáng)氧化劑、強(qiáng)酸、堿、尿素等；機(jī)理：雙鏈間氫鍵斷開，成為兩條單鏈（DNA雙螺旋二級結(jié)構(gòu)的破壞，生物活性的喪失）特征性Tm---DNA的變性溫度82~95℃第19頁，共58頁，2023年，2月20日，星期一第20頁，共58頁，2023年，2月20日，星期一2.復(fù)性一定條件下，去除變性因素后，核酸恢復(fù)二級結(jié)構(gòu)及生物活性的現(xiàn)象；通常使用熱復(fù)性。（退火）高溫變性緩慢冷卻熱復(fù)性急速冷卻復(fù)性失敗熱復(fù)性在基因測序中被廣泛應(yīng)用第21頁，共58頁，2023年，2月20日，星期一第22頁，共58頁，2023年，2月20日，星期一（五）顏色反應(yīng)苔黑酚反應(yīng):RNA中核糖+濃HCl（濃H2SO4）→糠醛+苔黑酚→深綠色化合物（λmax=670nm）二苯胺反應(yīng):DNA中脫氧核糖+濃H2SO4→5-羥基-4-羰基戊醛+二苯胺→藍(lán)色化合物（λmax=595nm）水解后磷酸：磷酸+鉬酸→磷鉬酸+還原劑（維生素C、氯化亞錫等）→鉬藍(lán)（λmax=660nm）Fe3+脫水第23頁，共58頁，2023年，2月20日，星期一第二節(jié)嘌呤類核苷酸藥物分析嘌呤堿（腺嘌呤、鳥嘌呤）戊糖磷酸第24頁，共58頁，2023年，2月20日，星期一一、鑒別戊糖鑒別嘌呤鑒別磷酸鑒別特征吸收光譜熔點(diǎn)測定第25頁，共58頁，2023年，2月20日，星期一（一）戊糖的鑒別苔黑酚反應(yīng)（地衣酚反應(yīng)）---凡核糖均有此反應(yīng)試劑：濃鹽酸，苔黑酚試劑，三氯化鐵（催化劑）現(xiàn)象：鮮綠色二苯胺反應(yīng)DNA試劑：濃硫酸，二苯胺現(xiàn)象：藍(lán)色與間苯三酚反應(yīng)（核苷酸中的戊糖）現(xiàn)象：玫瑰紅色第26頁，共58頁，2023年，2月20日，星期一（二）嘌呤的鑒別+氨制硝酸銀→白色↓→紅棕色（遇光）（嘌呤堿基的特殊鑒別反應(yīng)）第27頁，共58頁，2023年，2月20日，星期一（三）磷酸的鑒別有機(jī)磷→無機(jī)磷+鉬酸→磷鉬酸+還原劑→鉬藍(lán)第28頁，共58頁，2023年，2月20日，星期一（四）特征吸收光譜UV：嘌呤環(huán)，嘧啶環(huán)IR第29頁，共58頁，2023年，2月20日，星期一（五）熔點(diǎn)測定第30頁，共58頁，2023年，2月20日，星期一二、檢查一般檢查酸度，水分，無機(jī)鹽，有機(jī)物，溶液的顏色和澄清度蛋白質(zhì)檢查磺基水楊酸溶液有關(guān)物質(zhì)紙色譜，薄層色譜，電泳，熒光檢查第31頁，共58頁，2023年，2月20日，星期一三、含量測定紫外-可見分光光度法現(xiàn)在國家已經(jīng)批準(zhǔn)的嘌呤類核苷酸藥物一般都用此法測定含量HPLC第32頁，共58頁，2023年，2月20日，星期一四、實例分析肌苷ATP第33頁，共58頁，2023年，2月20日，星期一（一）肌苷的質(zhì)量分析1.結(jié)構(gòu)：C10H12N4O5268.23本品為9β-D-核糖次黃嘌呤。按干燥品計算，含C10H12N4O5應(yīng)為98.0～102.0％。2.性狀：本品為白色結(jié)晶性粉末；無臭，味微苦。本品在水中略溶，在氯仿或乙醇中不溶，在稀鹽酸和氫氧化鈉溶液中易溶。

第34頁，共58頁，2023年，2月20日，星期一3.鑒別取0.01％供試品溶液適量,加等體積的3,5-二羥基甲苯溶液(取3，5-二羥基甲苯與三氯化鐵各0.1g，加鹽酸使成100ml)，混勻，在水浴中加熱約10分鐘，即顯綠色。---苔黑酚反應(yīng)取本品1％水溶液，加氨制硝酸銀試液數(shù)滴，即產(chǎn)生白色膠狀沉淀。---嘌呤堿基

取含量測定項下的溶液,照分光光度法測定，在248nm的波長處有最大吸收，在222nm的波長處有最小吸收。色譜圖IR

第35頁，共58頁，2023年，2月20日，星期一4.檢查

溶液的澄清度與顏色（溶液的透光率）取本品0.5g，加水50ml使溶解，照分光光度法在430nm的波長處測定透光率，不得低于98.0％(供注射用)。干燥失重取本品，在105℃干燥至恒重，減失重量不得過1.0熾灼殘渣不得過0.1％(供注射用),或不得過0.2％(供口服用重金屬取本品1.0g，依法檢查含重金屬不得過百萬分之十。次黃嘌呤

