(3.6)-藥敏試驗衛(wèi)生微生物檢驗實驗方法與技能

抗菌藥物敏感性試驗【實驗?zāi)康摹空莆占埰瑪U散法（K－B法）的原理、操作方法等、結(jié)果判斷、意義及質(zhì)量控制；熟悉肉湯稀釋法抗生素敏感性試驗的原理、操作方法、結(jié)果判斷及意義等；了解藥敏試驗的質(zhì)量控制?！緦嶒瀮?nèi)容】紙片擴散法肉湯稀釋法2023/4/154【實驗器材與試劑】菌種：金黃色葡萄球菌、大腸桿菌藥物：青霉素、慶大霉素紙片和藥液培養(yǎng)基：MH肉湯和MH平板其他：無菌10ml試管、無菌移液管、無菌棉簽、試管架、酒精燈等一、紙片擴散法（K-B法）1.原理：含有定量抗菌藥物的紙片貼在已接種測試菌的瓊脂平板上，紙片所含的藥物吸取瓊脂中的水分溶解后便不斷向紙片周圍區(qū)域擴散，形成遞減的梯度濃度。在紙片周圍抑菌濃度范圍內(nèi)的細菌生長被抑制，形成透明的抑菌圈。抑菌圈的大小反映測試菌對測定藥物的敏感程度，并與該藥對測試菌的最低抑制濃度（minimalinhibitoryconcentration，MIC）呈負相關(guān)，即抑菌圈愈大，MIC愈小。抑菌圈

含藥紙片

2.培養(yǎng)基和抗菌藥物紙片抗菌藥物紙片：選擇直徑為6.35mm，厚1mm，吸水量為20μl的專用藥敏紙片。培養(yǎng)基：水解酪蛋白（M-H）瓊脂，傾注直徑為90mm的平板，厚度4±0.5mm。①平板制備：將在約56℃恒溫的無菌M-H瓊脂傾注直徑為90mm的平板，其厚度4mm。②菌液準備：從平板上無菌挑取4～5個菌落，置無菌生理鹽水，混勻制成菌懸液，校正濁度為0.5麥氏濁度。3.實驗方法比濁法調(diào)整菌液濃度③涂布接種：用無菌棉簽浸入細菌懸液中，將拭子在試管上壁輕輕擠壓以擠去過多的菌液。棉簽在三個方向均勻抹瓊脂表面（每次轉(zhuǎn)60°）使菌液均勻分布，最后沿平板內(nèi)緣涂抹一周。④貼藥敏紙片：平板室溫放置3～10分鐘干燥。用無菌鑷子或紙片分配器將抗菌紙片粘貼于M-H瓊脂的表面，一旦紙片貼上，不能移動；各抗菌紙片中心距離應(yīng)＞24mm，紙片距平板內(nèi)緣應(yīng)＞15mm。注意根據(jù)菌株挑選相應(yīng)的抗菌紙片腸桿菌科：氨芐西林、阿米卡星、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢噻肟、環(huán)丙沙星、亞胺培南、氨曲南、慶大霉素；銅綠假單胞菌：頭孢他啶、慶大霉素、哌拉西林、阿米卡星、環(huán)丙沙星、頭孢吡肟、亞胺培南；葡萄球菌屬：頭孢西丁、青霉素、紅霉素、萬古霉素、環(huán)丙沙星、慶大霉素、利福平。2023/4/1512⑤孵育：35℃培養(yǎng)16～18h，對苯唑西林和萬古霉素等敏感應(yīng)培養(yǎng)24h。⑥質(zhì)量控制：標準菌株的抑菌圈直徑應(yīng)在預(yù)期范圍內(nèi)。如超出范圍，視為失控不發(fā)報告，須查找原因，予以糾正。2023/4/15142023/4/1515標準菌株的抑菌圈預(yù)期值范圍抗菌藥物紙片含藥量抑菌圈直徑(mm）大腸埃希菌ATCC25922金黃色葡萄球菌ATCC25923銅綠假單胞菌ATCC27853阿米卡星30μg19~2620~2618~26慶大霉素10μg19~2619~2717~23青霉素10IU—26~37—氨芐西林10μg16~2227~35—哌拉西林100μg24~30—25~33頭孢噻肟30μg29~3525~3118~22亞胺培南10μg26~32—20~28紅霉素15μg—22~30—環(huán)丙沙星5μg30~4022~3025~33

