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文檔簡介
沙門菌的檢驗技術集大第1頁/共44頁國內外沙門菌檢測方法(傳統(tǒng)方法)
國家標準(GB4789.4-2010:食品微生物學檢驗沙門氏菌檢驗)行業(yè)標準(SN0170-1992出口食品沙門氏菌屬(包括亞利桑那菌)檢驗方法)FDA(Food&DrugAdministration)
AOAC(AssociationofOfficialAnalyticalChemists)
FSIS(FOODSAFETYANDINSPECTIONSERVICE)
ISO加拿大官方食品微生物分析方法
第2頁/共44頁標本采集增菌培養(yǎng)腸道選擇性培養(yǎng)基分離培養(yǎng)革蘭染色生化反應取可疑菌落血清學鑒定食品中沙門氏菌檢測的基本程序第3頁/共44頁沙門菌常用生化試驗三糖鐵(TSI)尿素酶試驗陰性(黃)陽性(紅)第4頁/共44頁沙門菌常用生化試驗吲哚試驗陰性(液面黃)陽性(液面紅)
VP試驗陽性(紅色)陰性(不變)第5頁/共44頁沙門菌常用生化試驗賴氨酸脫羧酶試驗對照陽性(紫)陰性(黃)丙二酸鹽試驗陽性(蘭)陰性(不變)第6頁/共44頁ONPG試驗陽性(黃)空白沙門菌常用生化試驗第7頁/共44頁凍肉、蛋品、乳品及其他加工食品鮮肉、鮮蛋、鮮乳或其他未經加工的食品前增菌法25g+BPW225mL36℃±1℃一般4h,干蛋品18h~24h10mL+MM(或TTB)100mL10mL+SC100mL直接增菌法25g+滅菌生理鹽水25mL檢樣勻液25mL+MM(或TTB)100mL檢樣勻液25mL
+SC100mLBSDHL(或HE、WS、SS)TSI(排除A/AH2S-結果),靛基質,尿素,KCN,賴氨酸沙門氏菌血清學試驗甘露醇山梨醇H2S+靛+尿-KCN-賴+H2S-靛-尿-KCN-賴+/-非如左述的各種反應結果沙門氏菌血清學試驗ONPG-沙門氏菌非沙門氏菌42℃18h~24h36℃±1℃18h~24h42℃18h~24h36℃±1℃18h~24h36℃±1℃40h~48h36℃±1℃18h~24h
微生物學檢驗沙門氏菌檢驗中華人民共和國國家標準GB/T4789.4-2010第8頁/共44頁前增菌:使食品加工過程中受傷的沙門菌細胞恢復活力未經加工過的食品,檢驗前不需要前增菌前增菌:25克(加工食品)+225毫升緩沖蛋白胨水
37度培養(yǎng)4小時(干蛋品18—24小時)。(一)前增菌第9頁/共44頁選擇性增菌含選擇性抑制劑1:1稀釋液而不是1:10,提高檢出率增菌:移取10毫升接種于100mL的增菌液中。氯化鎂孔雀綠(MM)或四硫酸鈉煌綠(TTB)、亞硒酸鹽胱氨酸(SC)。一種增菌劑不可能適合所有的沙門菌,所以,要同時使用兩種以上的培養(yǎng)基增菌第10頁/共44頁(二)分離培養(yǎng)最適生長溫度為35~37℃,最適pH值為6.8~7.8。選擇性瓊脂平板:BS培養(yǎng)基(亞硫酸鉍瓊脂)、DHL瓊脂、HE(海克頓腸內瓊脂培養(yǎng)基)或WS瓊脂、SS瓊脂。BS最適合,但為提高檢出率,需要使用一個BS培養(yǎng)基,同時再用另一個DHL、HE、SS或WS第11頁/共44頁選擇瓊脂平板沙門氏菌Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ沙門氏菌Ⅲ(即亞利桑那菌)亞硫酸瓊脂(BS瓊脂)產硫化氫菌落為黑色有金屬光澤、棕褐色或灰色,菌落周圍培養(yǎng)基可呈黑色或棕色;有些菌株不產生硫化氫,形成灰綠色的菌落,周圍培養(yǎng)基不變。黑色有金屬光澤DHL瓊脂無色半透明,產硫化氫菌落中心帶黑色或幾乎全黑色。乳糖遲緩陽性或陰性的菌株與沙門氏菌Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ相同;乳糖陽性的菌株為粉紅色,中心帶黑色。HE瓊脂WS瓊脂藍綠色或藍色,多數(shù)菌株產硫化氫,菌落中心黑色或幾乎全黑色。乳糖陽性的菌株為黃色,中心黑色或幾乎全黑色;乳糖遲緩陽性或陰性的菌株為藍綠色或藍色,中心黑色或幾乎全黑色。SS瓊脂