①精密稱取本品0.5g，置50ml量瓶中,加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，照紙色譜法試驗，吸取上述溶10μl，點(diǎn)于3×25cm色譜濾紙上，照上行法，以水為展開劑，展開約20cm處，取出晾干，置紫外光燈(254nm)下檢視，不得出現(xiàn)雜質(zhì)斑點(diǎn)。

②HPLC第36頁，共58頁，2023年，2月20日，星期一5.含量測定

1）UV法：取本品，精密稱定，加水制成每1ml中約含10μg的溶液，照分光光度法在248nm的波長處測定吸收度，按C10H12N4O5的吸收系數(shù)（E1％1cm）為460計算。2）HPLC第37頁，共58頁，2023年，2月20日，星期一6.作用與用途輔酶類藥。有改善機(jī)體代謝作用。用于各種類型肝臟疾患、心臟疾患、白細(xì)胞減少癥、血小板減少癥、中心視網(wǎng)膜炎、視神經(jīng)萎縮等。7.用法與用量口服，一次0.2～0.6g一日0.6～1.8g8.貯藏遮光，密閉保存。9.制劑(1)肌苷口服溶液(2)肌苷片(3)肌苷注射液(4)肌苷膠囊(5)肌苷顆粒劑

第38頁，共58頁，2023年，2月20日，星期一（二）三磷酸腺苷二鈉（ATP）的質(zhì)量分析

拼音名：Sanlinsuanxiangan‘erna

英文名：AdenosineDisodiumTriphosphate

C10H14N5Na2O13P3551.151.結(jié)構(gòu)：本品為腺嘌呤核苷-5’-三磷酸酯二鈉鹽三水化合物。按干燥品計算，含C10H14N5Na2O13P3不得少于90.0％。

第39頁，共58頁，2023年，2月20日，星期一2.性狀：本品為白色或類白色粉末或結(jié)晶塊狀物；無臭，味咸；有引濕性。本品在水中易溶，在乙醇、氯仿或乙醚中幾乎不溶。第40頁，共58頁，2023年，2月20日，星期一3.鑒別（1）取本品20mg,加稀硝酸2ml溶解后，加鉬酸銨試液1ml，加熱，放冷，即析出黃色沉淀。---磷酸鹽（2）取本品約10mg，加鹽酸溶液(1→2)5ml溶解后，加間苯三酚10mg，混勻，置水浴中加熱約1分鐘，即顯玫瑰紅色。--戊糖（3）苔黑酚反應(yīng)—戊糖（3）UV（4）IR（5）本品的水溶液顯鈉鹽的鑒別反應(yīng)第41頁，共58頁，2023年，2月20日，星期一4.檢查酸度溶液的澄清度與顏色蛋白質(zhì)取本品20mg，加水2ml溶解后，滴加30％磺基水楊酸溶液0.5ml，不得發(fā)生渾濁。有關(guān)物質(zhì)水分氯化物鐵鹽重金屬熱原

第42頁，共58頁，2023年，2月20日，星期一5.含量測定

（1）總核苷酸：UV（2）三磷酸腺苷二鈉的重量比：HPLC（3）色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗（4）測定法第43頁，共58頁，2023年，2月20日，星期一6.作用與用途

輔酶類藥。用于進(jìn)行性肌萎縮、腦溢血后遺癥、心功能不全、心肌疾患及肝炎等。7.注意

緩慢注射。心肌硬塞和腦溢血在發(fā)病期患者慎用。8.貯藏

有陰涼干燥處密封保存。有效期１年。9.制劑

(1)三磷酸腺苷二鈉注射液(2)注射用三磷酸腺苷二鈉

第44頁，共58頁，2023年，2月20日，星期一第三節(jié)嘧啶類核苷酸藥物的分析第45頁，共58頁，2023年，2月20日，星期一一、鑒別

該類藥物的化學(xué)組成和性質(zhì)本與嘌呤類相似，唯一區(qū)別在于堿基的不同。一元堿第46頁，共58頁，2023年，2月20日，星期一二、檢查常規(guī)檢查其他核苷酸：TLC第47頁，共58頁，2023年，2月20日，星期一三、含量測定UV法電位滴定法第48頁，共58頁，2023年，2月20日，星期一四、實例分析---氟尿嘧啶1.通用名:氟尿嘧啶

化學(xué)名:5-氟-2,4(1H,3H)-嘧啶二酮分子式:C4H3FN2O2

分子量:130.08熔點(diǎn):278-286℃

水溶性:12.2g/L20℃含氟尿嘧啶（C4H3FN202）應(yīng)為標(biāo)示量的93.0-107.0%第49頁，共58頁，2023年，2月20日，星期一2.性狀：白色或類白色結(jié)晶或結(jié)晶性粉末。在水中略溶，乙醇中微溶，三氯甲烷中幾乎不溶，在稀鹽酸或氫氧化鈉溶液中溶解。第50頁，共58頁，2023年，2月20日，星期一3.鑒別（1）+溴，溴褪色；+氫氧化鋇，紫色↓（2）三氧化鉻的飽和硫酸溶液，均勻涂于管壁本品，不能再均勻涂于管壁（3）λmax=265nmλmin=232nm（4）IR第51頁，共58頁，2023年，2月20日，星期一4.檢查：氯化物硫酸鹽含氟量干燥失重重金屬第52頁，共58頁，2023年，2月20日，星期一5.含量測定：取本品適量，加0.1mol/L鹽酸溶液制成每1mL中約含10μg的溶液，照紫外-可見分光光度法，在265nm波長處，測定吸光度，按C4H3FN2O2的吸收系數(shù)（E1%1cm）