量取抑菌環(huán)直徑（mm)，根據(jù)CLSI（clinicalandlaboratorystandardsinstitute）標準，報告細菌對該抗生素：

敏感(susceptible,S):使用常規(guī)推薦劑量治療時，在感染部位所達到藥物濃度可抑制分離菌株生長。

耐藥(resistant,R)：使用常規(guī)推薦劑量治療時，在感染部位所達到藥物濃度不能抑制分離菌株生長。

中介(intermediate,I)：最小抑菌濃度接近藥物的血液或組織濃度，療效低于敏感菌；可作為敏感和耐藥的緩沖區(qū)，減少實驗條件失控導致結(jié)果解釋偏差。4.結(jié)果判斷和報告

金黃色葡萄球菌抗菌藥物敏感性試驗評價結(jié)果抗菌藥物紙片含藥量

抑菌圈直徑(mm)

相應(yīng)MIC值(μg/ml)耐藥中介敏感耐藥中介敏感青霉素10IU≤28-≥29≥0.25-≤0.12萬古霉素30μg---≥164~8≤2慶大霉素10μg≤1213～14≥15≥168≤4紅霉素15μg≤1314～22≥23≥81~4≤0.5克林霉素2μg≤1415～20≥21≥41~2≤0.5環(huán)丙沙星5μg≤1516~20≥21≥42≤1

大腸埃希菌抗菌藥物敏感性試驗評價結(jié)果抗菌藥物紙片含藥量

抑菌圈直徑(mm)

相應(yīng)MIC值(μg/ml)耐藥中介敏感耐藥中介敏感氨芐西林10IU≤1314~16≥17≥3216≤8哌拉西林100μg≤1718~20≥21≥12832~64≤16慶大霉素10μg≤1213～14≥15≥168≤4頭孢噻肟15μg≤1314～22≥23≥81~4≤0.5環(huán)丙沙星5μg≤1516～20≥21≥42≤1亞胺培南10μg≤1920~22≥23≥42≤1二、肉湯稀釋法1.原理以水解酪蛋白（MH）液體培養(yǎng)基將抗生素做不同濃度的稀釋，然后種入待檢細菌，定量測定抗菌藥物對被測菌的最低抑菌濃度（MIC）或最低殺菌濃度（MBC）。①試管編號：取26支試管排成兩排（測試菌排，質(zhì)控菌排），每排13支編號。另取3支試管，分別標記上“肉湯對照”、“測試菌生長對照”和“質(zhì)控菌生長對照”等。2.方法（宏量肉湯稀釋法）2.方法（宏量肉湯稀釋法）②抗菌藥物稀釋：按照常用抗菌藥物容積稀釋法稀釋藥物。將藥物原液稀釋到待測最高濃度，如128μg/ml。除每排第一支試管外，每支試管內(nèi)加M-H肉湯2ml。每排的第一、二管分別加入2ml抗菌藥物，依次對倍稀釋到第13管，各管中抗菌藥物的終濃度依次為128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.12、0.06和0.03μg/ml。2023/4/15231234567891011121312345678910111213肉湯對照測試生長對照質(zhì)控生長對照肉湯藥液棄掉2ml棄掉2ml測試菌質(zhì)控菌③菌液制備：生理鹽水校正測試菌和質(zhì)控菌至0.5麥氏比濁標準，再用MH肉湯稀釋到107cfu/ml；④菌液接種：用微量加樣器取0.1ml稀釋菌液由低到高加于各排試管中，其最終的接種量為5×105cfu/ml。測試菌排、測試菌生長對照管加測試菌液；質(zhì)控菌排、質(zhì)控菌生長對照管加質(zhì)控菌液。⑤孵育：35℃培養(yǎng)16~20h，觀察結(jié)果。2.方法（宏量肉湯稀釋法）測試菌（或質(zhì)控菌）不出現(xiàn)肉眼可見生長的最低藥物濃度為該藥對測試菌（質(zhì)控菌）的MIC。根據(jù)MIC判定耐藥、敏感和中介。3.結(jié)果（宏量肉湯稀釋法）培養(yǎng)基質(zhì)量、接種細菌的菌量、抗菌藥物的配制、孵育溫度和觀察時間、操作是否規(guī)范等均能影響本試驗的結(jié)果。為保證結(jié)果的可靠性，需同時采用相應(yīng)標準菌株同時進行藥敏試驗作為質(zhì)量控制的方式。4.注意事項【