無色半透明,產硫化氫菌株有的菌落中心帶黑色,但不如以上培養(yǎng)基明顯.乳糖遲緩陽性或陰性的菌株,與沙門氏菌Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ相同;乳糖陽性的菌株為粉紅色,中心黑色,但中心無黑色形成時與大腸艾希氏菌不能區(qū)分.第12頁/共44頁SS平板分離腸道致病菌的強選擇培養(yǎng)基SS平板組成基礎培養(yǎng)基+乳糖+抑制劑(膽鹽、枸櫞酸鈉、0.1%煌綠水溶液)+指示劑(中性紅)SS平板上腸道細菌的生長現(xiàn)象腸道致病菌:不分解乳糖,菌落無色或淡黃色腸道非致病菌:分解乳糖產酸,菌落呈紅色腸道菌選擇性培養(yǎng)基分離培養(yǎng)第13頁/共44頁分離培養(yǎng)取增菌液劃線接種于SS瓊脂平板,于37℃培養(yǎng)18~24h,觀察菌落特征腸道致病菌在SS平板上的菌落特征沙門氏菌形成不發(fā)酵乳糖菌落無色透明,光滑濕潤、邊緣整齊菌落第14頁/共44頁發(fā)酵乳糖菌落(大腸桿菌菌落)不發(fā)酵乳糖菌落(腸道致病菌菌落)SS培養(yǎng)基平板分離第15頁/共44頁革蘭染色沙門氏菌:革蘭陰性桿菌
第16頁/共44頁(三)五項生化試驗1、三糖鐵瓊脂試驗2、靛基質試驗(吲哚試驗)3、尿素酶試驗4、氰化鉀試驗(KCN)5、賴氨酸脫羧酶試驗第17頁/共44頁1、三糖鐵瓊脂(TSI)成分
蛋白胨20.0g
牛肉膏3.0g
乳糖
10.0g
蔗糖
10.0g
葡萄糖
1.0g
硫酸亞鐵銨(含6個結晶水)0.5g
酚紅
0.025g或5g/L溶液5mL
氯化鈉5.0g
硫代硫酸鈉0.5g
瓊脂12.0g
蒸餾水1000.0mL
第18頁/共44頁TSI生化原理
斜面部分暴露于空氣中,為有氧環(huán)境。而下部與空氣隔絕是相對厭氧的環(huán)境。因此TSI時,最重要的是斜面部分和管下部瓊脂的長度,兩者均為3cm,以保證兩部分相對應的有氧或厭氧環(huán)境。第19頁/共44頁測試時使用接種針先穿刺至底部,而后于斜面作劃線接種,經培養(yǎng)18-24小時后,依情況判斷糖類發(fā)酵情形。第20頁/共44頁觀察結果:有三種類型
A.非發(fā)酵型:無碳氫化合物發(fā)酵,所以無酸產生,斜面上瓊脂的肽降解產物是堿性物質導致斜面變紅。這種類型的細菌稱為非發(fā)酵型。
第21頁/共44頁B.非乳糖發(fā)酵型:如果接種的是發(fā)酵葡萄糖不發(fā)酵乳糖的細菌,培養(yǎng)基內僅有0.1%葡萄糖可以產酸。開始階段,培養(yǎng)8-12h時,產生的酸足以引起斜面和底部顏色變成黃色。在接下來的時間里,葡萄糖被完全消耗,斜面部分的細菌在有氧條件下開始氧化降解氨基酸,產生的胺類很快就中和斜面上存在的酸;到18-24h,整個斜面又轉換成堿性PH,顏色有變成紅色。深部(厭氧區(qū)域),氨基酸降解不足以中和形成的酸,培養(yǎng)基仍為黃色。
第22頁/共44頁C.乳糖(蔗糖)發(fā)酵型
第23頁/共44頁三糖鐵(TSI)試驗腸道桿菌科為革蘭氏陰性菌,可發(fā)酵葡萄糖產酸。利用糖類發(fā)酵之不同與硫化氫產生與否,加以區(qū)分。三糖鐵瓊脂斜面培養(yǎng)基含有1﹪乳糖及蔗糖與0.1﹪葡萄糖作為發(fā)酵基質,且以酚紅作為酸堿指示劑,如培養(yǎng)基由橘紅轉為黃色,表示有糖類發(fā)酵第24頁/共44頁三糖鐵(TSI)瓊脂試驗本試驗可同時觀察乳糖和蔗糖發(fā)酵產酸或產酸產氣(變黃);產生硫化氫(變黑)。葡萄糖被分解產酸可使斜面先變黃,但因量少,生成的少量酸,因接觸空氣而氧化,加之細菌利用培養(yǎng)基中含氮物質,生成堿性產物,故使斜面后來又變紅,底部由于是在厭氧狀態(tài)下,酸類不被氧化,所以仍保持黃色。a.uninoculated
b.littlechange/alkaline/-/-
c.alkaline/acid/-/+
d.acid/acid/+/+
e.acid/acid/+/-
slantcolor/buttcolor/gasproduction/hydrogensulfideproduction第25頁/共44頁第26頁/共44頁制好的培養(yǎng)基對照管斜面紅色,底面黃色培養(yǎng)基全黃色斜面、底部黃色,并產生H2S斜面紅色,底部黑色,產生H2S底面黃色,并產生CO2第27頁/共44頁(1)斜面堿性(紅色-)底部酸性(黃色+)產氣或不產氣(產氣時會造成瓊脂裂開):表示僅葡萄糖發(fā)酵。因微生物優(yōu)先分解葡萄糖產酸,使培養(yǎng)基變黃,但因葡萄糖含量低,于斜面產生之微量酸立即氧化而呈堿性反應,同時培養(yǎng)基中的蛋白質也隨之利用而產堿,培養(yǎng)基底部則因氧張力較小,且微生物生長較慢,故仍維持酸性反應。(2)斜面酸性(黃色+)底部酸性(黃色+)產氣或不產氣:表示除了葡萄糖發(fā)酵外,乳糖與(或)蔗糖也發(fā)酵。由于乳糖與蔗糖濃度高,經繼續(xù)發(fā)酵,可維持培養(yǎng)基斜面與底部保持酸性反應。第28頁/共44頁(3)斜面堿性(紅色-)底部堿性(紅色-)或無變化(橘紅色):表示無糖類發(fā)酵。而蛋白質則于有氧或厭氧條件下進行代謝產生氨,而使培養(yǎng)基呈堿性反應,如有氧與厭氧均發(fā)生蛋白質分解,則斜面與底部均呈堿性反應。
為使結果準確,應于接種培養(yǎng)18-24小時內觀察結果,以確保糖類尚未用盡,且蛋白質分解之堿性終產物尚未產生。第29頁/共44頁培養(yǎng)基變黑(4)三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基中亦含有硫代硫酸鈉若微生物有硫化氫產生,會與亞鐵離子作用生成不溶性硫化亞鐵之沉淀,進而使培養(yǎng)基變黑。第30頁/共44頁腸桿菌科各屬在三糖鐵瓊脂內的反應結果
斜面底層產氣硫化氫可能的菌屬和種-++/-+沙門氏菌屬、弗勞地氏檸檬酸桿菌、變形桿菌屬、緩慢愛德華氏菌+++/-+沙門氏菌Ⅲ、弗勞地氏檸檬酸桿菌、普通變形桿菌-++-沙門氏菌屬、大腸埃希氏菌、蜂窩哈夫尼亞菌、摩根氏菌,普羅菲登斯菌屬-+--傷寒沙門氏菌,雞沙門氏菌、志賀氏菌屬、大腸埃希氏菌、蜂窩哈夫尼亞菌、摩根氏菌,普羅菲登斯菌屬+++/--大腸埃希氏菌、腸桿菌屬、克雷伯氏菌屬、沙雷氏菌屬、弗勞地氏檸檬酸桿菌注:+陽性;-陰性;+/-多數(shù)陽性,少數(shù)陰性第31頁/共44頁腸桿菌科各屬生化反應初步鑒別表
反應序號硫化氫(H2S)靛基質pH7.2尿素氰化鉀(KCN)賴氨酸脫羧酶判定結果A1+---+沙門氏菌屬A2++--+沙門氏菌屬(少見)緩慢愛德華氏菌A3+-++-弗勞地氏檸檬酸桿菌、奇異變形桿菌A4++++-普通變形桿菌B1--------+-沙門氏菌屬、大腸埃希氏菌、甲型副傷寒沙門氏菌大腸埃希氏菌、志賀氏菌屬B2--++---+-大腸埃希氏菌大腸埃希氏菌、志賀氏菌屬B3----+/-++++-克雷伯氏菌族各屬陰溝腸桿菌、弗勞地氏檸檬酸桿菌B4-++/-+-摩根氏菌,普羅菲登斯菌屬注1:三糖鐵瓊脂底層均產酸,不產氣者可排除;斜面產酸與產氣與否均不限。注2:KCN和賴氨酸可選作其中一項,但不能判定結果時,仍需補做另一項。注3:+表示陽性;-表示陰性;+/-表示多數(shù)陽性,少數(shù)陰性。第32頁/共44頁2、靛基質(吲哚)試驗陰性(液面黃)陽性(液面玫瑰紅)第33頁/共44頁3、尿素酶試驗陰性(黃)陽性(紅)第34頁/共44頁5、賴氨酸脫羧酶試驗對照陽性(紫)陰性(黃)
4、氰化鉀試驗“渾濁”為“+”第35頁/共44頁ONPG試驗陽性(黃)空白丙二酸鹽試驗陽性(蘭)陰性(不變)第36頁/共44頁沙門氏菌O多價血清凝集試驗
左為陽性
右為陰性對照3/3血清學試驗結果第37頁/共44頁結果報告凡血清學鑒定與生化反應均符合沙門氏菌者報告:×××食品25g檢出沙門氏菌反之則報告:×××食品25g未檢出沙門氏菌第38頁/共44頁
出口食品沙門氏菌屬(包括亞利桑那菌)檢驗方法
肉類、蛋品緩沖胨水(BPW)四硫磺酸鹽煌綠(TTB)亞硒酸鹽胱氨酸(SC)37℃4hor20~24h直接選擇性增菌亞硒酸鹽胱氨酸(SC)四硫磺酸鹽煌綠(TTB)37℃24±2h
BS&DHL(亞利桑那菌瓊脂)
前增菌37℃24~48hTSI&賴氨酸脫羧酶TSI&尿素酶37℃24~48h生化試驗血清學試驗(“O”抗原,“Vi”抗原)42℃20±2h37℃24~48h結果判定檢驗檢疫行業(yè)標準SN0170-92第39頁/共44頁
樣品(20類)25g225mL乳糖肉湯(LB)or胰酪胨大豆肉湯(TSB)or煌綠溶液(BG)or通用前增菌肉湯(UPB)or營養(yǎng)肉湯(NB)or再造脫脂奶粉or四硫酸鹽煌綠(TT)pH6.8±0.224±2h35℃RVTT
43±0.2℃or35±2.0℃24±2h
24±2h42±0.2℃BS&XLD&HE24±2h35℃TSI&LIA非沙門菌沙門菌非沙門菌LIA+LIA-TSIK/ALIA-TSIA/A&尿素酶,H抗原(多價H抗血清或Spicer-Edwardsflagellar(H)test),賴氨酸脫羧酶,酚紅衛(wèi)矛醇肉湯,色氨酸肉湯(KCN,丙二酸鹽,吲哚),O抗原酚紅乳糖肉湯,酚紅蔗糖肉湯,MR-VP,西蒙氏檸檬酸鹽5種商業(yè)生化鑒定系統(tǒng)(API20E,EnterotubeII,
EnterobacteriaceaeII,MICRO-ID,orVitekGNI)&O抗原&H抗原細菌學分析手冊(FDA/BAM)第五章沙門菌屬第40頁/共44頁肉、禽和蛋品中沙門菌的分離和鑒定USDA/FSISMLG4.02樣品BPWorBPW(含結晶紫)35±1℃20-24hBGS&DMLIAorXLT442±0.5℃22~24h0.5±0.05mL+10mLTT0.1±0.02mL+10mLmRV42±0.5℃22~24h35±1℃18~24h&48hTSI&LIA血清學試驗商業(yè)生化試劑盒或自動鑒定系統(tǒng)or傳統(tǒng)生化鑒定(AOACOfficialMethod967.27or"EdwardsandEwing'sIdentificationofEnterobacteriacea
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